二浓度的所述活性剂的第二梯度材料或基质，其中所 述第一基质和第二基质间隔排列以提供所述活性剂的浓度梯度。所述活性剂可包括本文中 描述的任何活性剂，例如药物或生长因子。此外，在一些变化形式中，本文中描述的组合物 还包含含有第三浓度的所述活性剂的第三梯度材料或基质，并且所述第一基质、第二基质 和第三基质间隔排列、或取向，以提供包含所述活性剂浓度梯度的梯度区。在一些情况下， 所述梯度区可包含线性浓度梯度。另外，在一些实施方式中，排列本文中描述的组合物的第 一、第二和第三基质以提供多个浓度梯度，包括多个线性浓度梯度。此外，在一些情况下，可 排列所述第一、第二和第三基质，以在本文中描述的梯度区之外还提供非梯度区。本文中描 述的组合物的梯度材料或基质可包含不会与本发明的目的不相容的任何材料或由其形成。 例如，在一些情况下，基质是包含聚合材料、包括生物降解型聚合材料或由其形成的凝胶。 在一些实施方式中，凝胶包括水凝胶。在一些情况下，凝胶包含琼脂糖凝胶、乳酸_乙醇酸 共聚物、聚乳酸、己内酯或其组合，或由其形成。其他凝胶或非凝胶材料也可以用作基质以 建立目标梯度。
[0073] 另外，如本文中描述，组合物可布置在管道中来提供装置。因此，在另一个方面，本 文中描述了装置，其中所述装置包含管道与布置在所述管道中的本文中描述的组合物。
[0074] 在又一个方面，本文中描述了形成化学梯度的方法，在一些变化形式中，其与一些 其他方法相比，可以提供一个或多个优点。例如，在一些情况下，本文中描述的方法可以以 模块化和/或可调的方式提供化学梯度。还有，在一些情况下，本文中描述的方法可提供在 体内表现出持续、非瞬时化学梯度的化学梯度。在一些变化形式中，本文中描述的形成化学 梯度的方法包括在生物室中布置本文中描述的装置和/或组合物。在一些情况下，所述化 学梯度包括活性剂浓度梯度，例如药物梯度或生长因子梯度。此外，在一些情况下，所述生 物室包括神经管。另外，本文中描述的任何装置和/或组合物可以用于本文描述的方法。
[0075] 本文中描述的一些实施方式在下面的非限制性实施例中进一步说明。
[0076] 实施例1
[0077] 包含单个微通道的装置
[0078] 在一种变化形式中，制作植入式装置，其提供化学梯度并使得能够在微通道内定 位投送特定的生长因子，轴突将穿过所述微通道生长。出于对这种变化形式的比较目的，图 1A示出了在导管10内的腔或微通道11。微通道11包含活性剂（未显示）以提供期望的 化学势的至少一个瞬时区。然而，在所述微通道长度上的活性剂浓度难以利用图1A的结构 来控制。作为这种变化形式的另一个比较例，图1B显示了在导管11内的微通道12,其包含 包埋的微粒13。微粒13用活性剂（未显示）例如药物或生长因子浸渍并且可以是生物降 解型的。微粒13可随时间以预选或受控的、可编程的方式可预测地降解或以其他方式释放 所述活性剂。因此，图1B的结构可在一段时间中在微通道12内提供活性剂浓度。然而，这 种模型缺乏浓度梯度。相形之下，图1C显示了根据本公开的装置的实施方式。盘卷纤维16 用活性剂浸渍并围绕微通道14。微通道14包埋在水凝胶管道10内。沿着微通道14的长 度布置纤维16的盘卷生成了释放到微通道14中的活性剂的可控梯度。所述浓度、和进而 的可控梯度，可通过改变螺旋圈数、节距、或圈之间的横向距离、所述纤维的尺寸或厚度、和 /或通道的长度来可预测地调节。因此，图1C的装置通过在微通道中产生持续的化学梯度， 容许长期投送活性剂。所述化学梯度通过从所述盘卷纤维释放活性剂并通过随时间扩散进 入微通道而提供。从盘卷纤维释放活性剂的时间轮廓可根据下面的一项或多项来控制：纤 维内的活性剂浓度，活性剂的尺寸和/或化学组成，纤维材料的化学组成和/或显微结构， 和布置在所述管道中的任何基质材料的化学组成和/或微结构。另外，在一些实施方式中， 在所述微通道周围的纤维圈数，可被编程以提供期望的化学梯度陡度。为了本文中参考的 目的，术语"编程"要理解为是指所述纤维盘卷的任何预选和预定取向可以被控制并且是可 控的，以提供期望的结果。为了本文中参考的目的，化学梯度的"陡度"包括给定的活性剂 或其他化学物种相对于微通道长度在给定的方向中的浓度曲线的斜率。
[0079] 实施例2
[0080] 包含多个微通道的装置
[0081] 在一些实施方式中，本文中描述的装置包含多个微通道。这样的装置可用于刺激 轴突跨过间隙生长。当轴突必须跨过间隙生长时，经常需要将特定形态或类型的轴突分离 到不同的室或空间区域中。这样的分离可用于感觉和运动分支的修复和/或闭路外周神经 接口的发育。此外，可通过将多个本文中描述的纤维布置在本文中描述的装置的多个微通 道周围来实现这样的分离，其中所述纤维在传递给不同微通道的生长因子的量和/或类型 上不同和/或在所述不同的微通道内提供的化学梯度的陡度上不同。以这种方式，可诱使 来自混合神经群体的特定类型的轴突进入特定的微通道并从而最终引导到所述特定轴突 类型的适当靶标。另外，可对所述混合群体中的多个不同的轴突类型进行这种方法。
[0082] 图2显示了在多腔管道中应用几个盘卷纤维、优选具有不同梯度来引导轴突和具 有不同形态的其他细胞类型的示意图。这允许在提供每种细胞类型的最佳浓度梯度时将不 同细胞类型指导到所述管道。形态特异性轴突引导是建立所述梯度的一种预期应用。更具 体地说，图2是示意图，显示了来自混合神经群体的几个轴突20被引导到多腔管道22中， 所述多腔管道具有位于各自的微通道24b、25b、26b、27b的盘卷纤维24&、25&、263、273，并 且每个微通道任选能具有不同的形态。在这种变化形式中，每个腔或微通道被螺旋缠绕的 纤维包围，所述纤维含有已知诱使特定类型的神经元（神经细胞）生长的特异性分子信令 (例如神经营养蛋白或多效蛋白）。所述分子信令的释放在所述盘卷纤维内部的微通道中 生成梯度。所述梯度可通过在上文进一步描述的纤维体系结构而控制（例如，通过选择螺 旋圈的总数、相邻的圈之间的横向距离、和/或圈的节距）。
[0083] 为了证实多种生长因子的协同效应，测试从单一的神经营养性或多营养性因子中 萌发的感觉神经元的生长。这种试验测定了由这些化学刺激引起的生长的基线。图3是示 意图，显示了应用多个盘卷纤维在多通道管道中提供不同的梯度来引导轴突和其他类型的 细胞。如图3中所示，管道30包括第一微通道32,所述微通道具有绕所述微通道壁的长度 取向的两个盘卷纤维33、34。类似地，第二微通道36具有绕第二微通道壁的长度取向的两 个盘卷纤维37、38。这种结构容许将不同的细胞类型引导到不同的微通道，其中每个微通 道可具有具体活性剂与对所述不同细胞类型的预期效果相对应的期望、预选和最佳浓度梯 度。例如，可各自选择不同微通道的不同化学梯度，以促进不同类型轴突的生长。要理解，任 何数量的活性剂和任何数量的纤维可以围绕微通道以达到目标化学梯度的任何方式布置。
[0084] 实施例3
[0085] 形成化学梯度的方法
[0086] 具有实施例1中图1C装置的一般结构的装置用于根据本文中描述的一种实施方 式如下形成化学梯度。首先，制作聚（DL-乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)盘卷纤维。所述生 物降解型PLGA(85:15)共聚物（0. 84本征粘度（i.v. )，135, 000重均分子量（MW))利用湿 纺丝工艺被做成纤维。简单说，20重量％PLGA溶液完全溶解在二氯甲烷（Sigma-Aldrich， St.Louis，M0)中。这种溶液装入玻璃注射器（气密性，Hamilton，Reno,NY)并注射到充有 异丙醇的1.5-cm直径管中，以形成纤维。预洗过的聚酯薄膜基材用作收集卷轴。在许多 可能的纺丝参数下，所述纺丝溶液注射速率和纤维收集速度分别控制在1. 8mL/h和8. 5m/ min，以获得30ym直径纤维。另外，如有必要，向所述纺丝制剂添加聚乙二醇（PEG)以保存 活性剂（例如生长因子）的生物活性。为了形成盘卷纤维，所述纤维缠绕在玻璃棒周围（有 时也称为形成纤维）并干燥过夜，从而让任何残留的二氯甲烷蒸发。形成之后，所述纤维在 使用之前盘卷在钛纤维（直径=250ym)周围并在4°C储存。
[0087] 为了形成包含活性剂（或对照物种）的纤维，所述盘卷纤维放置于所述活性剂的 溶液中过夜。例如，下列溶液用于形成包含活性剂（或对照物种）的PLGA纤维：（1)神经 生长剂NGF(5yg/mL，Invitrogen，Carlsbad，CA) ; (2)对照物种牛血清白蛋白（BSA，20mg/ mL，Sigma-Aldrich，St.Louis，M0);和⑶焚光物种花青染料-3 (Cy3, 5yg/mL，Jackson ImmunoResearchLab，WestGrove，PA)〇
[0088] 负载Cy3的PLGA盘卷纤维利用光学显微术和荧光显微术成像，以证明所述盘卷提 供了化学梯度并且倾向于保持它们的结构，甚至在去除所述制造金属后。图4A-F显示了相 同的纤维在低和高浓度区域中的放大（显微镜）图像，证实了负载了荧光染料（Cy3)的纤 维的圈数和发出荧光有显著差异。图4A显示了围绕制造纤维（未显示）的缠绕卷40的图 像。图4B显示了可放置在神经管道中的盘卷PLGA纤维42。图4C-F是在图4B中显示的方 框44、46中的区域的较高放大倍数图像。图4D中的Cy3-PLGA盘卷纤维47从高密度区成 像，其中"高密度"是指比较高的节距（方框44)。Cy3-PLGA盘卷纤维48从低密度区（方 框46)成像。
[0089] 所述纤维的制造需要苛刻的化学程序，例如应用有机溶剂（二氯甲烷）。为了证 实生长因子（蛋白质）在制造所述盘卷的过程中始终保留，在嗜铬细胞瘤（PC-12)细胞存 在下提供负载NGF的盘卷纤维。PC-12细胞是在神经生长因子（NGF)存在下增殖和分化的 细胞系。细胞/ECM悬液利用在下文马上进一步描述的透明多腔基质（TMM)装置，装入所 述浇铸装置区域的细胞孔中，并通过生成负压推到所述腔中。接种在所述腔内部的细胞用 4%多聚甲醛（PFA)固定24小时并用俄勒冈绿鬼笔环肽和T0-PR03碘化物（Invitrogen， Carlsbad，CA)染色以分别显现原样的细胞骨架和核标记。测量在零、低和高浓度区域中所 述PC-12细胞突起长度。为了促进染色染料的渗透，所述凝胶放置在细胞培养板中，同时所 述溶液利用磁性板和搅拌棒在4 °C搅拌过夜。
[0090] 嗜铬细胞瘤细胞（PC-12细胞）加入用于浇铸琼脂糖凝胶的新的长方形 框架（12.5mmX36mm)中。所述浇铸装置用牙科粘固剂制成并用于引导多个钛纤维 (0? 25mmxl7mm;SmallParts，Logansport，IN)。缠绕了含生长因子的聚合物卷的钛纤维在所 述装置的两端处穿过通孔布置。在无菌条件下，所述浇铸装置放在细胞培养皿中的玻璃载 片上并施加1.5%超纯琼脂糖（Sigma-Aldrich，St.Louis，M0)溶液以覆盖所述纤维并使其 聚合。PC12细胞（lxl06ml)悬浮在生长因子减少的基质胶（3. 5mg/mL，BDBiosciences， SanJose，CA)中。在从所述固化的凝胶去除钛纤维期间产生的负压，