专利名称：一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法
技术领域：
本发明具体涉及一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，属于生物信息技术领域。
背景技术：
肿瘤是一种细胞因损伤或恶变而获得无限增殖能力的疾病，肿瘤化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要手段。然而，肿瘤耐药性，尤其是获得性多药耐药性已成为当前肿瘤化疗的主要障石导(An overview of cancer multidrug resistance :a still unsolved problem, 参见 Lage, H.，et al，Cell.Mol. Life. Sci.，2008，65，3145)。绝大多数应用于临床的肿瘤化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡而产生治疗效果的，因此，抗凋亡途径是肿瘤细胞发生耐药的主要机制。鉴于细胞凋亡的重要生物学作用，科学家们深入研究后发现调控细胞凋亡通路的因素很多，一般认为主要与线粒体、Caspase家族和B-细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, 以下简称Bcl-2)蛋白家族有关。Bcl-2蛋白家族作为重要的细胞凋亡调节因子，主要在线粒体凋亡通路中发挥重要作用(The Bcl-2 family arbiters of cell survival，参见 Adams, J. M.，et al. Sci.，1998，281，1322.)。Bcl-2蛋白家族可分为促凋亡和抗凋亡两类。促凋亡和抗凋亡蛋白的共同结构特征是大部分都有保守的羧基端跨膜结构域，这个跨膜结构域可以使它们固定在不同的细胞器上面，包括核膜、内质网、线粒体外膜等。迄今为止，人们在哺乳动物中发现了约25个 Bcl-2蛋白家族成员。根据它们所含同源结构域(BHl BH4)的不同及其在细胞凋亡中的特殊作用，Bcl-2蛋白家族可分为三大类即抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等)、促凋亡蛋白(Bax、Bak等)和仅有BH3结构域的促凋亡蛋白(Bid、Bad)。抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白之间的相对平衡决定了细胞的命运。科学家们发现该家族中的抗凋亡蛋白成员(比如 Bcl-2，Bcl-Xl等)在许多恶性肿瘤(乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、急慢性白血病等)中过度表达，导致癌症治疗中无法诱导细胞凋亡的发生，从而影响肿瘤化疗和放疗的效果，以致产生耐药性。因此，Bcl-2蛋白已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点，为今后寻找新型抗肿瘤药物提供了重要方向。现有药物发现技术存在着研究周期长、耗资巨大、成功率低的缺陷。近年来，随着生物信息学的发展与计算机模拟技术的提高，许多基于计算机模拟技术的新型药物发现技术被提出，其中，基于分子对接技术的高通量虚拟筛选技术占据重要地位。
发明内容
概述针对现有技术的不足，本发明提供一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，其要点是1)模拟Bcl-2蛋白的三维结构以及活性结合位点的确定；2)建立用于虚拟筛选的小分子配体库；幻建立针对Bcl-2蛋白的计算机虚拟筛选系统；4)利用步骤3)对步骤幻的小分子配体库进行筛选，初步确定了 10个与活性位点有较高亲和能力的化合物，为研发新型抗癌药物Bcl-2抑制剂提供基础。详述本发明的具体技术方案，一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，步骤如下1) Bcl-2蛋白的结合位点的确定及三维结构的处理；2)对ZINC小分子配体进行类药性筛选，通过筛选的配体组成小分子配体库；3)利用刚性对接技术建立以Bcl-2蛋白为靶点的计算机快速筛选系统；4)运用步骤幻的计算机快速筛选系统对步骤2、中的小分子配体库进行筛选，最终筛选出10个与Bcl-2蛋白具有潜在高亲和能力的化合物。如步骤1)所述Bcl-2蛋白的结合位点的确定及三维结构的处理，步骤如下在蛋白质数据库中搜寻获得Bcl-2蛋白的三维结构(采用核磁共振技术解析获得，PDBcode :202F)，该结构为Bcl_2蛋白与阳性药物的复合物；使用SYBYL7. 3 (Tripos Inc.)分析蛋白活性位点，选择阳性化合物的三维结构A/LI0_1000，并将其抽出(见
图1)； 修复蛋白末端残基并采用Kollman All方法计算整个蛋白的电荷。如步骤2)所述，对ZINC小分子配体进行类药性筛选，通过筛选的配体组成小分子配体库，步骤如下ZINC小分子数据库是由加州大学旧金山分校药物化学系Sioichet实验室建立并维护的免费数据库。最新版本为ZINC8，拥有超过1300万个化合物；在本步骤中，我们选择了 Fragment-like片段数据库以及Analyticon天然产物数据库进行研究；类药性筛选采用里宾斯基五规则(化合物的分子量小于500道尔顿；化合物结构中的氢键给体的数量不超过5个；化合物中氢键受体的数量不超过10个；化合物的脂水分配系数的对数值IogP 在-2到5之间；化合物中可旋转键的数量不超过10个)；最终获得含约2万个化合物的小分子化合物库；使用Concord(SYBYL7. 3，Tripos Inc.)获得小分子的三维立体结构，并采用Gasteiger-HUckel方法计算电荷。如步骤3)所述，利用刚性对接技术建立以Bcl-2蛋白为靶点的计算机快速筛选系统，步骤如下建立针对Bcl-2蛋白的计算机虚拟筛选系统采用的操作系统为Wxmtu-10. 10 ；下载并安装加州大学旧金山分校发布的分子建模及分析软件 Chimera (versionl. 5. 3)；申请 Dock(version6. 1)的使用证书(http //dock, compbio. ucsf. edu/)，并下载该程序的源代码，经过编译获得可运行的二进制程序，进行安装；安装完成后，进行如下步骤a.生成靶点蛋白分子表面利用步骤1)中处理过的Bcl-2蛋白结构，使用 Chimera中的DMS程序生成分子表面，得到文件rec. ms ；b.生成负模使用Dock软件包中附带的sphgen程序去生成对接需要的球形负模，输入命令sphgen，得到文件rec. sph (步骤b需要一个INSPH文件，在Dock软件包中获得)；c.选择一簇负模进行对接步骤1)中已获得阳性化合物的结构，因此选择阳性化合物周围10埃的负模进行对接，键入下列命令“sphere_selector rec. sph ligand. mol210. 0” (此处ligand. mol2文件为步骤1)中抽出的阳性化合物)，得到文件sphere_ selector, sph ；d.身材高恒格栅首先键入命令show<box.in，其中box.in 文件包含以下内容Y5sphere_selector.sph1rec_box.pdb获得rec_box.pdb文件；运行命令“grid-i grid.in”其中grid.in文件包括以下内容
权利要求
1.一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，步骤如下1)Bcl-2蛋白的结合位点的确定及三维结构的处理；2)对ZINC小分子配体进行类药性筛选，通过筛选的配体组成小分子配体库；3)利用刚性对接技术建立以Bcl-2蛋白为靶点的计算机快速筛选系统；4)运用步骤(3)的计算机快速筛选系统对步骤O)中的小分子配体库进行筛选，最终筛选出10个与Bcl-2蛋白具有潜在高亲和能力的化合物。
2.如权利要求1所述的一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，其特征在于，如步骤1)所述，Bcl-2蛋白的结合位点的确定及三维结构的处理在蛋白质数据库中搜寻获得Bcl-2蛋白的三维结构(采用核磁共振技术解析获得， PDBcode :202F)，该结构为Bcl-2蛋白与阳性药物的复合物；使用SYBYL7. 3 (Tripos Inc.) 分析蛋白活性位点，选择阳性化合物的三维结构A/LI0_1000，并将其抽出(见图1)；修复蛋白末端残基并采用Kollman All方法计算整个蛋白的电荷。
3.如权利要求1所述的一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，其特征在于，如步骤2、所述，对ZINC小分子配体进行类药性筛选，通过筛选的配体组成小分子配体库ZINC小分子数据库是由加州大学旧金山分校药物化学系Sioichet实验室建立并维护的免费数据库。最新版本为ZINC8，拥有超过1300万个化合物；在本步骤中，我们选择了 Fragment-like片段数据库以及Analyticon天然产物数据库进行研究；类药性筛选采用里宾斯基五规则；最终获得含约2万个化合物的小分子化合物库；使用Concord(STO17. 3， Tripos Inc.)获得小分子的三维立体结构，并添加采用Gasteiger-HUckel方法计算电荷。
4.如权利要求1所述的一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，其特征在于，如步骤3)所述，利用刚性对接技术建立以Bcl-2蛋白为靶点的计算机快速筛选系统建立针对Bcl-2蛋白的计算机虚拟筛选系统采用的操作系统为Wxmtu-10. 10 ；下载并安装加州大学旧金山分校发布的分子建模及分析软件 Chimera (versionl. 5. 3)；申请 Dock(version6. 1)的使用证书(http://dock. compbio. ucsf. edu/)，并下载该禾呈序的源代码，经过编译获得可运行的二进制程序，进行安装；步骤3)的具体实施步骤a.生成靶点蛋白分子表面利用步骤1)中处理过的Bcl-2蛋白结构，使用Chimera中的DMS程序生成分子表面，得到rec. ms ；b.生成负模使用Dock软件包中附带的sphgen程序去生成对接需要的球形负模，输入命令sphgen就可以了，得到rec. sph (步骤b需要一个INSPH文件，在Dock软件包中获得)；c.选择一簇负模进行对接步骤1)中已获得阳性化合物的结构，因此选择阳性化合物周围10埃的负模进行对接，键入下列命令“sphere_selector rec. sph ligand. mol210. O” (此处ligand. mo 12为步骤1)中抽出的阳性化合物)，得到sphere_selector. sph ；d.生成格栅首先键入命令show< box. in，其中box. in文件包含以下内容Y 5sphere_selector, sphrec_box. pdb获得rec_box. pdb文件；运行命令“grid-i grid, in”其中grid, in文件包括以下内容
5.如权利要求1所述的一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，其特征在于，如步骤4)所述，运用步骤幻的计算机快速筛选系统对步骤幻中的小分子配体库进行筛选，最终筛选出10个与Bcl-2蛋白具有潜在高亲和能力的化合物；键入如下命令即可进行快速筛选docli6-i rigid, in。其中rigid, in为刚性对接配置文件，具体内容如下
6.如权利要求1所述的一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，其特征在于，如需利用步骤3)中建立的计算机虚拟筛选系统对其他化合物库进行筛选，只需将步骤4)rigid, in文件中的zinc. mol2替换成所需筛选的小分子库。
全文摘要
本发明涉及一种快速发现以Bcl-2蛋白为靶点的先导化合物的方法，包括以下步骤1)Bcl-2蛋白的结合位点的确定及三维结构的处理；2)建立用于虚拟筛选的小分子配体库；3)建立针对Bcl-2蛋白的计算机虚拟筛选系统；4)利用步骤3)对步骤2)的小分子配体库进行筛选，初步确定了10个与活性位点有较高亲和能力的化合物。采用本发明可以在短时间内发现具有潜在活性的化合物，大大提高了效率，为研发新型抗癌药物Bcl-2抑制剂提供基础。
文档编号G06F19/16GK102222176SQ201110146209
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者侯旭奔, 方浩 申请人:山东大学