化学梯度的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺互参考
[0002] 本申请依据35 U.S.C. § 119(e)要求2013年2月19日提交的序号为61/766, 366 的美国临时专利申请的优先权，所述临时专利申请在此以其全部内容引为参考。
[0003] 关于联邦咨助的研究或开发的声明
[0004] 本发明根据国立卫生研究院/国立神经系统紊乱和中风研究所（National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke) (NIH/NINDS)授予的许可1R21NS072955-01A1，由政府支持完成。
技术领域
[0005] 本发明涉及用于形成化学梯度的装置和方法，以及包含化学梯度的组合物，并特 别涉及用于药物投送和其他生物医学应用的化学梯度。
【背景技术】
[0006] 在损伤发展和之后的期间，神经细胞响应生物分子的梯度迀移并朝着适当的靶细 胞和器官伸长它们的轴突，所述生物分子或是通过附着于所述细胞或细胞外基质（ECM)、或 是通过分泌到细胞外液中而引导轴突再生（趋化性）。在一些情况下，趋化性的可溶分子由 特殊的细胞分泌，并从释放位点通过扩散和对流形成梯度。对这种梯度的细胞响应可受到 所述生物分子的性质、和ECM(其可包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白）的物理特性例 如基质孔度和硬度的影响。在发展中的周围神经系统（PNS)中，神经营养因子（NTF)例如 神经生长因子（NGF)、神经营养蛋白3(NT-3)和脑源性神经营养因子（BDNF)的梯度由远端 靶细胞和直接轴突伸长和脊髓腹侧运动神经元（VMN)的靶识别、以及背根神经节（DRG)中 的感觉神经元来建立。在成人PNS中，感觉神经元的传出分支在损伤后自发地恢复皮肤和 肌肉靶标的神经支配，但传入轴突不能进入成人脊髓的有害环境，除非受到诱发的NGF表 达的诱使。此外，通过表达再建立NTF梯度的适当的基因表达，可显著减少在再生期间由损 伤的VMN和DGR神经元产生的导向误差。
[0007] 不幸的是，在神经修复中生成化学梯度例如NTF梯度和使用化学梯度仍然是极度 富有挑战性的。例如，一些现有技术未能提供目标分子信号的持续释放和/或缺乏ECM支 持。其他技术缺乏提供通常在体内存在的非瞬时和/或生理相关性化学梯度的能力。另 外，以前一些用于生成化学梯度的方法只适用于体外短期研究和/或存在与注射病毒载体 有关的风险。因此，需要改进的提供化学梯度的装置和方法。
【发明内容】
[0008] 本公开涉及通过建立高度可调的化学梯度例如NTF或NGF梯度而可用于组织修复 的方法、装置和组合物，所述化学梯度设计成通过充有ECM的多腔（multiluminal)或多通 道水凝胶来引导轴突生长。为此，本公开涉及锚定于水凝胶微通道壁的新的盘卷聚合结构， 所述结构用于建立渗透所述腔胶原蛋白的高度和可预测调节的可控和持续NTF释放梯度， 其还稳定扩散因子的梯度并提供用于轴突伸长的容许和可预测地调节和控制/可控的生 长底物。确定数学模型来描述在这种复杂基质中的NTF扩散和确定随时间的腔NTF浓度， 利用DRG体外神经生长试验提供沿着所述三维NGF梯度的趋化性神经再生证据。这种方法 被认为在受引导的组织修复上证明有用，以及其他用途。
[0009] 本公开的方面涉及装置，其包含至少一个管道，所述管道具有第一端和第二端与 布置在所述管道中并从第一端向第二端延伸的一个或多个微通道。纤维盘卷在至少一个微 通道的外部周围，其中所述纤维包含活性剂，所述活性剂可操作地扩散到所述微通道的内 部。在另一个方面，所述管道包含导管例如Micro-Renathane植入管。
[0010] 在又一个方面，所述微通道布置在所述管道中的基质材料内。此外，所述基质材料 可包括琼脂糖凝胶、乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA)、聚乳酸（PLA)、聚己内酯、聚氨酯、聚酯、 聚碳酸酯、胶原蛋白、聚四氟乙烯（PTFE)、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)、乙烯-乙酸乙烯酯共 聚物（EVA)、聚二甲基硅氧烷（PDMS)、聚醚-聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET)、聚砜 (PS)、聚环氧乙烷（PE0)或聚乙二醇（PEG)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物（PE0-PP0)、聚 烯烃例如聚乙烯（PE)或聚丙烯（PP)，或一种或多种前述项的组合。
[0011] 在又一个方面，所述基质材料包含琼脂糖凝胶，所述琼脂糖凝胶基于琼脂糖凝胶 的总重量，包含约1. 5重量％和2. 5重量％之间的琼脂糖。此外，多个微通道优选布置在所 述管道中，和多个纤维盘卷在多个微通道的外部周围。
[0012] 在又一个方面，所述多个纤维各自盘卷在不同的微通道外部周围，并且至少两个 所述盘卷纤维包含不同的活性剂、不同量的活性剂、和/或不同的节距（pitch)。
[0013] 在又一个方面，所述纤维包含聚合材料或由其形成，所述聚合材料例如乳酸-乙 醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯或其组合。纤维也可包含其他材料或由其形成。另外，在另一 个方面，所述聚合物是生物降解型。
[0014] 在又一种变化形式中，所述纤维以各向同性构造和/或各向异性构造盘卷在微通 道的外部周围。
[0015] 在另一个方面，所述活性剂包含药物和/或生长因子。
[0016] 本公开的方面还涉及形成化学梯度的方法，所述方法包括在生物室中布置本文中 描述的任何装置。其他方面考虑了所述生物室包含神经管道。优选地，所述活性剂梯度包 括药物梯度和/或生长因子梯度。
[0017] 本公开的方面也涉及包含盘卷聚合材料的组合物，所述聚合材料包含活性剂，当 所述聚合材料布置在生物室中时，所述活性剂可操作地从所述聚合材料中扩散出来。在另 一个方面，所述聚合材料优选包括乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯、或其组合。在又一 个方面，所述聚合材料是生物降解型的。在又一个方面，所述活性剂包含药物和/或生长因 子。在又一个方面，所述生物室包括神经管道。
[0018] 本公开的其他变化形式还涉及组合物，和包含组合物的装置，所述组合物包含含 有第一浓度的活性剂的第一凝胶和含有第二浓度的活性剂的第二凝胶，其中所述第一凝胶 和第二凝胶间隔排列以提供所述活性剂的浓度梯度。
[0019] 在另一个方面，所述组合物包含含有第三浓度的活性剂的第三凝胶，所述第一凝 胶、第二凝胶和第三凝胶间隔排列、或取向，以提供包含所述活性剂浓度梯度的梯度区。在 又一个方面，所述梯度区包含线性浓度梯度。此外，所述第一、第二和第三凝胶被排列成提 供多个线性浓度梯度，或所述第一、第二和第三凝胶间隔排列或取向以在所述梯度区之外 还提供非梯度区。
[0020] 在另一种变化形式中，本公开涉及上面描述的组合物，其中所述第一凝胶和/或 第二凝胶包含琼脂糖凝胶、乳酸_乙醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯、或其组合和所述活性剂 包含药物或生长因子。
[0021] 此外，本公开涉及装置，其包含管道和布置在所述管道中的任何前述组合物。
[0022] 另外，本公开涉及形成化学或活性剂浓度梯度的方法，所述方法包括在生物室、例 如神经管道中布置任何前述装置并且其中所述化学或活性剂浓度梯度包括药物梯度或生 长因子梯度。
[0023] 此外，本公开涉及形成化学或活性剂梯度的方法，所述方法包括在生物室、例如神 经管道中布置任何前述组合物并且其中所述化学或活性剂浓度梯度包括药物梯度或生长 因子梯度。
【附图说明】
[0024] 图1A-B示出了包含微通道的管道的透视图。
[0025] 图1C示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的透视图。
[0026] 图2示出了根据本文中描述的一种实施方式，引导神经细胞进入装置的混合神经 群体的示意性透视图。
[0027] 图3示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的示意性透视图。
[0028] 图4A-E示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的各种组件的照片。
[0029] 图5A示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的示意性透视图。
[0030] 图5B-D示出了由图5A的装置提供的化学梯度的显微镜图像。
[0031] 图6示出了与图5B-D的化学梯度对应的平均细胞突长度。
[0032] 图7A示出了根据本文中描述的一种实施方式的化学梯度的示意性透视图。
[0033] 图7B-C示出了包含多个微通道的管道的透视图。
[0034] 图7D示出了根据本文中描述的一种实施方式，包含多个微通道的装置的透视图。
[0035] 图7E示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的透视图，和所述装置对应 的密度测定图谱。
[0036] 图7Fi_iii示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的制造方法。
[0037] 图7G-I是图7E中显示的形态的显微镜图像。
[0038] 图8A示出了根据本文中描述的方法的一些实施方式形成的化学梯度的一系列显 微镜图像。
[0039] 图8B示出了图8A的化学梯度曲线。
[0040] 图9A-C示出了根据本文中描述的一种实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞 的显微镜图像。
[0041] 图10A-I示出了根据本文中描述的一些实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞 的显微镜图像。
[0042] 图10J示出了对应于图10A-I的图形。
[0043] 图10K示出了对应于图10A-J的校准曲线。
[0044] 图11示出了根据本文中描述的化学梯度的一些实施方式，分子的释放轮廓线图 形。
[0045] 图12示出了根据本文中描述的化学梯度的一些实施方式，分子的释放轮廓线图 形。
[0046] 图13A-D示出了根据本文中描述的一些实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞 的显微镜图像。
[0047] 图13E-F示出了图13A-D对应的图形。
[0048] 图14A-B示出了根据本文中描述的一些实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞 的显微镜图像。
[0049] 图14C示出了图14A-B对应的图形。
[0050] 图15A-B示出了根据本文中描述的一些实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞 的显微镜图像。
[0051] 图15C-D示出了图15A-B对应的图形。
[0052] 图16示出了根据本文中描述的方法的一种实施方式，轴突生长的转向角比率的 图形。
[0053] 图17示出了根据本文中描述的一种实施方式的组合物的示意性透视图。
[0054] 图18不出了根据本文中描述的一种实施方式的组合物的扫描电子显微镜（SEM) 图像。
【具体实施方式】
[0055] 通过参考以下详细说明、实施例和图，可以更容易地了解本文中描述的方面。然 而，本文中描述的要素、装置和方法不限于在详细描述、实施例和图中介绍的具体实施方 式。应该认识到，所公开的实施方式仅仅说明本发明的原理。许多的