拉动所述PC12细胞/ ECM混合物进入所述浇铸的水凝胶微通道的腔内。所述生长因子盘卷纤维在所述腔中完好 并接近接触PC12细胞。所述细胞培养物饲以RPMI-1640培养基（Sigma，St.Louis，M0)并 在37°C和5%C02培养箱中保持72小时。
[0091] 为了显现所述微通道中分化的PC12细胞，所述凝胶在4%多聚甲醛（PFA)中固定 并处理，用于免疫荧光。用封闭溶液（0. 1 %Triton-PBS/1 %正常血清）清洗所述凝胶后，所 述样品分别用俄勒闪绿鬼笔环肽和T0-PR03碘化物（Invitrogen，Carlsbad，CA)作为细胞 骨架和核标记进行温育。所述染色利用Zeiss共焦显微镜（ZeissAxioplan2LSM510META) 评价。所述染色利用常规和焚光显微术以及z-协议栈（z-stack) 3D图象重构来评价和分 析所述多腔水凝胶中的微血管网络。在3种不同的盘卷密度（无，低和高）中PC-12细胞 突起长度的定量利用AxiovisionLE软件（CarlZeiss，Axiocam，4. 7. 2 版）和ZeissLSM ImageBrowser(4. 2. 0?I2 版）完成。
[0092] 所有数据值表示为均值土平均标准误差。数据利用Prism4软件（GraphPad SoftwareInc.)通过参数student-t检验或通过非参数student-t检验继以MannWhitney 事后评价进行分析。P< 0. 05的值被认为有统计学显著性。
[0093] 图5A-D证明在负载了NGF的微通道中的PC-12细胞的生物活性。图5A是试验设 计的示意图。负载了NGF的盘卷纤维52放入神经管道50中。PC-12细胞然后负载在所述 通道内部。图5B是显微镜图像，显示了位于所述卷远侧的PC-12细胞（在微通道中的区域 相当于图5A中的"方框B")。这些细胞在接种后24小时没有显示任何突起。图5C是显微 镜图像，显示了位于所述卷中部的PC-12细胞（在微通道中的区域相当于图5A中的"方框 C"）。这些细胞在24小时中分化并表现出一些突起。图f5D是显微镜图像，显示了位于具 有最高的盘卷圈数的高密度通道区域中的PC-12细胞（在微通道中的区域相当于图5A中 的"方框D"）。24小时后，该区中细胞分化并表现出长突起。在没有NGF负载卷的区域中， 所述腔内部的细胞图像外观球形并且没有显示突起。然而，在有负载NGF的盘卷纤维的区 域中接种的细胞完全分化并具有长突起。有趣的是，这些突起在有高密度卷的区域中更长。 这证实了有更高圈数的区域将释放更多NGF，因此具有较高的生长因子浓度。为了量化所 显现的图像，测量了等于或长于细胞体的所有突起的长度。所述数据的定量分析显示，在图 5B-D中描绘的三个"方框"区域B-D中细胞突起的长度之间有显著差异（参见图6)。P值 等于或小于0. 05被认为有显著性。近侧区域（p〈0. 002;n= 6 ;71.33+/-12. 17ym)和中部 (35. 66+/-12. 69ym)与远侧（1.4+/-1. 14ym)相比，突起的平均长度明显较高。
[0094] 图6图示了在微通道中负载NGF的盘卷纤维中PC12细胞的生物活性。负载NGF的 纤维卷放入神经管道中。通过测量在无任何NGF的区域（图5A中"方框B"）、有低密度盘 卷圈数的区域（图5A中"方框C"）和有高密度盘卷圈数的区域（图5A中"方框D"）中的 细胞突起，确定PC-12细胞的生物活性。细胞在接种后24小时成像并利用ImageJ测量突 起长度。如图6中所示，所述卷的远侧负载的PC12细胞（图5A中方框B)在接种后72小 时没有显示任何突起。位于所述卷中部（图5A中方框C)的PC12细胞在24小时内分化并 具有一些突起。72小时后，位于所述通道具有最多的负载NGF盘卷圈数的高密度区域（图 5A中显示的图像中的方框D)中的PC12细胞分化并具有长突起。位于所述卷中部（图5A 图像中方框C)的PC12细胞在24小时内分化并具有一些突起。所述不同区域中细胞突起 的长度有显著差异（*)P〈〇.〇5和（#)p〈0.005。
[0095] 实施例4
[0096] 形成化学梯度的方法
[0097] 从乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA)卷的生长因子释放利用有限元分析以两种构造 (各向同性和各向异性）的多介质模型建模。所述模型利用2.4GHzIntelRCore?2Quad处 理器计算机以C0MS0LMultiphysics完成并构成分布在直径250微米和长度1厘米的圆筒 内部的直径250微米和厚度1微米的环。所述第一种构造（各向同性）由均等分布的20 个环组成。所述第二种构造（各向异性）由排列的3段组成，所述段排列了相互距离不同 的环。所述段由250、500和1000微米的段组成。从所述负载的PLGA卷的释放轮廓利用针 对从可降解聚合物释放的改良形式的Korsmeyer-Peppas方程建模。所述卷的初始条件取 作1微克的均等负荷。所述模拟持续28天的时间段。
[0098] 在所述数学模型中，所述填充管道被认为具有琼脂糖凝胶的扩散系数。所述通道 的直径被认为是250ym。所述数学分析的结果显示，各向同性的盘卷纤维在通道中产生均 匀的浓度，所述浓度保持28天。所述管道的两端被认为是开放的。因此，在近端和远端中， 由于从所述腔中出去的扩散通量，观察到生长因子浓度降低。然而，所述近端和远端的浓度 变化与中部相比是微不足道的（小于所述中部浓度的15%)并且所述管道结构倾向保持所 述均匀的浓度。所述盘卷纤维的各向异性构造早在5天时就产生梯度并倾向于长时间保持 所述梯度（至少28天）。从所述远端和近端出去的生长因子通量没有影响所述梯度的建 立。在整个研究期间（从第5天至28天），所述梯度的陡度基本上保持相同。注意了所述 盘卷纤维的各向同性设计的数学推断。所述各向同性设计中均匀分布的梯度在所述微通道 中将保持至少28天。利用Comsol，所述微通道中的预计浓度分布的图像证实了在各向异性 构造中持续梯度至少建立了 28天。
[0099] 实施例5
[0100] 形成化学梯度的方法
[0101] 腔内NGF-胶原蛋白梯度方案
[0102] 本文中描述的方法通过在胶原蛋白填充的多腔神经导向装置中产生分子梯度，实 现了持续的生长因子释放，如图7A-G和图8A-B中所示。为了达到这个目的，盘卷在钛棒上 的NGF释放纤维被插入在透明多腔基质（TMM)浇铸装置中制成的开口中。所述TMM由正方 形塑料开放框架组成，所述框架在两端处有插入所述钛棒的孔。随后在所述金属棒上添加 1. 5%琼脂糖，将所述NGF释放型聚合卷有效包埋在琼脂糖中。
[0103] 神经导向装置（NG)在管壁中结合了NTF梯度（图7A)或使用NTF-洗脱型微粒 (7C)。然而，当前的多腔NG设计缺乏梯度NTF释放。本研究利用盘卷的聚合纤维锚定到具 有腔胶原蛋白的水凝胶微通道的壁上来解决这种局限（图7D)。图7E是盘卷在金属棒上的 负载了Cy3IgG的PLGA纤维的照片。荧光成像和密度测定法说明了所生成的梯度。图7F是 透明多腔基质（TMM)浇铸装置的示意图，显示了纤维卷部署。在琼脂糖聚合后从所述TMM除 去所述金属棒将所述卷锚定在微通道的壁上，同时用胶原蛋白填充所述腔（图7Fi-iii)。 在图7G中，共焦图像显示了在所述TMM中部署的聚合卷（红色）与胶原蛋白填料（绿色）。 比例尺=100ym。
[0104] 更具体地说，如图7A中所示，胶原蛋白管道70a包含以梯度提供的NGF。图7B显 示了管道70b，其包含含有NGF的多腔或微通道72b。图7C显示了管道70c，其包含含有NGF 微粒74的多腔或微通道72c。在这种变化形式中，微通道72c各自包含基本上均等的NGF 浓度。图7D显示了包含多腔或微通道72d的管道70d，所述多腔或微通道含有负载NGF的 盘卷纤维76,建立梯度。
[0105] 根据TMM方法，胶原蛋白77然后添加到所述TMM的"负载"孔中（图7Fi)。在去 除所述纤维成型金属（钛）棒78后，NGF释放纤维卷保留在所生成的浇铸在琼脂糖79中 的微通道的壁上，并且通过它们的去除而产生的负压基本上同时地用胶原蛋白77填充这 种微通道的腔空间（参见图9Fii-iii)。这种方法设计用于将包裹在所述聚合纤维中的分 子例如Cy3-IgG、BSA或NGF随时间持续释放到胶原蛋白填充的微通道中，提供容许的和趋 化性的神经生长调节。图7G是显微照片，显示了除去金属棒的卷76。图7H和71是盘卷纤 维76的显微照相，胶原蛋白77被引入所述盘卷纤维76的圆周内并填充它。
[0106] 从盘卷聚合纤维的生长因子释放
[0107] 两种纤维源用来制造30um盘卷纤维：乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA85:15 ;135KD) 和ELUTE?生物降解型聚二氧六环酮。PLGA纤维通过湿纺丝法制作。简单说，在二氯甲烷 (DCM;Sigma_Aldrich，St.Louis，MO)中制备 20%PLGA溶液，利用注射栗（1.8mL/hr)分配 到循环异丙醇凝固浴上，在旋转卷轴上收集所生成的纤维（8. 5m/min)。干燥的PLGA盘卷纤 维与NGF(10yg/mL;Invitrogen，Carlsbad，CA)、BSA(20mg/mL;Sigma_Aldrich，St.Louis， MO)或花青染料(Cy3 ;5yg/mL;JacksonImmunoResearchLab,Inc. ,WestGrove,PA) 一起温育过夜。大多数研究使用ELUTE?生物降解型聚二氧六环酮纤维，由TissueGen Inc，Dallas，TX定制制作以包裹NGF并将它在金属钦棒（0. 25mmxl7mm;SmallParts， Logansport，IN)上或是相等（均等的）或是在3. 33mm纵向区域上以15、25和40圈差异 隔开地盘卷80次（10-100ng/mL梯度）。纤维在室温干燥并储存在-20°C直到使用。
[0108] 导电聚合物聚吡咯负载红色染料。如图8A所示，经电刺激后，所述染料在120分 钟的时间中从所述纤维释放并建立梯度。图8B显示了SI和SII区域的定量，证实了梯度 形成。
[0109] PC12细胞培养
[0110] 具有含BSA或NGF的盘卷PLGA纤维的金属棒部署在如上所述的TMM浇铸装置 中。在无菌条件下，所述浇铸装置放在细胞培养皿中的玻璃载片上并使用1.5%超纯琼脂 糖覆盖所述纤维。聚合后，悬浮在调聚的（atelomeric)鸡胶原蛋白（85%I型，15%II类 型；Millipore)中的嗜铬细胞瘤细胞（PC12 ;lxl06/mL)通过所述产生的负压负载在浇铸的 250ym0D水凝胶微通道上。所述TMM细胞培养物在补充有10%HS、5%FBS和1 %青/链 霉素的RPMI-1640培养基（HycloneSH30027. 02)中培养72小时并保持在37°C和5%C02 下。研究结束时，所述细胞培养物用PBS彻底清洗并染色。PC12细胞的单独的常规培养物 在正常培养皿中以lxlO6的铺板密度培养并暴露于10-100ng/mLNGF范围以确定它们的生 物响应（参见图9A-C)。利用PC12