多种改进型橙/红色荧光蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及多种改进型橙/红色荧光蛋白，通过对来自珊瑚虫Discosoma sp.红色荧光蛋白DsRed氨基酸序列的改造，获得的新型荧光蛋白与野生型具有不同的特点。本发明获得了一种与mOrange2类似但更亮的单体结构橙色荧光蛋白，其荧光亮度比mOrange2高2.0倍。本发明还获得了一种新型的紫红色荧光蛋白，该荧光蛋白具有特异性的最大激发波长和最大发射波长。本发明还涉及将改进型的荧光蛋白用于多领域的研究，采用将荧光蛋白融合在靶标蛋白N端或C端，在细胞系或活体动物中表达该融合蛋白，可对靶标蛋白进行细胞、亚细胞和活体组织内的定位，示踪，功能展示等多种进行分析。
【专利说明】
多种改进型橙/红色荧光蛋白
技术领域
[0001] 本发明涉及一些改进型的橙/红色焚光蛋白，通过对来自珊瑚虫Discosoma sp.红色荧光蛋白DsRed序列的改造，所得新型荧光蛋白与野生型具有明显不同的颜色（激 发光谱和发射光谱）、荧光强度等特点。本发明还涉及上述荧光蛋白基因的克隆、表达及其 可与蛋白在N端或在C端融合，在细胞系或活体动物中表达，可对靶标蛋白进行细胞、亚细 胞和活体组织内的定位，示踪，功能展示等进行多种分析。
【背景技术】
[0002] 荧光蛋白作为分子标签，在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的应 用。尤其是在细胞分子影像的应用方面，可以通过融合蛋白技术，将荧光蛋白融合到细胞内 的某个靶标蛋白上，以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞 内分子的相互作用。荧光标签众多，如何选择荧光蛋白更好的显示靶标蛋白的示踪和功能， 主要考虑以下几个方面：1)焚光蛋白表达壳度尚，无毒性；2)焚光蛋白具有很好的光稳定 性；3)不能选择多聚体的荧光蛋白；4)荧光蛋白不能对表达细胞或组织环境因素敏感；5) 要有多通道，不相互干扰的荧光蛋白。
[0003] 红色焚光蛋白 drFP583 (DsRed)是从 Discosoma sp?分离得到的（Matz et al.， Nature Biotech. 17 ：969-973(1999), Gross et al. , Proc. Nat ' LAcad. Sci. USA 97 ： 11990-11995(2000))，其优点显而易见：可与GFP系列荧光蛋白共用，且激发和发射波长更 长，细胞内成像背景低，能够与现有的共聚焦和宽视场显微镜滤光片等具有很好的包容性， 红光的穿透性尤其适用于对活体动物组织的成像，因而红色荧光蛋白显得尤为重要。在哺 乳动物细胞中，无论是自发荧光还是对红光区的光吸收都大为减少，因此红色荧光探针的 发展对于检测厚标本和活体动物成像都是非常重要的。在后续的荧光使用中，逐渐在荧光 蛋白的单体化，适应多细胞区域表达，荧光稳定性等多方面对红色荧光蛋白有了更多的需 求，而DsRed为4聚体蛋白，高度聚集的形式不利于与蛋白融合表达来观察蛋白的表达定 位，功能等的能力，因此开展了更大规模的红色荧光蛋白突变体筛选工作。但将DsRed突变 为单体后，其光稳定性大大缩短，无法满足共聚焦的成像要求，并且由于改变了发光体的结 构，容易形成更多不同颜色差异的红色荧光蛋白。因此，目前红色荧光蛋白进化的焦点集中 在两个目标上，第一完善当前己有的单体红色荧光蛋白，使得它们的荧光特性或稳定性等 特征进一步优化；第二是开发能发红光的荧光蛋白，甚至是发射波段处于远红外区的荧光 蛋白。短短数年，对红色荧光蛋白的一系列研究，极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性，为 细胞内的多色标记提供了更多的荧光标签。
[0004] m0range2为从DsRed蛋白基础上突变获得橙红色的荧光突变体，其激发光谱为 549nm，发射光谱为565nm。既可在红色荧光下发红光，也可以在橙色荧光下发橙色的光。相 对于DsRed红色焚光蛋白，m0range2形成了更有利于蛋白融合表达的单体形式，并且蛋白 成熟速度快，但荧光强度虽略有下降，其光稳定性虽比DsRed四聚体差，但相对于大多数单 体红色焚光蛋白，其光稳定性完全可以保证共聚焦的成像要求（表1)。由于m0range2明 显的光稳定优势，与其融合表达的蛋白可以在高强度的共聚焦显微镜下清晰的显示蛋白在 细胞内或组织内表达的焚光图像（Nathan C.Shaner等，Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 2008 ；5 (6)： 545-551) 〇
[0005] 表1 :红色荧光蛋白的荧光特性
[0007] 本发明欲以DsRed的序列为模板，对其荧光结构的构建位点进行饱和突变，并 且增加了随机突变的文库来筛选单体结构，荧光强度高，光稳定性强等特性的红色荧光 蛋白，即在保证单体结构适于与靶标蛋白融合表达的基础上，重点优化其亮度和光稳定 性。本发明获得了 3株突变为不同颜色的高亮度荧光蛋白，其中一株橙红色荧光蛋白 OFPSpark(sRFPlO)的亮度明显增强，可以更好的增强蛋白融合后的荧光蛋白亮度。另一株 SRFP2蛋白为一新激发波长的荧光蛋白，相对于常见的红色荧光蛋白，该荧光蛋白的激发和 发射波长更长，具有一定的特色。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个方面，提供了一种新的荧光蛋白OFPSpark(sRFPlO)，该荧光蛋白是 由DsRed红色荧光蛋白突变而来，其特征在于由SEQ. ID. N0 :7所示氨基酸序列中包含了 E10P，R17H，E32V，H41F，Q64H，K83L，F99Y，T147S，L150M，E160K，L225Q 位置上由相应的氨 基酸替换。所述荧光蛋白激发峰是549nm，发射峰是566nm，呈橙红色，可以分别在橙色和红 色激发光谱下反射焚光。与亲本蛋白相比（DsRed的激发峰为558nm，发射峰为583nm)，所 述荧光蛋白为单体形式，并且保留了很强的荧光亮度，可在多种哺乳动物细胞中能获得良 好表达，激发出明显的荧光。
[0009] 本发明的又一方面，提供了 一种由SEQ.ID.N0 :5所示氨基酸序列的荧光蛋白 sRFP2,该荧光蛋白是由DsRed红色荧光蛋白突变而来，其中包含如下氨基酸替换：E10Q， V16I，R17Y，E32V，R36K，H41T，K47Q，A64H，C116T，F117L，K121H，M141L，A145P，L150N，I161N， K163M，V175C，Q188K，Y193H，S197Y，I210V，G219A，L225Q。与亲本蛋白比，其光谱范围红移， 所述荧光蛋白激发峰是577nm，发射峰是602nm，呈一种很漂亮的紫红色。
[0010] 本发明的又一方面，提供了 一种由SEQ.ID.N0 :9所示氨基酸序列的荧光蛋白 SRFP12,该荧光蛋白是由DsRed红色荧光蛋白突变而来，其中包含如下氨基酸替换：E10P， R17H，E32V，R36K，K47Q，K83C，L85A，I210Y，L225Q。与亲本蛋白比，所述荧光蛋白激发峰是 547nm，发射峰是565nm，呈一种很漂亮的玫红色。
[0011] 本发明的又一方面，还提供了 OFPSpark和sRFP2荧光蛋白与表达于多种细胞器中 靶标蛋白进行融合表达，可检测细胞内靶标蛋白的表达、定位，及标记相互作用蛋白等多种 用途。即将OFPSpark荧光蛋白基因序列放在靶标蛋白的N端或C端融合在一起后，装载到 哺乳动物细胞的表达载体中，将表达载体采用不同的方式转染细胞或活体组织，转染24~ 120小时后，可在专业荧光成像设备下观察荧光图像。
【附图说明】
[0012] 图1 :高纯度的3株红色突变克隆蛋白溶液，sRFP2, OFPSpark(sRFPlO)和SRFP12 的颜色分别为紫红，橙红色和玫红；
[0013] 图2 :红色荧光突变蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，结 果显示sRFP2的最大激发波长578nm，最佳发射波长602nm ;0FPSpark (sRFPIO)的最大激发 波长549nm，最佳发射波长566nm ;sRFP12的最大激发波长548nm，最佳发射波长565nm ;
[0014] 图 3 :pCMV3-sRFP2, pCMV3-sRFP10 和 pCMV3-sRFP12 在 293H 细胞中表达荧光蛋白 强度，在范围为532. 5~587. 5nm波长通道激发光下出红色荧光，sRFPIO的荧光强度最亮， SRFP12的荧光强度次之，sRFP2的荧光强度最弱；
[0015] 图 4 :pCMV3-0FPSpark(sRFP10)和 pCMV3-m0range2 在 293H 细胞和 Hela 细胞中 表达荧光蛋白强度，在范围为532. 5~587. 5nm波长通道激发光下出红色荧光，在2种细胞 中，OFPSpark比m0range2的亮度明显增强；在范围为503. 5~547. 5nm波长通道激发光下 出橙色荧光；在293H细胞中，OFPSpark比m0range2的亮度明显增强。
[0016] 图5 :m0range2和OFPSpark的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳检测；
[0017] 图 6 :m0range2 (图 A)和 OFPSpark (图 B)的 SEC-HPLC 检测；
[0018] 图7 :m0range2和OFPSpark的pH稳定性测定，OFPSpark的pH稳定性略优于 m0range2 ；
[0019] 图8 :m0range2 (上图）和OFPSpark(下图）的焚光消光系数检测，m0range2蛋白 的荧光消光系数为50000M km \ OFPSpark蛋白的荧光消光系数为84000M km S
[0020] 图9 :m0range2和OFPSpark的发射光波谱，在相同的蛋白浓度下，m0range2的 发射光的波谱面积为122736, OFPSpark的发射光的波谱面积为216142,其发射光光谱比 m0range2 强 1. 8 倍；
[0021] 图10A :0FPSpark和m0range2蛋白在紫外强光下的光稳定特性检测，其结果类似； 图10B为在共聚焦显微镜下，561nm红光光谱的高强度光刺激下OFPSpark和m0range2的光 稳定性检测，其结果也显示类似；
[0022] 图11 :0FPSpark与目的基因融合表达载体示意图，图A为OFPSpark放在目的基因 N端表达的载体不意图，图B为OFPSpark放在目的基因C端表达的载体不意图；
[0023] 图12 :pCMV-TUBB-〇FPSpark微管蛋白TUBB融合蛋白在Hela细胞中表达图，激发 光为56lnm波长通道激发光下出红色荧光；
[0024] 图13 :pCMV-G0LMl-0FPSpark高尔基体蛋白G0LM1融合蛋白在Hela细胞中表达， 激发光为561nm波长通道激发光下出红色荧光；
[0025] 图14 :pCMV-ACTB-〇FPSpark胞质骨架蛋白ACTB融合蛋白在Hela细胞中表达，激 发光为56lnm波长通道激发光下出红色焚光；
[0026] 图15 :pCMV-LAMPl-〇FPSpark溶酶体蛋白LAMP1融合蛋白在Hela细胞中表达，激 发光为56lnm波长通道激发光下出红色焚光；
[0027] 图16 :PCMV-CCNEl-sRFP2细胞核蛋白CCNE1融合蛋白在Hela细胞中表达，激发光 为561nm波长通道激发光下出红色荧光。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1. DsRed突变文库的构建：
[0029] 通过Discovery studio4. 0软件对DsRed (氨基酸序列见SEQ. ID. N0 :1)蛋白结构 的分析，找出可能影响DsRed结构的48个位点，这48个位点是：R2, S4, K5, E10, V16, R17， T21，E32, R36, H41，N42, V44, K47, Q64, F65, Q66, V71，V73, K83, L85, F91，E99, C117, F118， F124, 1125, V127, T147, L150, R153, V156, E160, 1161，H162, K163, A164, L174, V175, F177， S179, 1180, Y192, Y194, S197, 1210, T217, G219, L225,将这 48 个点错开分成 12 组（表 2)， 分别对每组每个位点的氨基酸做饱和突变，这样得到了 12组饱和突变的基因库；另外用易 错PCR方法对DsRed基因进行随机突变，得到一组突变基因库；将这13组突变基因应用DNA Shuffling的方法进行随机重组，插入pQE30载体，建立pQE30-DsRed-DS文库，以期获得荧 光光谱变异的突变型。
[0030] 表2 :13组DsRed的突变库
[0031]
[0032] 分别在DsRed基因的首尾设计引物，并加入可以连接进入载体的BamHI和PstI位 点，上游引物序列是 RFP-Bam-F :5' GGAGGATCCATGGATAGCACTGAGAACGTCA 3'（SEQ. ID. N0 : 2)，下游引物序列为 RFP-Pst-R :5' GGACTGCAGCTACTGGAACAGGTGGTGGC 3'（SEQ. ID. NO :3)。 中间突变点处正向饱和引物设计是"NNK"，反向饱和引物设计是"NNM"，这样每组基因需要 设计4对突变引物，以质粒pcDNA3-D SRed为模板分段扩增，然后用重叠PCR法以首尾引物 组合成完整的DsRed-ml~DsRed-ml2突变基因库。
[0033] 同样用RFP-Bam-F/RFP-Pst-R引物以质粒pcDNA3-DsRed为模板进行易错PCR 扩增全长DsRed随机突变基因库，随机引入突变位点，易错PCR条件为：6mM MgCljP 5mM MnCl2存在下，将dATP，dGTP，dCTP，dTTP按不同比例混合，进行易错PCR，PCR循环条件为： 94°(：，51^11;941€3〇8,551€3〇8,72 1€5〇8,30个循环；721€5111111，形成〇81^(11113突变库。
[0034] 分别取 10 y gDsRed-ml ~DsRed-ml2 和 10 y g 易错 PCR 产物 DsRed-ml3 混合后 用DNasel完全消化成小于300bp的条带，琼脂糖凝胶回收50-200bp间的条带。取200ng 胶回收纯化的 50-200bp 的 DNA 混合物，加入 5 y 1 lOxTaq buffer，2 y 1 dNTP，0? 5 y 1 taq 酶，进行拼接，循环条件为：94°C 5min ;94°C 30s，50°C 30s，72°C 50s，25 个循环；72°C，5min。 取 10yl 上面的PCR 产物，其为模板，加入 10yl 10xTaqbuffer，4yl dNTP，lyl taq酶 和首尾引物2 y 1 10 y M RFP-Bam-F/RFP-Pst-R，进行PCR扩增，循环条件为：94°C，5min ; 94°〇3〇8,6〇1€3〇8,721€5〇8,30个循环；72°(：，5111111。扩增完成后，胶回收纯化68(^?条带， 经BamHI+PstI双酶切后与经同样双酶切的pQE30载体进行连接反应，电转XLl-Blue细胞， 加入lml S0C培养基于37°C，180rmp培养40min复苏细胞，取500 y 1涂LB-AT (Amp与Tet 抗性）平皿，平均5 y 1涂一块平皿，37°C培养14h拿出平皿，放室温观察。剩余部分菌液加 入甘油于_20°C保存，DsRed-DS文库制备完成。
[0035] 实施例2. DsRed突变克隆的筛选：
[0036] 将DsRed-DS文库均匀的涂板于ZYM-AT自诱导培养基平板（1%胰蛋白胨，0. 5% 酵母提取物，25禮似2即04,251111 腿2?04,501111 順4(：1，51111似2504,0.5%甘油，0.05%葡萄 糖，0? 2% a-乳糖，2mM MgS04,0. 2x微量元素，1%琼脂和50 y g/mLAmp)上，30°C培养过夜， DsRed-DS文库中的单克隆表达突变荧光蛋白，呈现不同亮度和颜色。观察平皿，将较亮的 红色菌落用记号笔圈出来。下步配制ZYM-AT自诱导液体培养基，于96孔深孔板中每孔加 入200 y 1 ZYM-AT液体培养基中。然后将这些较亮的红色菌落挑出来接种至96孔板中，共 挑1820个克隆，所有深孔板放入30°C，200rpm摇床培养16h进行荧光蛋白表达。将过夜表 达菌液用PBS稀释5倍（20 y 1菌液+80 y 1 PBS)，用微孔板检测系统SpectraMax M5进行 检测，先用波长扫描对96孔板样品进行粗略扫描，扫描结果显示，所有突变体的激发峰在 530-590nm之间，发射峰在550-610nm之间，记下每孔的激发峰和发射峰值，每个孔用相应 的激发峰和发射峰进行检测，测定每个样品的荧光值。经过大量筛选，挑选了 3株可稳定激 发不同颜色的高荧光值红色荧光蛋白的克隆，分别命名为81^?2、81^?10、81^?12，序列见表 3〇
[0037] 将 pQE30-sRFP2、pQE30-sRFP 10、pQE30-sRFP 12 单克隆挑于 LB 细菌培养基中 37 °C， 200印111培养过夜，按0.5%接种于2001111 2￥11-41'自诱导液体培养基中，37°(：，240印111摇床培 养 20h 后，离心收获菌液，收获菌体（BECKMAN COULTER Avanti@J-26XPI，6500RPM/15min)， 按菌体：缓冲液1 : 20加入裂解缓冲液BufferA(50Mm Tris，pH8. 0,500mM NaCl)，搅拌 混匀，高压均质机破碎（ATS，200Pa两次，800pa每次），离心收集上清（BECKMAN COULTER AllegraTM 64R Centrifuge，12000RPM/30min)，0? 45 ym 滤膜过滤，得到澄清的上清液，将 样品用恒流栗上Ni柱，（提前用bufferA，3柱体积平衡），同时打开UV灯，在线监测，样 品上完后，用buffer A将UV平衡至基线，分步阶段洗脱，10 % B，15 % B，20 % B，50 % B， 100% B(buffer B:50mM Tris，pH8.0,500mM NaCl，500mM Imidazole)，分别收集各个洗脱 峰。变性电泳监测纯度，将纯度合格的组分过S印hadex G-25Fine柱脱盐至PBS。图1显 示3种突变RFP蛋白的肉眼观察颜色，其中sRFP2为紫红色，sRPFlO为橙红色，SRPF12为 玫红色。检测这三种蛋白的发射峰和激发峰：具体方式为：1)发射波长设为0,扫描激发光 谱A(设激发波长扫描范围为200~700nm) ;2)荧光发射光谱：找出吸收最强（或次强）对 应的波长作为激发波长，扫描发射光谱（设发射波长扫描范围为激发波长+5nm~700nm); 3)荧光激发光谱：找出吸收最强（或次强）对应的波长作为发射波长，扫描激发光谱。图 2显示sRFP2、sRFPIO、SRFP12的荧光光谱，其中sRFP2的最大激发波长577nm，最佳发射 波长602nm ;sRFP10的最大激发波长549nm，最佳发射波长566nm ;sRFP12的最大激发波长 547nm，最佳发射波长565nm (见表3)。
[0038] 表3 :突变红色克隆的特性及序列
[0040] 实施例3. sRFP突变型荧光蛋白和m0range2荧光蛋白真核表达载体的构建和表 达：
[0041] 用引物 sRFP-inf-F :5' GGTACCGCTAGCGGATCCATGGATAGCACTGAGAACGTCA 3'（SEQ. ID. N0 :10)和 sRFP-inf-R :5'GGCCGCTCTAGACTCGAGCTACTGGAACAGGTGGTGGC 3'（SEQ. ID. N0 : 11)分别以这3株突变型为模板扩增sRFP2, sRFPIO和sRFP12基因，经infusion酶连入到真 核表达载体PCMV3中，鉴定得到正确的质粒pCMV3-sRFP2，pCMV3-sRFP10和pCMV3-sRFP12。 纯化获得转染级纯度的pCMV3-sRFP2, pCMV3-sRFP10和pCMV3-sRFP12质粒转染293H细胞。 具体步骤为：29311细胞用含10%胎牛血清的01^11培养基，在37°(：及5%二氧化碳条件下培 养.转染前，将细胞按1 X 105细胞/孔的密度接种于24孔板中，培养24h后用于转染，细 胞密度为70%~90%。2ygDNA与一定量PEI (按PEI : DNA = 5 : 1的比例添加）各用 50yL稀释缓冲液（25mmol/L Ifepes，150mmol/L NaCl，pH 7. 1)稀释到终浓度。将稀释后 的PEI溶液逐滴加入DNA溶液中，立即振荡混匀，室温静置30min后，将混合液加到铺有细 胞的24孔板中，摇动混匀后于5%二氧化碳的培养箱中37°C培养。分别于24h、48h、72h用 荧光显微镜观察荧光，挑选最亮的时间段拍摄照片（图3)。其结果显示，在范围为532. 5~ 587. 5nm波长通道激发光下，sRFPIO的表达最亮，该蛋白的颜色为橙红色，并且其荧光光谱 也与m0range2 -致，因此将该蛋白命名为OFPSpark。
[0042] 用引物 m0range2-inf-F :5' GGTACCGCTAGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG 3'（SEQ. ID. N0 :12)和 m0range2-inf-R :5' GGCCGCTCTAGACTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCC ATGC 3'（SEQ.ID.N0 :13)扩增获得m0range2的核苷酸序列。经infusion酶连入到真 核表达载体PCMV3中，鉴定得到正确的质粒pCMV3-m0range2 (SEQ. ID. N0 :14)。提取获 得 pCMV3-mOrange2 和 pCMV3-sRFP10 (OFPSpark)的转染级质粒，转染 293H 和 Hela 细胞。 具体步骤同前文，挑选最亮的时间段拍摄照片（图4)。其结果显示，在范围为532. 5~ 587. 5nm波长通道激发光下为高亮度的红色荧光，OFPSpark在2种细胞中的表达明显强于 m0range2,在范围为503. 5~547. 5nm波长通道激发光下为橙色荧光，OFPSpark表达也强 于 m0range2〇
[0043] 实施例4. OFPSpark荧光蛋白性质的测定：
[0044] 1. OFPSpark 和 m0range2 焚光蛋白的生产：
[0045] 具体方法同前，采用 pQE30_sRFP10(0FPSpark)、pQE30_m0range2 两种表达质粒 培养1L表达产物，离心破菌得到澄清的上清液，Ni柱纯化获得高纯度的荧光蛋白，脱盐至 PBS。OFPSpark和m0range2蛋白的SDS-PAGE电泳结果见图5,蛋白条带结果显示m0range2 比OFPSpark分子量略大，均在28~30kD，与其理论分子量相吻合。纯化蛋白采用SDS-PAGE 分析蛋白的分子量大小，采用SEC-HPLC分析荧光蛋白的颗粒大小，分子量略大的m0range2 的HPLC出峰时间为17. 768分钟，分子量略小的OFPSpark的HPLC的出峰时间为18. 468分 钟（图6)。该结果显示OFPSpark蛋白和m0range2蛋白一样，均为单体的结构。
[0046] 2. OFPSpark pH值稳定性测定
[0047] pH值稳定性测定方法为：配置pH3至pH12的缓冲液备用，用配置好的缓冲液将荧 光蛋白稀释至20 μg/ml，用荧光蛋白的最大激发波长激发，用最大发射波长检测荧光信号； 记录相应pH值下的荧光信号值，将荧光信号最强的值定义为100%，计算出相应pH值下的 荧光强度百分比，将50%荧光强度下的pH值定义为pKa。图7显示m0range2的pKa为6. 8， OFPSpark的pKa为6. 2。OFPSpark的pH耐受能力要略好于m0range2。pH值稳定性越低， 表明蛋白可以更好的适应多环境系统的表达，保证其应用范围不受限制。
[0048] 3. OFPSpark消光系数的测定
[0049] 依据消光系数的计算公式：e = A/bc其中e为消光系数；A为吸光度；c为溶液中 物质的浓度；b为光在溶液中的光程。利用BCA法检测生产的荧光蛋白的浓度，依据测定的 浓度，将样品用 pH8. 0 的缓冲液稀释至 10 y g/ml，20 y g/ml，40 y g/ml，80 y g/ml 和 160 y g/ ml在lcm光程比色皿中检测吸光值；依据检测的吸光值和对应荧光蛋白的摩尔浓度作图， 拟合直线，从计算公式中读取消光系数值。图8显示m0range2的消光系数为50000M icm \ OFPSpark的消光系数为84000M icm i。该结果表明OFPSpark的光吸收性能是m0range2的 1.7 倍。
[0050] 4. OFPSpark量子产率测定
[0051] 本研究通过参比法检测荧光蛋白量子产率，依据公式：Yu = Ys*Fu/Fs*As/Au ;Yu、 Ys为待测物质和参比物质的量子产率；Fu、Fs为待测物质和参比物质的积分荧光强度；Au， As为待测物质和参比物质在选定激发波长下（为548nm)的吸光值（A = ebc)。荧光样品用 PH8. 0的缓冲液稀释至20 y g/ml在选定的激发波长条件下，用lcm光程比色皿中检测吸光 值，其中OFPSpark在548nm激发波长下的吸光值为0. 035, m0range2在548nm激发波长下 的吸光值为0.023;同时将该样品在选定波长条件下，进行波谱扫描，导出实验数值，整理 后作图，进行波谱积分。将检测获得的吸光值，积分荧光强度，参比物的量子产率值带入公 式计算获得待测物质的量子产率。分析获得的荧光发射光谱面积见图9, OFPSpark (光谱面 积为216142)的激发光谱强度比m0range2(光谱面积为122736)强1.8倍。根据量子产率 计算公式，参考文献中的mOrange2的量子产率，计算得到OFPSpark的量子产率为0. 69,略 高于 m0range2 为 0.60 的量子产率（Nathan C.Shaner 等，Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 2008 ；5 (6)： 545-551) 〇
[0052] 5. OFPSpark 亮度检测
[0053] 荧光亮度为蛋白的消光系数与量子产率的乘积，即荧光蛋白的光能量吸收转换为 发射光的能量强度。根据该公式计算，OFPSpark的荧光亮度为58,而m0range2的荧光亮度 为29. 4。OFPSpark的亮度比m0range2高2.0倍。该结果也与这两种荧光细胞在细胞中的 表达水平的差异结果相吻合。
[0054] 6. OFPSpark光稳定性检测
[0055] 本研究将50 y g/ml的m0range2和OFPSpark同时放置于紫外强光条件下照射， 不同时间点取样检测荧光强度；以最初的荧光强度为100%，计算不同时间的荧光强度百 分比，以时间和荧光强度百分比作图分析荧光蛋白的失活速率。图10A显示m0range2和 OFPSpark的光稳定性质相似，都保留了相对较好的光稳定性。
[0056] 将 pCMV3-m0range2 和 pCMV3-0FPSpark (sRFPIO)的转染级质粒转染 HeLa 细胞。具 体步骤同前文，转染48h挑选最亮细胞用于光漂白检测。使用NikonAl激光扫描共聚焦显 微镜进行荧光蛋白光漂白检测。物镜为CFI Apo TIRF 60x，数值孔径（N.A.)为1.49 ;激光 选用561nm通道（红光光谱），光电倍增光（photomultiplier)电压为80V;读值区域面积 (R0I)为15600 y m2 (130 y m*120 y m)。漂白过程中每隔1. 55s读取一次荧光值，共读取25 次。以荧光漂白时间为横坐标和荧光强度为纵坐标作图，分析m0range2和OFPSpark的荧 光强度随漂白时间的变化。图10B显示OFPSpark和m0range2的在较强激光漂白下的荧光 强度变化趋势相似，显示OFPSpark与m0range2有相近的光稳定特性。
[0057] 实施例5. OFPSpark荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建和表达：
[0058] 将微管蛋白TUBB，胞质骨架蛋白ATCB，溶酶体蛋白LAMP1和高尔基体蛋白G0LM1 的0RF(无终止密码子）基因序列用各自的特异引物扩增出来，并在上下游引物上分别引 入 HindllI 和 Nhel ID. NO :15)，TUBB-R，5，ACCATGGATCCGCTAGCGGCCTCCTCTTCGGCCT 3，（SEQ. ID. NO : 16)， G0LM1-F，5 ' GGCCGCCACCAAGCTTATGGTGGACCTCCAGACACGG 3，（SEQ. ID. NO : 17)，G0LM1-R， 5' ACCATGGATCCGCTAGCGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACG 3r (SEQ. ID. NO ：18),LAMP1-F,5r GG CCGCCACCAAGCTTATGGCTGCCCCCGGCAG 3r (SEQ. ID. NO ： 19),LAMP1-R,5r CCATGGATCCGCTAGC CATGCTGTTCTCGTCCAGCAGACA 3，（SEQ.ID.N0:20)，ActB-F，5' GGCCGCCACCMGCTTATGGATGA TGATATCGCCGC 3，（SEQ. ID. NO :21)，ActB-R，5，CCATGGATCCGCTAGCGAAGCATTTGCGGTGGACG 3' (SEQ. ID. NO :22)。通过PCR获得4条基因需要表达的基因序列。通过HindllI+Nhel双酶 切构建到pCMV3-N-0FPSpark或pCMV3-C-0FPSpark载体中（图11)，使之与OFPSpark形成融 合表达形式，获得 pCMV3-LAMPl-0FPSpark，pCMV3-ACTB-0FPSpark，pCMV3-G0LMl-0FPSpark， pCMV3-TUBB-0FPSpark表达载体（见表4)。将这些融合质粒转染Hela细胞，转染方法同上。 表达48h后检测，用Confocal共聚焦荧光显微镜观察荧光，激发光为561nm(红光范围），并 拍摄照片。试验显示：〇FPSpark能够与这些基因融合表达，能应用于真核细胞的定位，而且 对融合表达目的基因的折叠没有影响（图12,13,14,15)。
[0059] 表4 :0FPSpark融合蛋白序列
[0061] sRFP2荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建和表达：将核蛋白CCNE1的0RF(无终 止密码子）基因序列用各自的特异引物扩增出来，并在上下游引物上分别引入Hindlll和 Nhel 位点，CCNE1-F，5 ' GGCCGCCACCAAGCTTATGCCGAGGGAGCGCAGG 3 ' （SEQ. ID. N0 :31)， CCNE1-R，5 ' CCATGGATCCGCTAGCCGCCATTTCCGGCCCGC 3 ' （SEQ. ID. NO :32)。通过 PCR 获得 CCNE1条基因需要表达的基因序列。通过Hindlll+Nhel双酶切构建到pCMV3-C-sRFP2载体 中，使之与OFPSpark形成融合表达形式，获得pCMV3-CCNEl-sRFP2表达载体（见表5)。将 该融合质粒转染Hela细胞，转染方法同上。表达48h后检测，用Confocal共聚焦焚光显微 镜观察荧光，激发光为561nm(红光范围），并拍摄照片。试验显示：sRFP2能够与CCNE1基 因融合表达能发出漂亮的红色荧光，可应用于细胞核的定位，而且对融合表达目的基因的 折叠没有影响（图16)。
[0062] 表5 : sRFP2融合蛋白序列
[0063]
【主权项】
1. 一种荧光增强型的橙/红色荧光蛋白，其特征在于： a) 核苷酸序列为SEQ. ID. NO :6,其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ. ID. NO :7 ; b) 氨基酸序列与SEQ. ID. NO :7有95%同源性的突变体； c) 为珊瑚虫Discosoma sp.红色焚光蛋白DsRed的突变体； d) 包含 E10P，R17H，E32V，H41F，Q64H，K83L，F99Y，T147S，L150M，E160K，L225Q 位点氨 基酸突变的橙/红色荧光蛋白； e) 包含E10P，R17H，E32V，K83L，L225Q任一或组合位点氨基酸突变的橙/红色荧光蛋 白； f) 该荧光蛋白在范围为503. 5~547. 5nm波长通道激发光下为橙色荧光，在范围为 532. 5~587. 5nm波长通道激发光下为高亮度的红色荧光。2. -种新型红色荧光蛋白，其特征在于： a) 核苷酸序列为SEQ. ID. NO :4,其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ. ID. NO :5 ; b) 氨基酸序列与SEQ. ID. NO :5有95%同源性的突变体； c) 为珊瑚虫Discosoma sp.红色焚光蛋白DsRed的突变体； d) 包含 E10Q，V16I，R17Y，E32V，R36K，H41T，K47Q，A64H，C116T，F117L，K121H，M141L， A145P，L150N，I161N，K163M，V175C，Q188K，Y193H，S197Y，I210V，G219A，L225Q 位点氨基酸 突变的红色荧光蛋白； e) 该荧光蛋白在范围为532. 5~587. 5nm波长通道激发光下为高亮度的红色荧光。3. -种定位目的蛋白在细胞、动物活体表达的方法，该方法包括： a) 采用基因工程技术将目的蛋白基因和权利要求1所述的增强型橙/红色荧光蛋白基 因（核苷酸序列为SEQ. ID. NO :6)融合； b) 将融合蛋白的基因序列插入到适合的表达载体中； c) 将融合蛋白表达载体转染细胞或动物活体，并在上述细胞和活体的最适培养条件 下培养合适的时间，获得包含SEQ. ID. NO :7氨基酸序列的橙/红色荧光蛋白融合蛋白的表 达； d) 在权利要求1所述荧光蛋白的最佳激发光谱下观察目的蛋白在细胞、动物活体中的 表达定位。4. 权利要求3所述的方法中，增强型橙/红色荧光蛋白基因序列可以放在目的基因的 C端或N端进行融合表达。5. 权利要求3所述的方法中，适用的表达载体包含但不限于哺乳动物真核表达载体 PCMV3,还包含细菌，昆虫，酵母和慢病毒表达载体，其载体的特征在于： a) 包含表达宿主所需要的转录起始区域； b) 包含权利要求1所包含的橙/红色荧光蛋白的核苷酸序列； c) 包含表达宿主所需要的转录终止区域。6. 权利要求3所述的方法中，适用的表达细胞系包含但不限于哺乳动物细胞，昆虫细 胞，酵母细胞和细菌。7. 权利要求3所述的方法可以用于检测目的蛋白的表达定位，蛋白间的相互作用，表 达元件的功能，细胞器指示功能。8. -种表达增强型橙/红色荧光蛋白的细胞或活体，其特征在于： a) 包含权利要求1所述的橙/红色荧光蛋白的基因表达载体； b) 包含权利要求1所述的橙/红色荧光蛋白的融合蛋白的基因表达载体； c) 上述表达载体可游离或重组于细胞或活体的基因组中； d) 可以用于细胞、活体的示踪或功能分析。9. 一种定位目的蛋白在细胞、动物活体表达的方法，该方法包括： a) 采用基因工程技术将目的蛋白基因和权利要求2所述的增强型红色荧光蛋白基因 (核苷酸序列为SEQ. ID. NO :4)在基因的N端或C端融合； b) 将融合蛋白的基因序列插入到适合的表达载体中； c) 将融合蛋白表达载体转染细胞或动物活体，并在上述细胞和活体的最适培养条件下 培养合适的时间，获得包含SEQ. ID. NO :5氨基酸序列的红色荧光蛋白融合蛋白的表达； d) 在权利要求2所述荧光蛋白的最佳激发光谱下观察目的蛋白在细胞、动物活体中的 表达定位。
【文档编号】C12N15/867GK105820227SQ201510003374
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月6日
【发明人】孙春昀, 谢良志, 饶木鼎, 赵淑环, 徐明明, 陈军
【申请人】北京义翘神州生物技术有限公司