专利名称：一种利用红色荧光蛋白用做水稻转化筛选标记的转化方法
技术领域：
本发明提供了一种新的应用于植物转化的安全的筛选标记，并提供了利用荧光显微镜进行筛选的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
利用转基因技术能够将具有优良性状的目的基因导入植物基因组中，从而使植物的遗传性状得到改良。然而转化过程中只有少数植物细胞能够吸收外源DNA并整合进植物基因组中，大多数细胞是未转化的。因此，目的基因的引入常常需要借助于筛选标记基因， 赋予转化细胞以特定的选择性标记，以便识别和鉴定转基因植物。传统的鉴定分离转化细胞的方法大都是“负向筛选”，常用的筛选基因如抗生素标记Npt II基因(产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉素、G418、巴龙霉素、新霉素)、HPT基因(产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素)，抗除草剂基因Bar基因(产生PPT乙酰转移酶，抗 Bialaphos或glufosinate)等，在添加了筛选剂的培养基上，转化细胞能够生长，而未转化细胞的生长则受到抑制甚至被杀死。随着转基因产品的商业化，转基因的生物安全尤其是筛选标记的生物安全受到广泛关注。负向筛选标记基因的潜在危害在于抗除草剂基因可能会导致超级杂草的产生； 抗生素抗性基因可能会逃逸到环境中进行传播，也有可能通过食物在肠道中水平转移至微生物，从而影响抗生素治疗的有效性；另外一方面，非转化细胞在逐渐凋亡过程中能够分泌毒素或生长抑制剂，阻碍营养物质向转化细胞的运输，从而影响转化细胞的增殖及分化。鉴于负向筛选基因的各种不利因素，正向选择方法应运而生。所谓正向筛选是相对于负向筛选而言的，即在筛选培养基上，转基因细胞能够有效利用培养基中的碳源正常生长，而非转化细胞不能利用培养基中的唯一碳源受到饥饿抑制。常用的正向筛选基因如糖代谢酶基因木糖异构酶基因(xylA)，甘露糖磷酸异构酶(PMI)和氨基酸代谢酶如谷氨酸-1-半醛转氨酶基因(heml )，这种筛选方法没有毒素物质，不影响转化细胞的生长和再生，而且很多报道表明正向筛选方法比负向筛选有着更高的筛选效率。但是，利用这些糖类做唯一碳源可能会对植物细胞的再生分化产生不同于蔗糖的效应，这些都还需要进一步的研究。目前还有一些转化系统，先利用通常的选择标记筛选出初级转基因植株，然后利用转基因植株后代遗传重组使选择标记与目的基因分离，或利用位点特异酶将标记基因切除而培育出无选择标记的转基因植株。这类方法主要有三种系统共转化系统、双T-DNA边界序列转化法、特异重组酶转化系统(FLP/ FRTs.Cre/LoxP.R/ RS及GIN系统等)和转座子系统等，其中应用最广泛的是共转化法和Cre/l0X位点特异性重组系统。然而这些筛选标记的剔除技术尚处于探索阶段，所用的载体大多局限于农杆菌的T-DNA载体，也主要在模式植物如烟草和拟南芥上研究的较为成熟，要使这些技术成功应用于植物育种，还需要大量的研究工作，并针对不同植物建立相应的标记基因剔除系统。例如，对于共转化法来说，标记基因和目的基因的遗传分离经过有性世代才能实现，这不仅会增加育种时间，而且无法应用于无性繁殖的植物品种。而Cre/lox系统应用的难点在于Cre重组酶启动的时间以及如何启动Cre重组酶的表达进而消除Iox位点间的序列。其次，筛选标记的剔除法需要更高的效率以适应大规模生产应用。
另外一种安全的筛选标记是荧光蛋白。荧光的发生不需要任何底物和辅助因子，其表达产物也对细胞没有任何毒性，不会影响细胞的正常生长和功能。而且，利用荧光的强度可以分辨出转基因植物的纯合性以及杂合性。第一个广泛应用的荧光蛋白是绿色荧光蛋白 (GFP)，GFP用于植物转化中的筛选标记已经申请专利(US6486382，EP0904371B1)。但是绿色蛋白本身还是有很多缺点的，它的发射波普限制在440 529nm,激发和发射波谱太短， 能够激发细胞内某些物质发生荧光，造成细胞内荧光成像背景较高。1999年报道了第一个红色荧光蛋白drFP583(DsRed)，其优点显而易见与GFP 系列荧光蛋白共用，且激发和发射波长更长，细胞内成像背景低，因此迅速被关注。短短数年，对红色荧光蛋白的一系列研究，不同野生型的红色荧光蛋白经过一些列体外进化，得到各种不同发射波长的突变体，发射光谱可以覆盖574nm到655nm，极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性，为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标签。然而，红色荧光蛋白作为转基因植物的筛选标记还没被报道过。基于绿色荧光蛋白基因和红色荧光蛋白基因，已经开发了大量的荧光蛋白基因突变体，它们的荧光颜色几乎涵盖了所有可见光的色谱。对原始Aequorea victoria水母中的绿色荧光蛋白的改造产生的新的蛋白，颜色从蓝到黄，都已经广泛应用于生命科学研究中。 对红色荧光蛋白DsRED的突变体研究以及一系列单体进行优化，得到了发射光在橙色和红色光谱区域内各种颜色的长波长的荧光蛋白，性能较好的单体蛋白有mCherry、mOrange 等。另外，在珊瑚虫及其亲缘物种中也发现了很多天然的各种颜色的荧光蛋白，如亮红、橘色、灰色、棕色、褐色、黄色等，极大的丰富了荧光蛋白光谱多样性，为生命科学研究提供了更多的选择。
发明内容
本项发明提供了一种红色荧光蛋白FP在水稻转化中用作筛选标记的方法，筛选出的转基因阳性苗经分子鉴定，其阳性率高达80%。因此，本项发明为植物转化提供了一种安全可靠的筛选标记。本项发明的优点在于，(1)所使用的筛选标记对植物细胞本身以及对环境都是安全的；(2)使用该筛选标记筛选出的阳性转基因苗经过分子鉴定证明其可靠性高；(3)筛选过程在荧光显微镜下操作完成，具有直观、方便的特点。本发明通过以下方案来实现首先，人工合成FP基因，并置于愈伤组织/种皮特异启动子END2下游，并与目的基因紧密串联，构建于转化载体；利用农杆菌介导的方法将构建的载体转入受体材料，并在共培养后30天内利用荧光显微镜进行三次筛选，最后得到的稳定荧光团进入分化阶段；最后，得到的转基因幼苗进一步在分子水平上进行鉴定。具体步骤包括1，构建表达载体；2，植物遗传转化；3，分子生物学鉴定。
图1显示了实施例1中植物表达载体PSPT18结构示意图。图2显示了实施例2中与农杆菌共培养后10天带红色荧光点的愈伤组织。
图3显示了实施例2中与农杆菌共培养后20天带红色荧光点的愈伤组织。图4显示了实施例2中与农杆菌共培养后30天的带红色荧光团的愈伤组织。图5显示了实施例2中分化前的荧光团愈伤组织。图6显示了实施例2中农杆菌转化后的再生植株(左边为分化阶段的再生植株，右边为转入生根培养基的再生植株)。图7显示了实施例3中部分植株的PCR鉴定(M: DNA分子量标准；负/阴性对照；+:正/阳性对照)。图8显示了实施例4中部分转基因植株的Southern blot鉴定(C 阴性对照，M: 分子量标准；质粒以转化质粒作为阳性对照)。
具体实施例方式
下文结合实施例和附图具体描述本发明的技术方案，但不限于此。本发明实施例中具体涉及两个基因，分别是FP和0sCYP704B2。FP用作报告/筛选标记基因，来源于礁珊瑚(Discosoma sp.)，它可编码红色荧光蛋白，可被激发出红色荧光，用于转基因的愈伤组织和种子的筛选，其核苷酸序列及氨基酸序列分别见SEQ ID NO. 1 和SEQ ID N0.2;0sCYP704B2为水稻内源基因，催化脂肪酸羟基化，参与花药角质单体生物合成及花粉粒外壁形成，0sCYP704B2基因转入雄性不育突变体可使其育性恢复。其核苷酸序列及氨基酸序列分别见SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4。
实施例1 构建表达载体
本发明中转化所使用的表达载体名称为PSPT18 (图1)。该载体是在pPZP基础上人工构建而来。表达载体上有2个基因表达盒一是0sCYP704B2基因表达盒，该表达盒由 0sCYP704B2基因和自身内源启动子和终止子构成。为了区别水稻本身的内源0sCYP704B2 基因及通过表达载体转化入水稻的0sCYP704B2基因，在野生型等位基因0sCYP704B2中引入3个单核苷酸突变位点(SNP)突变后转化至水稻中，这3个SNP分别在第1468、1470和 1473位碱基处，均为从G突变为C。这些改变均不影响所编码的氨基酸序列。修饰后的 0sCYP704B2基因核苷酸序列见SEQ ID N0. 3所示，其中SNP由方框标出；二是报告/筛选标记基因FP基因(见SEQ ID NO. 1)表达盒，该表达盒由来自玉米的愈伤组织/种子特异性启动子END2驱动(其核苷酸序列见SEQ ID N0. 5)，并由来自马铃薯的终止子PIN II终止转录，PIN II的核苷酸序列见SEQ ID N0. 6。载体中T-DNA区段内不含抗生素抗性标记基因和除草剂筛选标记基因。 实施例2 水稻转化
经过了以下步骤 一、种子消毒
1，去掉外皮的水稻种子在95%的乙醇里浸泡2-3分钟；
2，在含有吐温(40ul，20%Tween/100ml)的40%次氯酸钠溶液中漂洗15分钟，更换一次漂洗液，继续漂洗15分钟；
3，在不含吐温的40%次氯酸钠溶液中漂洗15分钟，更换漂洗液，继续漂洗15分钟； 4，用无菌水将种子漂洗4遍。二、愈伤诱导
在32°C光照培养箱诱导愈伤组织11天。
三、农杆菌转化
1，挑取单菌落，接至25ml新鲜制备的农杆菌培养基(添加抗生素)，280C 250-300 RPM 摇培过夜，扩培农杆菌至0. 3<0D550 <1.0 ；
2，将菌液以6000Xg离心5分钟(4°C)，轻柔重悬农杆菌至0D550= 0.1 (添力卩100 μ M AS, AS溶于DMSO的母液浓度为100mmol/L)；
3，侵染预培养的愈伤5-10分钟，每隔一定时间轻柔地翻转或摇动培养瓶； 4，取出农杆菌液，在滤纸上阴干愈伤组织。，将愈伤组织放置在铺有滤纸的共培养基平板上，每皿放置量以愈伤之间有缝隙为准；
6，于21-25 ！培养箱黑暗培养72小时。，常规方法漂洗愈伤组织后，阴干并转移至筛选培养基，于黑暗培养。四、荧光筛选
1，共培养结束后4天，可以观察转化效率。共培养结束后第10天，丢弃无荧光的愈伤组织，对发荧光的愈伤组织进行第一次分切，将发荧光的细胞团切成0. 1-0. 2mm大小，转移至新的筛选培养基。，共培养结束后第20天，第二次分切，尽量分成独立转化的细胞团，大小为 0. 1-0. 2mm，转移至新的筛选培养基。，共培养结束后第30天，第三次分切，切割标准为每个细胞团大小为0.1-0. 2mm, 转至新的筛选培养基。五、分化
1，分切三次后的愈伤在筛选培养基上长至>0. 2mm时，转移到预分化培养基，黑暗条件下培养7-10天。
2，将愈伤组织转移到分化培养基，2-3周后可见幼芽。，待小苗长至7_8cm时，转移到生根培养基，7天后炼苗、移栽。实施例3 转基因植株的PCR检测
取实施例4中的转基因水稻植株叶片，抽取总DNA。以FP基因序列为模板设计引物，对TO代转基因水稻基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物片段为789bp。扩增程序为 940C IOmin ；94°C lmin，60°C lmin, 72°C Imin ；37 循环；72°C IOmin0 正向引物序列为 5，-GGACTTGAACTCCACCAGG-3，；反向引物序列为5，-ATAATGCCAATACGACACC-3，。附图 7 为部分转基因植株PCR扩增结果，说明外源基因已整合至水稻受体基因组中。实施例4 转基因植株的Southern Blot检测
对TO代转基因水稻基因组DNA进行Southern Blot检测，以鉴定外源基因在水稻转化受体中的整合情况。取实施例4中TO代转基因水稻植株叶片，抽取总DNA。以FP基因序列中的M6bp核苷酸片段为探针，选用NEB公司的)(ba I限制性内切酶进行消化反应。酶切反应体系为 200ul 基因组 DNA15ug、NE Buffer 20ul、BSA 2ul、Xba I 4ul (20 U/ul)并用无离子水将体系补足至200 uL· 37°C温育6小时。Southern Blot检测结果表明，外源基因已整合至受体水稻基因组中。
权利要求
1.一种无抗生素和除草剂标记基因的植物遗传转化方法，该方法包括a)一段核苷酸片段，包含荧光蛋白筛选标记基因序列，所述序列紧密连接于愈伤组织和种皮特异性启动子，b)将权力要求1. a)所述筛选标记基因转入水稻雄性不育突变体的愈伤组织中，转化载体的T-DNA区域不含抗生素和除草剂筛选基因，c)筛选表达荧光的转化细胞，d)将筛选出的愈伤组织分化成转基因苗。
2.权利要求书1中所述之转基因苗所结的荧光种子。
3.权利要求书1中所述之筛选标记基因选自FP基因，绿色荧光蛋白基因和黄色荧光蛋白基因。
4.权利要求书1中所述之荧光筛选标记基因与内含3个SNP的MS^序列紧密连接。
5.权利要求书3中所述之筛选标记FP其核苷酸序列是SEQID N0:1。
6.权利要求书lb)中所述之转化载体的T-DNA区域也不含有除草剂抗性基因。
7.权利要求书1中的转基因植株包含修饰的MS^序列以及与之紧密相连的FP基因以及END2启动子。
全文摘要
本发明提供了一种利用红色荧光蛋白做筛选标记的转化方法。我们合成了FP基因并根据水稻密码子偏好性进行了修改，用它作为水稻转化和植株再生的筛选标记基因。FP基因由愈伤组织/种皮特异启动子驱动，并与目的基因紧密连接，由农杆菌介导转入水稻胚性愈伤。在共培养后的30天内利用荧光显微镜进行三次筛选。获得的转基因苗利用PCR以及Southern杂交进一步验证，结果表明，转基因苗阳性率高达80%，证明了FP作为植物转化的筛选标记是完全可行的。本发明有效降低了传统筛选标记如抗生素和除草剂抗性基因对环境和食品安全的潜在危害，是一种新型的安全的植物遗传转化筛选系统。
文档编号C12N15/82GK102199619SQ20101056355
公开日2011年9月28日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者万向元, 周君莉, 王海洋, 邓兴旺 申请人:北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司, 北京未名凯拓作物设计中心有限公司