一种血浆层粘连蛋白提取方法
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体提供了一种血浆层粘连蛋白提取方法，主要由以下步骤组成：制备备用血浆、加入硫酸铵离心、盐水溶解离心所得沉淀物得溶解液、微孔滤膜过滤所述溶解液得滤液、超滤离心管离心所述滤液得层粘连蛋白液，冷冻干燥所述层粘连蛋白液得血浆层粘连蛋白终产品。达到的有益效果是：首次采用动物血为原料制备层粘连蛋白，原料来源丰富，克服了传统层粘连蛋白制备过程中原材料短缺的问题；且提取原料为新鲜动物血液，价廉易得，极大的降低了层粘连蛋白的生产成本。可以将动物血浆中极其微量的层粘连蛋白浓缩提纯得到高浓度、高纯度的层粘连蛋白。提取步骤简洁易行，易控制易实现，适于工业上大规模推广使用。
【专利说明】
一种血浆层粘连蛋白提取方法
技术领域
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种血浆层粘连蛋白提取方法。
【背景技术】
[0002]层粘连蛋白(Laminin，LN)是一种细胞外间质中的非胶原糖蛋白，分子量约900kD。层黏连蛋白是机体生长发育必须的物质，广泛参与基膜的构建及细胞的黏附、生长、增殖、迀移和分化，并且与肝纤维化、银肩病、宫颈癌、肿瘤等多种疾病的发生和发展密切相关。多项研究表明层粘连蛋白在促进血管形成及抑制肿瘤扩散等疾病治疗中具有重要医用开发价值。
[0003]目前，我国层粘连蛋白制备方法仍然处于实验室阶段，主要是从小鼠肉瘤细胞中，经组织分离、层析等方法制备，工艺复杂、成本高、原料来源稀缺，不适合工业化大规模生产，大大限制了层粘连蛋白的大规模应用，严重阻碍了层粘连蛋白在生物医药领域的研究和开发。同时，现有的层粘连蛋白制备及分离提取方法获得的层粘连蛋白的低纯度和低收率进一步限制了其应用。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种工艺简洁、操作步骤易控制易实现、适合大规模生产制备的血浆层粘连蛋白提取方法。同时本发明的血浆层粘连蛋白提取方法还具有原料来源广泛，原料成本低，提取获得的层粘连蛋白纯度高收率高等优点。
[0005]本发明所采用的技术方案为:
[0006]本发明的血浆层粘连蛋白提取方法包括以下步骤:
[0007]SI制备备用血浆；
[0008]S2向所述备用血浆中加入硫酸铵，搅匀后静置，静置完毕后离心取沉淀物；
[0009]S3使用盐水溶解所述沉淀物得溶解液，使用微孔滤膜过滤所述溶解液，取滤液；
[0010]S4使用超滤离心管离心S3所得滤液，得层粘连蛋白液，冷冻干燥得血浆层粘连蛋白广品。
[0011]本发明提供的血浆层粘连蛋白提取方法所用原材料为新鲜动物血液，原料来源广泛，且价廉易得。完全改变了传统技术中使用小鼠肉瘤细胞作为层粘连蛋白提取原料存在的原料来源苛刻和原料培养费用高昂等缺陷。同时，传统的层粘连蛋白提取过程需要进行多次的层析纯化操作，极大的提高了层粘连蛋白的提取成本以及操作难度，由于其限制，无法在工业上大规模推广应用。而本发明提供的血浆层粘连蛋白提取方法步骤简洁、步骤控制条件易实现、适于大规模工业推广生产应用，且通过本发明的血浆层粘连蛋白提取方法提取获得的层粘连蛋白还具有纯度高，收率高的优点，通过高效液相色谱检测纯度可达95%以上。
[0012]优选改进，SI中备用血浆通过以下步骤制备获得:采集新鲜动物血液，加入抗凝剂，离心分离血球和血浆，收集血浆置于-20 V下冷冻得冷冻血浆;将所得冷冻血浆快速融化后进行离心或过滤，取清液即得备用血浆;所述快速融化具体为:在4°C?10°C条件下，融化20min?40min。对收集到的血浆进行快速冷冻，然后再快速升温，目的是分了分离出一部分杂质，以获得纯度更高的层粘连蛋白。
[0013]优选改进，将所得冷冻血浆快速融化后，在4°C?10°C条件下，进行离心，离心时间为10?20分钟，离心转速为3000?5000r/min。进一步优选改进，所述抗凝剂为质量分数4%的柠檬酸三钠水溶液，所述新鲜动物血液与所述柠檬酸三钠水溶液的重量份比例为1: 7?10，分离血球和血楽的离心操作中:离心时间为10?20min，离心转速为3000?5000r/min。在本段优选方案的控制参数条件下能够在尽量分离出杂质的同时，减少层粘连蛋白的流失，进而提尚目标广品的收率和纯度。
[0014]优选改进，S2中向所述备用血浆中加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为20?25%，静置2小时以上之后再进行离心取沉淀物操作。体系中硫酸铵的不同饱和度下，析出的蛋白类型不同。本发明控制下的体系硫酸铵饱和度，能够在尽量减少层粘连蛋白析出流失的同时，尽可能促使层粘连蛋白之外的其他蛋白的析出，进一步保证最终产品质量和收率。
[0015]优选改进，S3中所述盐水为生理盐水，所述生理盐水与所述沉淀物的重量之比为3
?5:1 ο
[0016]优选改进，S3中所述微孔滤膜的孔径为0.22μπι。进一步优选改进，S4中所述超滤离心管的截留分子量为300kD。通过多层次的其他蛋白截留拦截过滤和离心，进一步保证了终产品的纯度质量。
[0017]优选改进，S4中使用超滤离心管离心时:离心时间为5?15min，离心转速为4000?5000r/mino
[0018]优选改进，S4中先将所述层粘连蛋白液中层粘连蛋白浓度稀释至0.05mg/ml后，再进行冷冻干燥操作。先稀释层粘连蛋白液，再进行冷冻干燥，可以避免层粘连蛋白析出时带出过多杂质，进一步保障终产品层粘连蛋白的纯度。
[0019]综上所述，本发明的血浆层粘连蛋白提取方法的有益效果如下:
[0020]其一，首次采用动物血为原料制备层粘连蛋白，原料来源丰富，克服了传统层粘连蛋白制备过程中原材料短缺的问题;且提取原料为新鲜动物血液，价廉易得，极大的降低了层粘连蛋白的生产成本。
[0021 ]其二，提取步骤简洁易行，易控制易实现，适于工业上大规模推广使用。
[0022]其三，提取过程中杂质及其他蛋白去除率高，层粘连蛋白流失量少，进而获得的终产品层粘连蛋白纯度和收率都较高。具体的，本发明可以将动物血浆中极其微量的层粘连蛋白浓缩提纯得到高浓度、高纯度的层粘连蛋白，经放射免疫分析法(RIA)测定，S4中所得层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量可达0.2?lmg/ml，经高效液相色谱分析终产品层粘连蛋白的纯度可达95%以上。
[0023]其四，采用了冷冻离心、盐析和超滤离心管离心等技术相结合的方法，即可提高投料量，也可以节省昂贵的层析介质和生产周期，成本低廉，适合大规模生产。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
[0025]实施例1:
[0026]本实施例提供一种血浆层粘连蛋白的提取方法，步骤如下:
[0027]采集新鲜动物血液，加入所取新鲜动物血液7倍重量的抗凝剂柠檬酸三钠水溶液，所述柠檬酸三钠水溶液中柠檬酸三钠的质量分数为4%。于转速3000r/min下离心20min分离血球和血浆，收集血浆置于-20 0C下冷冻得冷冻血浆。将所得冷冻血浆在4 0C条件下，进行40min快速融化后，保持4°C离心20min，离心转速为3000r/min，离心完毕取清液即得备用血浆。
[0028]向备用血浆中添加硫酸铵直至血浆中硫酸铵的饱和度为20%，静置2小时后离心取沉淀物。使用所述沉淀物3倍重量的生理盐水溶解所述沉淀物得溶解液。使用孔径为0.22μπι的微孔滤膜过滤所述溶解液，取滤液。使用截留分子量为300kD的超滤离心管，于4000r/min转速下离心所得滤液，离心15min，即得层粘连蛋白液，放射免疫分析法(RIA)测定，所得层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量为0.2mg/ml。冷冻干燥所得层粘连蛋白液即得终产品层粘连蛋白，经高效液相色谱分析终产品层粘连蛋白的纯度为95.2%。
[0029]实施例2:
[0030]本实施例提供一种血浆层粘连蛋白的提取方法，步骤如下:
[0031 ]采集新鲜动物血液，加入所取新鲜动物血液10倍重量的抗凝剂柠檬酸三钠水溶液，所述柠檬酸三钠水溶液中柠檬酸三钠的质量分数为4%。于转速5000r/min下离心1min分离血球和血浆，收集血浆置于-200C下冷冻得冷冻血浆。将所得冷冻血浆在10°C条件下，进行20min快速融化后，保持10°C离心10111；[11，离心转速为50001'/1]1；[11，离心完毕取清液即得备用血浆。
[0032]向备用血浆中添加硫酸铵直至血浆中硫酸铵的饱和度为25%，静置2.5小时后离心取沉淀物。使用所述沉淀物5倍重量的生理盐水溶解所述沉淀物得溶解液。使用孔径为
0.22μπι的微孔滤膜过滤所述溶解液，取滤液。使用截留分子量为300kD的超滤离心管，于5000r/min转速下离心所得滤液，离心5min，S卩得层粘连蛋白液，放射免疫分析法(RIA)测定，所得层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量为0.8mg/ml。将所得层粘连蛋白液稀释至0.05mg/ml，然后冷冻干燥稀释后的层粘连蛋白液即得终产品层粘连蛋白，经高效液相色谱分析终产品层粘连蛋白的纯度为96.7%。
[0033]实施例3:
[0034]本实施例提供一种血浆层粘连蛋白的提取方法，步骤如下:
[0035]采集新鲜动物血液，加入所取新鲜动物血液8倍重量的抗凝剂柠檬酸三钠水溶液，所述柠檬酸三钠水溶液中柠檬酸三钠的质量分数为4%。于转速4200r/min下离心13min分离血球和血浆，收集血浆置于-20°C下冷冻得冷冻血浆。将所得冷冻血浆在7 °C条件下，进行28min快速融化后，保持7°C离心15min，离心转速为3500r/min，离心完毕取清液即得备用血浆。
[0036]向备用血浆中添加硫酸铵直至血浆中硫酸铵的饱和度为22%，静置4小时后离心取沉淀物。使用所述沉淀物4倍重量的生理盐水溶解所述沉淀物得溶解液。使用孔径为0.22μπι的微孔滤膜过滤所述溶解液，取滤液。使用截留分子量为300kD的超滤离心管，于4500r/min转速下离心所得滤液，离心lOmin，即得层粘连蛋白液，放射免疫分析法(RIA)测定，所得层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量为lmg/ml ο将所得层粘连蛋白液稀释至0.05mg/ml，然后冷冻干燥稀释后的层粘连蛋白液即得终产品层粘连蛋白，经高效液相色谱分析终产品层粘连蛋白的纯度为95.1%。
[0037]实施例4:
[0038]本实施例提供一种血浆层粘连蛋白的提取方法，步骤如下:
[0039]采集新鲜动物血液，加入所取新鲜动物血液7倍重量的抗凝剂柠檬酸三钠水溶液，所述柠檬酸三钠水溶液中柠檬酸三钠的质量分数为4%。于转速4000r/min下离心Ilmin分离血球和血浆，收集血浆置于-20°C下冷冻得冷冻血浆。将所得冷冻血浆在6 °C条件下，进行25min快速融化后，保持6°C过滤取清液即得备用血浆。
[0040]向备用血浆中添加硫酸铵直至血浆中硫酸铵的饱和度为21%，静置3小时后离心取沉淀物。使用所述沉淀物3倍重量的生理盐水溶解所述沉淀物得溶解液。使用孔径为0.22μπι的微孔滤膜过滤所述溶解液，取滤液。使用截留分子量为300kD的超滤离心管，于4800r/min转速下离心所得滤液，离心13min，即得层粘连蛋白液，放射免疫分析法(RIA)测定，所得层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量为0.9mg/ml。将所得层粘连蛋白液稀释至0.05mg/ml，然后冷冻干燥稀释后的层粘连蛋白液即得终产品层粘连蛋白，经高效液相色谱分析终产品层粘连蛋白的纯度为97.3%。
[0041]本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其细节上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于，包括如下步骤: Si制备备用血浆； S2向所述备用血浆中加入硫酸铵，搅匀后静置，静置完毕后离心取沉淀物； S3使用盐水溶解所述沉淀物得溶解液，使用微孔滤膜过滤所述溶解液，取滤液； S4使用超滤离心管离心S3所得滤液，得层粘连蛋白液，冷冻干燥得血浆层粘连蛋白产品O2.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于:SI中备用血浆通过以下步骤制备获得:采集新鲜动物血液，加入抗凝剂，离心分离血球和血浆，收集血浆置于-20°C下冷冻得冷冻血浆;将所得冷冻血浆快速融化后进行离心或过滤，取清液即得备用血浆；所述快速融化具体为:在4°C?10°C条件下，融化20min?40min。3.根据权利要求2所述的血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于:将所得冷冻血浆快速融化后，在4°C?10°C条件下，进行离心，离心时间为10?20分钟，离心转速为3000?5000r/min04.根据权利要求3所述的血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于:所述抗凝剂为质量分数4%的柠檬酸三钠水溶液，所述新鲜动物血液与所述柠檬酸三钠水溶液的重量份比例为1:7?10，分离血球和血浆的离心操作中:离心时间为10?20min，离心转速为3000?5000r/min05.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于:S2中向所述备用血浆中加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为20?25%，静置2小时以上之后再进行离心取沉淀物操作。6.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于:S3中所述盐水为生理盐水，所述生理盐水与所述沉淀物的重量之比为3?5:1。7.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于:S3中所述微孔滤膜的孔径为0.22μηι。8.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于:S4中所述超滤离心管的截留分子量为300kD。9.根据权利要求8所述的血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于:S4中使用超滤离心管离心时:离心时间为5?15min，离心转速为4000?5000r/min。10.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法，其特征在于:S4中先将所述层粘连蛋白液中层粘连蛋白浓度稀释至0.05mg/ml后，再进行冷冻干燥操作。
【文档编号】C07K14/78GK105820235SQ201610251820
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】王丛飞
【申请人】王丛飞