制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法

专利名称：制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法
技术领域：
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种制备藻蓝蛋白类荧光蛋白 质的方法。
背景技术：
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据 其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、 藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和 变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亚基， 每个亚基中藻胆色素(phycobilin )通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白 (即o-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相 互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得 CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580咖的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发 射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素 (phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素 (phycoviolobilin，简称PVB); PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素 (phycocyanobilin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。
CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(TooleyAJ, CaiYA， Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98(19):10560 10565)。 PCB生物合成基因由力o7和pc州组成，可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产PCB (F. T. Landgraf, C. Forreiter， et al.Recombinant holophytochrome in Echerichia coli[J]. FEBSLetters，2001, 508:459-462)。与前人的方法不同，我们发现^a&e朋sp. PCC7120中a775^^效基因编码betal55裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的betal55裂合 酶。这些betal55裂合酶能催化PCB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的155位半胱氨 酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合，从而生成具有优良荧光性质的藻蓝蛋白类荧 光蛋白质。在绝大部分的蓝藻和红藻中，都存在有编码CPE脱辅基蛋白、CPC脱辅基蛋 白、APC脱辅基蛋白、betal55裂合酶以及PCB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏 PE而具有异形胞的蓝藻中存在PEC;隐藻中没有藻胆体，不存在上述基因中的APC的基 因。藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的 藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法， CN1344723， 2002.04.17。一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083， 2005.01.12)。 本方法不利用藻类作为原料，而是利用基因工程方法生产藻蓝蛋白。藻蓝蛋白类荧光蛋白 质具有优良的荧光性质，为了发展藻蓝蛋白类新型荧光探针，可以分子设计藻蓝蛋白类荧 光蛋白质。本方法为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工
程领域奠定了基础。

发明内容
本发明的目的在于提供分子设计制备新型藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法。它是应用 betal55裂合酶催化PCB与藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备藻蓝蛋白类荧光蛋 白质。将含有betal55裂合酶基因、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因和PCB生物合成酶基因的 表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过如此设计的基因工程菌生产藻蓝蛋白 类荧光蛋白质。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案是这样的 一种制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质 的方法，包括下述步骤
(1) 用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得 到betal55裂合酶表达质粒
(2) 用基因工程方法将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达 载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；
(3) 用基因工程方法将PCB生物合成酶基因力o7和pc;^或其同源基因同时克隆于第 三个表达载体中或分别克隆于第三、第四个表达载体中，得到PCB合成质粒；
(4) 将betal55裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次 转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌 发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
本发明的目的也可以这样实现 一种制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，包括下述步
骤
(1) 用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋 白基因或其同源基因同时克隆于表达载体中，得到betal55裂合酶和藻蓝蛋白类脱辅基蛋 白表达质粒；
(2) 用基因工程方法将PCB生物合成酶基因力o7和p《W或其同源基因同时克隆于第 二个表达载体中，得到PCB合成质粒；
(3) 将betal55裂合酶和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程 菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
上述的制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法中所述的宿主菌为大肠杆菌。所述的 betal55裂合酶基因是指与^7a&e朋sp. PCC7120中a〃M滞基因同源的基因。所述的 藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与^朋&e朋sp. PCC7120或尨7柳/ym^ sp. PCC7603 中cp"基因同源的基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点
1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质，大肠杆菌繁殖 快，可以大大縮短周期；
2、 与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；
3、 通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质 类似的蛋白，提取方便；
4、 方便进行藻胆蛋白分子设计，有利于发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料。


图1为本发明中A115339催化下生成的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的吸收与荧光光谱；其 中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
具体实施例方式
下面以实例对本发明作进一步详细地说明。 实施例1
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种A2a力朋朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， i/. 7a/w'/70Si/s sp. PCC7603部分序列已经测定。力朋力ae"a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M 7a/w'/70s"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^/7a6肪朋sp.PCC7120中的 a775J，效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a775JJA在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7a6ae/ a sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpcS克隆于Novagen 公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-cpC&在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻 蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pcj^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc^在pET30中是在化oRV和两个酶切位点之间；裂合酶 基因a775JJ9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^ 711和J力o I ; PCB 合成酶基因是2个(力o7和pc/力)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o/处于第一个 多克隆位点，在7VcoI和尸Wl之间，pc^在第二个多克隆位点，在yWel和屈oI之间。 基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-aL^^久pET30-cpc万和pACYCDuet-/ o7-; 《W转入大肠杆菌，当 这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基 中，37'C振荡培养至006。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L, 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、 破碎细胞后，离心收集上清液，通过NP亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋 白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。其吸收与荧光光谱见附图1中所示，其中实线为吸收光谱， 而虚线为荧光光谱。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下
从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养基， 37。C振荡培养过夜；取100pL饱和培养物，无菌转接至5raL LB培养基，37'C振荡培养至 0D6。。=0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10min;离心lmin (10000g, 4'C)弃去上清，收集沉淀菌体；用lmL预冷的O.lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体,离心 30s(10000g, 4。C)去上清，菌体沉淀用lOOpL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，放置于冰上， 加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30min， 42'C热休克90s，冰浴5niin后加入 30(VL LB培养基，37。C低速振荡培养45min，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平 板上，倒置于37'C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。
提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和； 分别从中取10(^L转接至5ral含相应抗生素的LB培养基中；37。C振荡培养至0D6oo-0. 5-0. 7 时，冰浴约30min，加入IPTG诱导表达；避光、20'C、 150转/分，表达约12小时。离心 收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表达。 实施例2
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力朋力se朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 7s加'/7asM sp. PCC7603部分序列已经测定。力朋6朋朋sp. PCC7120在GeneBank中编号
为BA000019，尨7a/MV os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^a力aey7a sp. PCC7120中的 a775义效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a775J3A在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将/!/7a&e朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc"C84S)克隆于 Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-cpc5(C84S)，在大肠杆菌中能表达 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和pcy力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-Z o7-pcj^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c; c5(C84S)在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间； 裂合酶基因W7MW在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是5g/II和J力o
I; PCB合成酶基因是2个(Z o7和pc州)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力W处于 第一个多克隆位点，在I和尸"I之间，/7C州在第二个多克隆位点，在7Vofe I和J力o
I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a775^J9、 pET30-c/ c万(C84S)和pACYCDuet-力o卜pc//1转入大肠杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB 培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋 白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例3
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^ a6ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， yK 7柳i/ os^ sp. PCC7603部分序列已经测定。力朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必Ja/w'/7o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7^站朋sp.PCC7120中的 aL 5J39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a775"J3义在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将尨7a肌'加s^ sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^克隆于 Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-c/x^，在大肠杆菌中能表达脱辅基 蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-; 《W，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c; c5在pET30中是在iboRV和J/w I两个酶切位点之间；裂合酶 基因aL 5JJ9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^^ n和Wol ; PCB 合成酶基因是2个(力o7和/ cy力)，它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o7处于第一个 多克隆位点，在AfcoI和/^I之间，pc;^在第二个多克隆位点，在/W/el和i7 oI之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a^5JJ义pET30-cpc^和pACYCDuet-力o7-; 《W转入大肠杆菌，当 这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基 中，37。C振荡培养至0D柳为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lraraol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、 破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋
白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例4
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力朋6ae/7a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， yK 7a/zuV7oms sp. PCC7603部分序列已经测定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019， J/. 7柳i/7o^Assp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力/7atee/7a sp. PCC7120中的 aL^JJ9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a7J5^J》，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将;K 7ayz7i/70s"s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/7C^(C84S)克隆 于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-cpc5(C84S)，在大肠杆菌中能 表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和/7C^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o卜/ 《W，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/ cMC84S)在pET30中是在fcoRV和i7 o1两个酶切位点之间； 裂合酶基因aWMW在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是5Wn和i7w
I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc/力)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，Z o7处于 第一个多克隆位点，在儉o I和At I之间，在第二个多克隆位点，在yWe I和J力o
I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a7/5^J久pET30-cpcj (C84S)和pACYCDuet-力o/-pc_M转入大肠杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至0D6。。为0. 5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、 破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋 白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例5
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力朋6朋/73 sp. PCC7120的全序列己经测定完成， 必7a/w'"o^As sp. PCC7603部分序列已经测定。^ a6朋/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，尨^/JU'/ ow5"sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力朋tee朋sp.PCC7120中的 a77M朋基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/7C^克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDrauet-cpc^a775M9，在大肠杆菌中能表达betal55裂合酶和藻蓝蛋白类 脱辅基蛋白B。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o/和克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o卜po^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/x^和裂合酶基因a7^^39在pCDFDuet中，c/ c5处于第一个多 克隆位点，酶切位点是￡boR I和尸"I ， a"5JJ2处于第二个多克隆位点酶切位点是A《7 II和J/ o I ; PCB合成酶基因是2个(/w/和pc^)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中， 力W处于第一个多克隆位点，在yVcoI和尸"I之间，pcj^I在第二个多克隆位点，在We I和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(3) 将pCDFDuet-cpc5 -377MW和pACYCDuet_/w7-pc/力转入大肠杆菌，当这些质 粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1画1/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、 破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋 白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例6
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^ atee朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， i/. 7a/M'/ osa sp. PCC7603部分序列已经测定。Z朋力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必7柳i/ os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋6朋朋sp.PCC7120中的 a^5M^基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/x^"斜5V克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l 中，所得质粒叫pCDFDuet-cpc^ (T斜5^-aL^"^在大肠杆菌中能表达betal55裂合酶 和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白B。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和/ c/"克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-/w/-pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpcA (T斜5V和裂合酶基因a^5M^在pCDFDuet中，cpc^ 处于第一个多克隆位点，酶切位点是和P" I ， ai75^39处于第二个多克隆位点酶 切位点是5g7II和J力ol ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc/力，它们在同一个载体 pACYCDuet-1中，力W处于第一个多克隆位点，在yVco I和尸"I之间，pc州在第二个多 克隆位点，在We I和I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，
利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(3) 将pCDFDuet-c/ c5 (T斜6V-aW5"9和pACYCDuet-力0/-;^///转入大肠杆菌，当
这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37'C振荡培养至ODe。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-13-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1垂1/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小 时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、 破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋 白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例7
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种/)/ a6ae朋sp. PCC7120的全序列巳经测定完成， M 7柳i/70Si/s sp. PCC7603部分序列已经测定。///7a&e/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，i/. 7柳i/ owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7a6a朋a sp. PCC7120中的 a775^^效基因和复^肌'/70SiAs sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c;x^克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-cpc&a7^"Jc^，在大肠杆菌中能表 达betal55裂合酶和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白B。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-; cW，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5和裂合酶基因a775JJ9在pCDFDuet中，cpcA处于第一个多 克隆位点，酶切位点是^cdU和尸WI ， aL^J，效处于第二个多克隆位点酶切位点是^^
II和Z力o I ; PCB合成酶基因是2个(Z W和pcW)，它们在同一个载体pACYCDuet-l中， 力o7处于第一个多克隆位点，在辰ol和尸"I之间，/7C州在第二个多克隆位点，在Afcfe
I禾口 /力o1之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(3) 将pCDFDuet-cpc5 -a77MW和pACYCDuet-Z o7-pcW转入大肠杆菌，当这些质 粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、 破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋 白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例8
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力/7a6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 必7a肌'/ os〃s sp. PCC7603部分序列己经测定。A a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，髮Ja啦'/70SiA9sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将J刀s力se/^ sp.PCC7120中的 a775J39基因和M 7a/zu'/7osi/s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5 (r《^SV 克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-cpcA (T斜5V -377533《 在大肠杆菌中能表达betal55裂合酶和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白B。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和； c^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o wA在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因"斜5V和裂合酶基因a"5M9在pCDFDuet中，a:W5V 处于第一个多克隆位点，酶切位点是^boR I和I ， a/75^，效处于第二个多克隆位点酶 切位点是5^ n和化ol ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc^)，它们在同一个载体 pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间，pc/Z在第二个多 克隆位点，在We I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(3) 将pCDFDuet-cpc5 (TW5V -aW5^9和pACYCDuet-力W-p《W转入大肠杆菌，当 这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside,简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2CTC至37。C振荡表达约12小 时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、 破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋 白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例9
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力/7a力3e/7a sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 7a肌'/70s〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。Z/7aZ 朋/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号
为BA000019，必7a/wV os〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^73&朋a sp.PCC7120中的 a7753J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a77533A在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将力朋力se朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^克隆于Novagen 公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-c/ c5，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻 蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pcW，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5在PET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶 基因a"幻W在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是i5^II和J力ol ; PCB 合成酶基因是2个(Z o7和/ c/力)，hol在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在 〃co I和尸"I之间，pc州在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在AWe I和i7 o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a^5^3久pET30-cpc5和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pc州转入大肠 杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的 LB培养基中，37'C振荡培养至OD6oo为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p_D-半乳糖苷 (isoprophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例10
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力朋Z7a朋a sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 7a/w'/ os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号
为BA000019，M Ja/M'; owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254, 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^^/7ae/73 sp. PCC7120中的 aW5^^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-aW53J"在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将/J朋6ae/7a sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^ (T6^S9克隆于 Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-cpc^ ^7<^5V，在大肠杆菌中能表 达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01 。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc^，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5 O^^SV在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间； 裂合酶基因s775J，效在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^^HI和i7 o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和/ c^)，力。7在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位 点，在Afco I和尸"I之间，pc/力在pETDuet-l中第二个多克隆位点，在AWe I和Z力o I 之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-aWM^A pET30-cpc5 "斜5V禾卩pACYCDuet—力o厶pETDuet-pcj^ 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例11
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^a&e朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必7柳i/705Y/s sp. PCC7603部分序列已经测定。^ a/fee/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M 2a/w'/ owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^s6朋朋sp.PCC7120中的 a775"J(效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a775J3义在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将，髮7a肌'/7os^ sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因克隆于 Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-cpc5,在大肠杆菌中能表达脱辅基 蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o/，在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcjvl克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-; c州，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/ c"在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶 基因a"M滞在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是5WII和; PCB合成酶基因是2个(力W和/ c/力)，hol在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在 Wco I和At I之间，pcj^在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在AWe I和i7 o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段, 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，
利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a^5^J久pET30-cpcA和pACYCDuet-pETDuet -; cj^转入大肠 杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的 LB培养基中，37。C振荡培养至OD6oo为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例12
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^7a&e朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， yK 7a肌'/70SiA9 sp. PCC7603部分序列已经测定。力朋力a朋a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，尨7柳i/7os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋&e朋sp.PCC7120中的 3775J^效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-W75JJA在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将力朋力ae朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^ 克隆于 Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-cpc^ (C84S)，在大肠杆菌中能表 达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01 。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc州克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pc/A在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5 "6^ J在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间； 裂合酶基因W75^J9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是5《711和i o I; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcj^)， hol在pACYCDuet-l中，处于第一个多克隆位 点，在I和尸"I之间，pcj^在pETDuet-l中第二个多克隆位点，在Afefe I和J力o I 之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a775JM、 pET30-cpc5 (T斜W和pACYCDuet-力o入pETDuet-转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-卩-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L, 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例13
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^ a6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， M 7a/w'/7os〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。/)朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000(H9，必7湖uVmm9sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254, 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力朋6ae朋sp. PCC7120中的 a775539基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-aL^3J"在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7a6ae朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5克隆于Novagen 公司的表达载体pC0LADuet-l中，所得质粒叫pCOLADuet-cpcA在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-Z o7-pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5在pCOLADuet-l第一个多克隆位点，在EcoR I和Pst I两个 酶切位点之间；裂合酶基因s^5^^^在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点 是^g7II禾口 J/w I ; PCB合成酶基因是2个(Z o7和pcW)，它们在同一个载体pACYCDuet-1 中，力o7处于第一个多克隆位点，在辰ol和户"I之间，pc^在第二个多克隆位点，在 Wcfel和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，
利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-aWMJA pCOLADuet-cpc^和pACYCDuet-/ o7-pc/力转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37t:振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小 时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、 破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋 白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例14
(1)从GeneBank中可以査到，藻种力朋6ae朋sp. PCC7120的全序列己经测定完成， 尨7a/wV70s"s sp. PCC7603部分序列已经测定。^ a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M ^/zu'/70s〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋6ae朋sp. PCC7120中的 a775^39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a7753JA在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^7aZ^e朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c;x^(C84S)克隆于 Novagen公司的表达载体pCOLADuet — l中，所得质粒叫pC0LADuet-cpc5(C84S)，在大肠 杆菌中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o卜pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/ c夙C84S)在pC0LADuet-l第一个多克隆位点，在EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因W^^^^在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶 切位点是5WII和/力o1 ; PCB合成酶基因是2个(力o/和/7cy力)，它们在同一个载体 pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和尸Wl之间，pc州在第二个多 克隆位点，在AWe I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a775^3久pC0LADuet-c; c5(C84S)和pACYCDuet-/ o7-pcjvl转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0K。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例15
(1)从GeneBank中可以查到，藻种sp.PCC7120的全序列已经测定完成， M 7a/w'/ os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。力朋6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，vK 7a/w'"os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^ s力ae;73 sp. PCC7120中的 aL 55J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-3L 5J3A在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将#. 7柳i/7oms sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^克隆于 Novagen公司的表达载体pCOLADuet-l中，所得质粒叫pC0LADuet-cpc5，在大肠杆菌中能 表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(Zw7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o/-pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5在pCOLADuet-l第一个多克隆位点，在EcoR I和Pst I两个 酶切位点之间；裂合酶基因a^5^J^在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点 是^"7II和Z力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc/"，它们在同一个载体pACYCDuet-1 中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afcol和Atl之间，pc^在第二个多克隆位点，在 肠I禾口勘I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a^5^3A pC0LADuet-cpc5和pACYCDuet-/ o/-pc_M转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至0D卿为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(5-D-半乳糖苷(isoprcDphyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1腸1/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、 破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋 白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例16
(1)从GeneBank中可以查到，藻种力朋6朋朋sp.PCC7120的全序列己经测定完成， yK 7aTW'/jos"s sp. PCC7603部分序列已经测定。^7a/ 朋朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必7a历i/ o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋&e朋sp.PCC7120中的 3L^ ^效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a775JJA在大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将尨^3/w'/7o iA9 sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c; c^(C84S)克隆 于Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-cpc万(C84S),在大 肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和pc/力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-/ o7-pc^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5(C84S)在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因a^5JJ^在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶 切位点是5g/n和; PCB合成酶基因是2个(力W和pc州)，它们在同一个载体 pACYCDuet-1中，力o/处于第一个多克隆位点，在yVcoI和尸"I之间，pc/力在第二个多 克隆位点，在I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a^5^J久pCOLADuet-cpc/ (C84S)和pACYCDuet-转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-13-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmraol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B:离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例17
(1)从GeneBank中可以査到，藻种^朋力ae/ a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必7<a7wV7a As sp. PCC7603部分序列已经测定。^7a6s朋a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必2a肌Vjos"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^a力ae/7s sp.PCC7120中的 a77MJ9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-W75^J义在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将力朋力ae朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/ c^克隆于Novagen 公司的表达载体pCOLADuet-l中，所得质粒叫pCOLADuet-cpcA在大肠杆菌中能表达脱 辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达HOl。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 / c^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-/7C/A在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5在pC0LADuet-1第一个多克隆位点，在^boR I和尸"I两个 酶切位点之间；裂合酶基因aL 5^39在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点 是ife^II和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc州)，hol在pACYCDuet-1中，处于 第一个多克隆位点，在I和户W I之间，； cj^在pETDuet-l中第二个多克隆位点，在 她I禾口勘I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a775^J久pC0LADuet-cpt^和pACYCDuet-/ o厶pETDuet -pc/Z转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37。C振荡培养至OD咖为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例18
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^a6ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必J柳&o犯s sp. PCC7603部分序列已经测定。^73力朋/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M h孤'/70犯ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7s&e/7a sp.PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a^^5^J"在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^ a6ae朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^ ^:6^5V克隆于 Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-cpc5 (C84S),在大肠 杆菌中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 j9Q^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-/ c/A在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因c; ci9 "斜W在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在￡boR I和/^t I两个酶切位点之间；裂合酶基因aW5^39在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶 切位点是5《711和J/w I ; PCB合成酶基因是2个(Z o7和pc/力，hoi在pACYCDuet-1中， 处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间，pc/z!在pETDuet-1中第二个多克隆位点， 在AWel和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-W75JJ久pCOLADuet-cpc5(T6^^和pACYCDuet-力o7、 pETDuet-; c/力
转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(isoprophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例19
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^ a&e朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必Ja/w'/ os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。^a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必h肌'/ os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7stee/ a sp.PCC7120中的 aWAX效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a775"JJ义在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将，尨Js啦'/7o仰s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc万克隆于 Novagen公司的表达载体pCOLADuet-l中，所得质粒叫pCOLADuet-cpc&在大肠杆菌中能 表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc/A在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/ c5在pC0LADuet-l第一个多克隆位点，在^coR I和I两个 酶切位点之间；裂合酶基因aW5J3P在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点 是5^711和X力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和/ c/Z)， hol在pACYCDuet-1中，处于 第一个多克隆位点，在/Vcol和之间，pc/力在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在 AWeI和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-a77MW、 pCOLADuet-c/ c5和pACYCDuet—力o厶pETDuet-pc/力转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例20
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^ aZ ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， #. 7柳i/ os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。力/3a力ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，尨Ja肌'/7os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将sp.PCC7120中的 a775^^9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-aL^3J^，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将/J朋Z ae朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/ c5 "斜59克隆于 Novagen公司的表达载体pC0LADuet-1中，所得质粒叫pC0LADuet-cpc5 (C84S)，在大肠 杆菌中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01 。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-; c州，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/ c5 "斜5J在pC0LADuet-1第一个多克隆位点，在￡boR I和尸" I两个酶切位点之间；裂合酶基因a775^39在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶 切位点是和i7 o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和/ c/力)，hol在pACYCDuet-1中， 处于第一个多克隆位点，在Afcol和尸"I之间，； c州在pETDuet-1中第二个多克隆位点， 在7^/el和i7 o1之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a775JJ久pC0LADuet-cpc^(^ ^5V和pACYCDuet—/w人pETDuet—pc_K/4 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-13-D-半乳糖 苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的betal55裂合酶、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白、藻 蓝胆素生物合成酶基因或其同源基因以及链霉亲和素基因来制备链霉亲和素标记的藻蓝 蛋白类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了GenBank中已公开 全序列的蓝藻^朋6ae朋sp. PCC7120和已经部分测序的2a肌'770s"s sp. PCC7603为例对 本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开的内容采用其它原料实施本发 明。
权利要求
1. 一种制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于包括下述步骤(1)用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到betal55裂合酶表达质粒；(2)用基因工程方法将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；(3)用基因工程方法将PCB生物合成酶基因hol和pcyA或其同源基因同时克隆于第三个表达载体中或分别克隆于第三、第四个表达载体中，得到PCB合成质粒；(4)将betal55裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
2. —种制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于包括下述步骤-(1) 用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋 白基因或其同源基因同时克隆于表达载体中，得到betal55裂合酶和藻蓝蛋白类脱辅基蛋 白表达质粒；(2) 用基因工程方法将PCB生物合成酶基因力o/和pc/力或其同源基因同时克隆于第 二个表达载体中，得到PCB合成质粒；(3) 将betal55裂合酶和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依 次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程 菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的betal55裂合酶基因是指 与^ a/ ae/7S sp. PCC7120中a^5^J^基因同源的基因。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基 因是指与J朋6ae朋sp. PCC7120或hffliVwstAS sp. PCC7603中cpc5基因同源的基因。
全文摘要
本发明公开了一种制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，通过应用藻胆蛋白beta155裂合酶催化藻蓝胆素与藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。
文档编号C12N15/09GK101412997SQ20071003088
公开日2009年4月22日 申请日期2007年10月17日 优先权日2007年10月17日
发明者佟顺刚, 明 周, 坤 夏, 赵开弘 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司;华中科技大学