专利名称：：一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切葡聚糖酶和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切葡聚糖酶和应用。
背景技术：
：内切葡聚糖酶((3-l,4-内切葡聚糖酶，Endoglucanase/Endo-l，4-p-Glucanase，EC3.2丄4)是纤维素酶酶系的重要组分，可将纤维素分子从内部即在|3-1,4糖苷键将其切断。按催化反应的最适pH值，内切葡聚糖酶可以分为酸性内切葡聚糖酶(最适pH35)、中性内切葡聚糖酶(最适pH68)和碱性内切葡聚糖酶(最适pH810)。酸性内切葡聚糖酶主要由丝状真菌产生，其产生菌主要包括里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉等。酸性内切葡聚糖酶研究最早，然而，随着工业应用范围的不断扩展和应用研究的不断深入，酸性内切葡聚糖酶也显现出诸多不足。如中碱性条件下酶活性较低或根本没有活性、稳定性较差、pH值适应范围窄，而且在酸性条件下处理纺织品后会产生退色现象等，这极大限制了内切葡聚糖酶在碱性洗涤剂、纺织品酶洗整理等工业中的应用。由细菌产生的内切葡聚糖酶主要是中性和碱性内切葡聚糖酶，在中性和碱性条件下均具有一定的酶活性及稳定性。与由真菌产生的酸性内切葡聚糖酶相比，中性和碱性内切葡聚糖酶具有pH值适应范围广、稳定性好、可耐受高温等优点。作为洗涤用酶可使衣物经多次洗涤后手感、外观等保持鲜艳，不易造成纺织品退色等，在纺织、洗涤剂等工业中应用前景广阔。因此，就洗涤剂、纺织等工业而言，由细菌产生的中性和碱性内切葡聚糖酶有着传统酸性内切葡聚糖酶无可比拟的优越性。目前，对细菌产内切葡聚糖酶的分离纯化研究相对较少，而对细菌产中性内切葡聚糖酶的分离纯化的研究尚未见报道。当前，对于碱性内切葡聚糖酶的研究主要存在菌株产酶能力和酶比活力低或耐金属离子和表面活性剂及热等能力差等诸多不足。同时，嗜碱芽孢杆菌主要产生一些碱性酶类，迄今尚未见嗜碱菌产生中性内切葡聚糖酶的报道。
发明内容为了解决上述现有技术存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种嗜碱芽孢杆菌sp.III-3。该嗜碱芽孢杆菌可产生一种中性内切葡聚糖酶和一种碱性内切葡聚糖酶。本发明的另一目的在于提供上述嗜碱芽孢杆菌^^7/wsp.III-3产生的优质中性内切葡聚糖酶和碱性内切葡聚糖酶。它们均具有pH适应范围广、热稳定性好、耐金属离子和表面活性剂等适用于纺织和洗涤剂等工业的优良酶学特性。本发明的再一目的在于提供上述中性内切葡聚糖酶和碱性内切葡聚糖酶的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种嗜碱芽孢杆菌，是从造纸厂碱性淤泥中筛选得到的产内切葡聚糖酶菌株万a"7/wsp.III-3。所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2007年8月22日，保藏号CGMCCNo.2138。菌种形态特征菌、落圆形，浅黄色，半透明，革兰氏染色阳性，显微镜下观察个体形态为较细长杆状，次端生芽孢。该菌株的培养基配方(下述均为质量百分比)1%复合蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl，0.1%KH2PO4，0.25%Na2HPO4*12H2O，2%CMC-Na，0.5%Na2CO3(分开灭菌)，固体培养基加1.5%的琼脂，培养pH值710，培养温度3037°C。所述嗜碱芽孢杆菌万""7/wsp.III-3产生的碱性内切葡聚糖酶III-3-A，按下述方法制得(1)菌种液体发酵培养将嗜碱芽孢杆菌万aa7/z^sp.III-3菌种接到50mL液体发酵培养基中，于3035°C、150r/min条件下培养48h;将48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH8.0Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液。(2)IH-3-A酶蛋白的分离纯化(a)离子交换层析将50mL的粗酶液加到预先用pH8.0Tris-HCl缓冲液充分平衡的DEAE-SepharoseCL-6B层析柱，依次用含0.4M、0.45M、1MNaCl的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，并收集有酶活的洗脱峰，将此酶活峰收集、合并、透析、浓縮后进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。(b)凝胶过滤层析将DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析所得的酶活峰透析浓縮，通过Hiload16/60Superdex200pg预装柱进行凝胶过滤层析。先用两倍柱体积的pH8.0Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，待基线稳定后取10mL样品上样，收集凝胶过滤层析的酶活峰并通过透析浓縮，得到碱性内切葡聚糖酶III-3-A酶蛋白。所述III-3-A酶蛋白编码的氨基酸序列如下MMLRKKTKOLISSTULVLLLSLFPTALAAEGNTREDNFNHLLGNDNVKRPSEAGALOLOENGYASNPDLIKSRV腦IDLAIENDMYVIVDWHVHAPGDPRDPVYAGAEDFFREIAALYPNNPHnYELANEPSSNNNGGAGIPNNEEGWNAVKEYADPrVEMLRESGNAD應nVGSP酵SORPDLAADNPIDDHHTMYTVHFYTGSHAASTESYPPETPNSERGNVMSNTRYALENGVAWATEWGTSOASGDGGPYFDEADVW正FLNENNISWANWSLTNKNEVSGAFTP孤EAIAMHAENNNMNNIILFVGTDAADVIYL画KVIGTEVEIPVVHNPKGEAVLPSNFEDGTROGWDWAGESGVKTALT正EANGSNALSWEFGYPEVKPSDNWATAPRLDFWKSDLVRDPGEEAPPVDEKEAAKEEREAARGAEKEEREAVKAEREVAREAAKEERETAKEEKKEAT所述碱性内切葡聚糖酶III-3-A酶蛋白的MALDI-TOF质谱分析得到质荷比分别为1355.6392、1449.6802、1484.7736、1531.7273、1582.8152、1754.8843、1874.9072、2062.0493、2126.0027、2211.0094、2367.2075、2953.2473、3428.5294的特征峰。碱性内切葡聚糖酶III-3-A蛋白分子量约为89kD，等电点约为4.3，比活力约为420U/mL;最适pH为8.010.0左右；在pH6ll的范围内，酶活性均可保持80%以上；最适反应温度为4050。C左右；具有耐Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe"或Ca"等金属离子的良好特性，SDS对III-3-A的酶活性有部分抑制作用，但螯合剂EDTA或EGTA对酶活性影响甚微。将碱性内切葡聚糖酶ni-3-A置于终浓度为0.1。/。的洗涤剂(立白洗衣粉)中保存10min后其残余酶活高达到80%以上，表明III-3-A酶性质优良，符合洗涤剂和纺织等工业用酶的基本要求。所述嗜碱芽孢杆菌s"c///^sp.m-3产生的中性内切葡聚糖酶in-3-B，是按下述方法制备的(1)菌种液体发酵培养将嗜碱芽孢杆菌S"c///"ssp.III-3菌种接到50rnL液体发酵培养基中，于3035°C、150r/min条件下培养48h，将培养48h的发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液。(2)m-3-B酶蛋白的分离纯化(a)疏水层析用平衡液为含1M硫酸铵的pH8.0Tris-HCl缓冲液对PhenylS邻harose6FastFlow(highsub)疏水层析柱平衡后，将万ac/〃wsp.III-3菌培养48h的粗酶液12000r/min离心后取上清液上样，先用含0.1M(NH4)2S04的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行阶段洗脱后，再用不含硫酸铵的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集酶活峰。(b)III-3-B离子交换层析将上述酶活性峰收集到的样品合并、透析后，上预先用pH8.0Tris-HCl平衡液充分平衡的DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱，先用NaCl浓度为0.3M的pH8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，再用NaCl浓度为0.35M的pH8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集酶活峰，得到中性内切葡聚糖酶m-3-B蛋白。所述中性内切葡聚糖酶III-3-B的MALDI-TOF质谱分析得到质荷比分别为1355.6392、1449.6802、1484.7736、1531.7273、1582.8152、1754.8843、1874.9072、2062.0493、2126.0027、2211.0094、2367.2075、2953.2473、3428.5294的特征峰。中性内切葡聚糖酶III-3-B蛋白分子量约为45kD;最适pH为68左右；最适反应温度为405(TC左右；对Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe"或Ca2+等金属离子及SDS、EDTA或EGTA等表面活性剂均具有良好的耐受性，表明III-3-B酶性质优良，符合洗涤剂和纺织等工业用酶的基本要求。所述嗜碱芽孢杆菌S"ci//z^sp.III-3产生的碱性内切葡聚糖酶III-3-A在洗涤剂或纺织品等工业中的应用。所述嗜碱芽孢杆菌Sa"7/"ssp.III-3产生的中性内切葡聚糖酶III-3-B在洗涤剂或纺织品等工业中的应用。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果(1)本发明所筛选到的^^7/^sp.in-3属于嗜碱的极端微生物。与当前工业用酶菌株相比，其可在高碱性条件下(pH9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。(2)本发明嗜碱芽孢杆菌S^/7/msp.III-3产生的碱性内切葡聚糖酶III-3-A比活力达420U/mL;III-3-A酶最适pH为8.010.0左右；在pH611的范围内，酶活性均可保持80%以上；在55t:以下酶活性稳定。碱性内切葡聚糖酶III-3-A酶蛋白具有耐Na+、K+、Mg2+、Cu2+、F^+或C^+等金属离子及EDTA或EGTA等的良好特性。将碱性内切葡聚糖酶III-3-A置于终浓度为0.1%的洗涤剂(立白洗衣粉)中保存10min后其残余酶活高达到80%以上，表明碱性内切葡聚糖酶性质优良，在洗涤剂及纺织等工业中具有非常良好的应用前景。本发明可填补目前在研究碱性内切葡聚糖领域所存在的诸如酶比活力低或耐金属离子和表面活性剂及热等能力差等不足。(3)嗜碱芽孢杆菌主要产生一些碱性酶类，迄今尚未见嗜碱菌产生中性内切葡聚糖酶的报道。嗜碱芽孢杆菌Sac///^sp.III-3产生的中性内切葡聚糖酶III-3-B对Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe^或。32+等金属离子及SDS、EDTA或EGTA等表面活性剂均具有良好的耐受性。m-3-B酶在纺织品酶洗整理及洗涤剂等工业中具有非常重要的应用价值。根据质谱分析结果结合酶学特性层面分析，中性内切葡聚糖酶m-3-B为一个新发现的优质中性内切葡聚糖酶蛋白。图1为碱性内切葡聚糖酶III-3-A分离纯化的SDS-PAGE电泳图谱。其中，1:Hiload16/60Superdex200pg酶活峰；2:DEAESepharoseCL6B酶活峰；3:粗酶液；M:Marker。图2为中性内切葡聚糖酶III-3-B分离纯化的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图-i並"V曰o1:Marker,由上到下分别为120KD、79KD、46KD、41KD、31KD、14KD;2:粗酶液；3:PhenylSepharoseFastFlow(highsub)疏水层析的酶活峰；4、5、6:DEAESepharoseFastFlow离子交换层析酶活峰，不同上样量，分别为8、15、30nL。图3为碱性内切葡聚糖酶III-3-A的MALDI-TOF质谱分析图谱。图4为中性内切葡聚糖酶III-3-B的MALDI-TOF质谱分析图谱。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。(一)材料1.菌种嗜碱芽孢杆菌5"cz7/^sp.III-3是从造纸厂碱性淤泥中筛选得到的产内切葡聚糖酶菌株。菌种保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2007年8月22日，保藏号CGMCCNo.2138。2.培养基(质量百分比)斜面培养基1%可溶性淀粉、0.5%复合蛋白胨、0.5%酵母粉、0.1%KH2PO4、0.02°/。MgSO47H2O、l%NaCl、0.5%Na2CO3(分开灭菌)、1.5%琼脂。液体发酵培养基1%复合蛋白胨、0.5%酵母粉、0.5%NaCl、0.1%KH2PO4、0.25%Na2HPO4'12H2O、2.0%CMC-Na、0.5%Na2CO3(分开灭菌)。3.主要试剂疏水层析介质PhenylSepharose6FastFlow(highsub)，离子交换层析介质DEAESepharoseFastFlow和DEAESepharoseCL-6B)凝胶过滤层析介质Superdex75prepgrade,凝胶过滤层析柱Hiload16/60Superdex200pgColumn均购自AmershamPharmaciaBiotech.,Uppsala,Sweden公司。BCA蛋白质定量测定试剂盒K3001,购自上海申能博采生物科技有限公司。Acrylamide、N,N-甲叉双丙烯酰胺由Serva进口分装。其它化学试剂均为市售分析纯。(二)实验方法1.菌种液体发酵培养将嗜碱芽孢杆菌sp.III-3菌种由斜面接到50mL(250mL三角瓶)种子液体培养基中，于35"C、150r/min下培养4h，制成种子液。然后按2%体积的接种量将种子液加到50mL(250mL三角瓶)液体发酵培养基中，于32°C、150r/min条件下培养48h。将48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH8.0Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液，并置于-2(TC保存备用。2.酶活性(CMC酶)测定取1。/。的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液lmL作为底物，加入0.1mL上述酶溶液，在40'C下反应30min，中性内切葡聚糖酶活力测定控制反应pH值为7.0,碱性内切葡聚糖酶活力测定控制反应pH值为9.0。终止反应后，用DNS法于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每小时由底物产生l.Omg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用U/mL表示。菌体浓度采用比色法进行测定。将稀释的菌液于600nm波长下测定吸光值，对照采用同样稀释度的培养基。3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按常规方法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶、浓縮胶浓度分别为12%和5%，电极缓冲液为pH8.3Tris-Gly缓冲液，考马斯亮蓝染色。4.蛋白浓度测定方法使用上海申能博采生物科技有限公司生产的BCA蛋白质定量测定试剂盒K3001测蛋白浓度。5.m-3-A蛋白的分离纯化(1)离子交换层析离子交换层析的介质为DEAESepharoseCL-6B。缓冲液体系采用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为pH8.0Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl的pH8.0Tris-HCl缓冲液。取100ml凝胶小心灌入层析柱(02.6cmx30cm)中，使凝胶均匀且无气泡。用300ml的平衡液进行平衡，直至A280稳定后上样(粗酶液)，待穿透峰出现之后开始洗脱。用含不同浓度NaCl(0.4M、0.45M、1M)的pH8.0Tris-HCl以180mHi'1的流速进行梯度洗脱，收集酶活峰，透析过夜。(2)凝胶过滤层析凝胶过滤层析柱为Hiload16/60Superdex200pgColumn。缓冲液体系采用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液。将离子交换层析所得酶活峰透析后用PEG-20000进行浓缩，取lOmL上预先用pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡好的层析柱，以60ml'h-1的流速用0.01MTris-HClbuffer(pH8.0)洗脱，收集具有CMC酶活性的洗脱峰，并置于4"C保存备用。6.m-3-B蛋白的分离纯化(1)PhenylSepharose6FastFlow(highsub)疏7JC层析层析介质为PhenylSepharose6FastFlow(highsub)。缓冲液体系采用pH8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为含1M硫酸铵的pH8.0Tris-HCl缓冲液，洗脱液为不含硫酸铵的pH8.0Tris-HCl缓冲液。取10mL凝胶小心灌入层析柱(02.6cmx30cm)中，用含1M硫酸铵的pH8.0Tris-HCl平衡液进行平衡，直至A280稳定后上样(粗酶液)，待穿透峰出现后，用不含硫酸铵的pH8.0Tris-HCl进行洗脱，收集酶活峰，透析过夜。(2)DEAESepharoseFastFlow离子交换层析层析介质为DEAESepharoseFastFlow,缓冲液体系采用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为pH8.0Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaClpH8.0Tris-HCl缓冲液。用300ml的平衡液对层析柱进行平衡，直至A280稳定。然后把疏水层析所得酶活峰透析后加入到平衡好的层析柱上，用含NaCl的pH8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集具有CMC酶活性的洗脱峰。7.质谱分析样品经胰蛋白酶处理后采用MALDI-TOFMS，并用ABI4700proteomicsanalyzer(AppliedBiosystems，Framingham，MA)进行处理。所得质谱数据用AppliedBiosystemsDataExplorersoftwarepackage进行搜索。质谱分析的样品制备过程如下(1)将酶蛋白SDS-PAGE电泳，切下目的蛋白的条带并收集于1.5mL微型离心管中(在安静空气流通不大的地方)。(2)加入50c/o乙氰-25mMNH4HC03(约150pl)反复脱色、温控摇床中操作，每隔半小时一次，共五次。然后在37r条件下，离心400gX515min，风干。(3)加入1.5mg/mlDTT-25mMNH4HC03100300pl(新鲜配制)，56。C水浴浸泡或者温控振荡(300rmp)lh，弃去上清液。(4)加入10mg/mlIAA-25mMNH4HCO3100300^1(新鲜配制，避光)，37。C暗室浸泡45min，弃去上清液。(5)用100mMNH4HCO3冲洗一次，10min，然后弃去上清液。(6)加入50。/。乙氰-25mMNH4HCO3100300|il，然后指弹振荡5min，弃去上清液(除尽)，过夜，干燥至极干燥为止。(7)加入7pl0.1mg/mL胰蛋白酶和100pl100mmol/LNH4HC03水溶液使胶充分浸润，振荡后在37"C下保温2h。(8)充分酶解后，加入200pL0.2。/。的三氟乙酸(TFA)，在800run/min、4(TC下振荡2h，收集上清于新的微型离心管。剩余的胶加入200iuL0.2。/。TFA(三氟乙酸)后于800r/min、40。C下振荡4h，累积上清于同一微型离心管中。(9)真空干燥，粉末采用0.2。/。TFA(三氟乙酸)溶解，所得上清即可用于质谱检测。二、实验结果(一)酶蛋白的分离纯化1.碱性内切葡聚糖酶III-3-A酶蛋白的分离纯化将所收集的凝胶过滤层析的酶活峰通过透析浓縮后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(如图l电泳图的第l泳道)，仅见一条明显的蛋白条带，说明基本达到分离纯化的要求。m-3-A分离纯化结果如表3-l所示。结果表明，该酶共提纯280倍，比活力达420U/mg，酶活回收率为16.6%。2.中性内切葡聚糖酶III-3-B蛋白的分离纯化将所收集的离子交换的酶活峰通过用PEG-20000浓縮后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(如图2)。从图2可见，电泳检测为单一蛋白条带(第4、5、6泳道)，达到分离纯化的预期效果。目的蛋白条带在疏水层析所得酶液电泳图谱和粗酶液电泳图谱中的相应位置均比较暗，说明III-3-B酶蛋白在^ac77/Msp.in-3发酵液中含量比较低。III-3-B酶蛋白的分离纯化结果见表3-1。结果表明，经过两步分离纯化后，总蛋白含量大幅下降，说明杂质蛋白被大量去除了，共提纯155倍，比活大大提高，达到232U/mg。纯化后的酶稳定性也很好，在4-C保存下，7日内酶活无显著下降。说明该中性内切葡聚糖酶性质稳定，比活力高，具有很好的应用价值。_表3-1III-3-A和III-3-B的分离纯化_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>m-3-BPhenyl-Sepharose6fastflow42.60.9473119DEAE-S印harosefastflow13.90.062321556(二)m-3-A和m-3-B的酶学性质研究1.酶蛋白分子量的测定用SDS-PAGE电泳法测定，结果如图1和图2。电泳后用GelDoc2000(Bio-Rad)进行凝胶扫描。运用扫描系统自带软件QuantityOne进行分子量测定，测得碱性内切葡聚糖酶III-3-A和中性内切葡聚糖酶III-3-B蛋白分子量分别约为89kD和45kD。in-3-A属于高分子量的内切葡聚糖酶(分子量80100kD)，而III-3-B属于低分子量的内切葡聚糖酶(分子量2550kD)。2.酶的最适pH取O.lmLIII-3-A纯酶液和O.lmLlII-3-B纯酶液，分别加到不同pH值的1q%CMC-Na溶液，按常规方法测定酶活力。结果可见，m-3-A酶的最适pH为810左右，为一典型的碱性内切葡聚糖酶；而III-3-B酶的最适pH为68左右，为一典型的中性内切葡聚糖酶。III-3-A和III-3-B在弱酸性、中性和碱性(pH610)范围内均具有较高的酶活性，具有pH适应范围广的共同特点。这说明由嗜碱芽孢杆菌^/cz'〃msp.m-3产生的碱性内切葡聚糖酶III-3-A和中性内切葡聚糖酶m-3-B在洗涤剂及纺织品等工业中均具有良好的应用潜力。3.酶反应的pH稳定性为研究III-3-A和III-3-B的pH稳定性，分别将纯酶液置于不同的pH条件下保存30min，再按常规方法分别于pH9.0和7.0条件下测定其酶活力。结果表明，碱性内切葡聚糖酶III-3-A在pH611的范围内和中性内切葡聚糖酶m-3-B在59的范围内，酶活性均可保持80%以上。可见，III-3-A和III-3-B在弱酸和中碱性条件下均具较强的稳定性。4.酶的最适反应温度将III-3-A纯酶液和III-3-B纯酶液分别置于含5mMCaCl2和不含CaCl2的1%CMC-Na溶液中，分别于不同温度条件下反应20min，测定其酶活力。结果说明，III-3-A和m-3-B的最适反应温度均为405(TC左右。加入5mMCaCl2能使III-3-A和III-3-B酶的最适反应温度均提高5"C左右。5.酶的热稳定性将III-3-A纯酶液和III-3-B纯酶液分别置于含5mMCaCl2和不含CaCl2的1%CMC-Na溶液中，分别置于不同的温度条件下(3(TC8(TC)保温10min,然后于40。C反应20min测定其酶活力。结果表明，III-3-A和III-3-B酶在55°C以下均具有良好的热稳定性，显示它们在生产应用方面的良好应用前景。另外，加入Ca2+可以显著提高III-3-A在5(TC8(TC的热稳定性，使其在6(TC时仍保持较高稳定性，7(TC仍有少量酶活力；而加入Ca^对III-3-B酶的热稳定性影响甚微。6.金属离子及表面活性剂对酶活性的影响将III-3-A和III-3-B酶蛋白分别置于终浓度为lmM的各种金属离子以及0.05%EDTA，0.05%EGTA,0.01%SDS中，3(TC保存10min后按照常规方法测定其酶活力。结果表明，ni-3-A酶蛋白具有耐Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe2+或Ca^等金属离子的良好特性，SDS对III-3-A的酶活性有部分抑制作用，但螯合剂EDTA或EGTA对酶活性影响甚微；而III-3-B对上述金属离子及SDS、EDTA或EGTA等表面活性剂均具有良好的耐受性，表明III-3-B酶符合纺织及洗涤剂等工业用酶的基本要求。为进一步测验III-3-A酶在洗涤剂工业上的应用潜力，将III-3-A置于终浓度为0.1。/。的洗涤剂(市售立白洗衣粉)中保存10min后按常规方法测定其酶活力，发现其残余酶活高达到80%以上，表明III-3-A酶性质也比较优良，符合洗涤剂及纺织等工业用酶的基本要求。(三)III-3-A和III-3-B的质谱鉴定将分离纯化得到的III-3-A和m-3-B进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将条带切下，进行质谱前处理，然后进行MALDI-TOF质谱分析。碱性内切葡聚糖酶III-3-A质谱分析结果如图3。由图3得到质荷比分别为833,4243、848.4665、862.4368、878.4152、931.5079、1062.5212、1194.5828、1319.5923、1335.6595、1386.6362、2953.2993、1919.881的特征峰。将其特征峰质荷比进行数据库比对，结果发现碱性内切葡聚糖酶III-3-A与文献中5种内切葡聚糖酶具有某些同源性，在分类学上属于第5家族的内切葡聚糖酶。III-3-A蛋白的质谱分析所得的肽段由表3-2所示。表3-2的肽段氨基酸通过数据库比对进一步证实了来源于B"c"/ww.III-3的碱性内切葡聚糖酶III-3-A与下列5种碱性内切葡聚糖酶之间的某些同源性。(1)内切葡聚糖酶(内切-l,4-(3-葡聚糖酶)(来源于strainll39);(2)碱性纤维素酶(EC3.2丄4)(来源于S"d/tos/.KSM64);(3)内切-l,4-(3-葡聚糖酶(来源于丑"a7to^.NW-2004a);(4)纤维素酶(EC3.2丄4)(来源于^Sa"〃ws^7.22—28);(5)碱性纤维素酶(EC3.2丄4)(来源于5""7/w平KSM-S237)。中性内切葡聚糖酶m-3-B的MALDI-TOF质谱分析结果由图4所示。由图4得到质荷比分别为1355.6392、1449.6802、1484.7736、1531.7273、1582.8152、1754.8843、1874.9072、2062.0493、2126.0027、2211.0094、2367.2075、2953.2473、3428.5294的特征峰。然而，通过质谱数据库搜索发现，目前尚未见与III-3-B相似性较高的酶蛋白。在酶学性质方面，中性内切葡聚糖酶III-3-B具有耐热、耐金属离子和表面活性剂等特性，目前尚未发现与其酶学特性相同的内切葡聚糖酶。因此，根据质谱分析结果结合酶学特性层面分析，中性内切葡聚糖酶III-3-B为一个新的中性内切葡聚糖酶蛋白。表3-2III-3-A蛋白的质谱分析所得的肽段<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种嗜碱芽孢杆菌，其特征在于所述嗜碱芽孢杆菌是产内切葡聚糖酶菌株Bacillussp.III-3，菌种保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2007年8月22日，保藏号CGMCCNo.2138。2、根据权利要求l所述的一种嗜碱芽孢杆菌，其特征在于所述嗜碱芽孢杆菌的菌种形态特征菌落圆形，浅黄色，半透明，革兰氏染色阳性，显微镜下观察个体形态为较细长杆状，次端生芽孢；该嗜碱芽孢杆菌的培养基配方按质量百分比计为1%复合蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl，0.1%KH2PO4，0.25%Na2HPO4*12H2O，2%CMC-Na，0.5%Na2CO3，固体培养基力口1.5%的琼脂，培养pH值710，培养温度3037°C。3、权利要求l所述的嗜碱芽孢杆菌产生的碱性内切葡聚糖酶，其特征在于所述碱性内切葡聚糖酶是按下述方法制得(1)菌种液体发酵培养将嗜碱芽孢杆菌S^/ksp.III-3菌种接到50rnL液体发酵培养基中，于3035°C、150r/min条件下培养48h;将48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH8.0Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液；(2)碱性内切葡聚糖酶的分离纯化(a)离子交换层析将50mL的粗酶液加到预先用pH8.0Tris-HCl缓冲液充分平衡的DEAE-SepharoseCL-6B层析柱，依次用含0.4M、0.45M、1MNaCl的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，并收集有酶活的洗脱峰，将此酶活峰收集、合并、透析、浓縮后进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；(b)凝胶过滤层析将DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析所得的酶活峰透析浓縮，通过Hiload16/60Superdex200pg预装柱进行凝胶过滤层析；先用两倍柱体积的pH8.0Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，待基线稳定后取lOmL样品上样，收集凝胶过滤层析的酶活峰并通过透析浓缩，得到碱性内切葡聚糖酶。4、根据权利要求3所述的碱性内切葡聚糖酶，其特征在于所述碱性内切葡聚糖酶的MALDI-TOF质谱分析得到质荷比分别为833.4243、848.4665、862.4368、878.4152、931.5079、1062.5212、1194.5828、1319.5923、1335.6595、1386.6362、2953.2993、1919.881的特征峰；所述碱性内切葡聚糖酶蛋白分子量为89kD，等电点为4.3;最适pH为9.010.0;最适反应温度为4050°C;所述酶蛋白耐Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Ff或(^2+金属离子；所述碱性内切葡聚糖酶置于终浓度为0.1%的洗涤剂中保存10min后其残余酶活可高达到80%以上。5、权利要求1所述嗜碱芽孢杆菌产生的中性内切葡聚糖酶，其特征在于-所述中性内切葡聚糖酶是按下述方法制备的(1)菌种液体发酵培养-将嗜碱芽孢杆菌Sflc///^sp卫I-3菌种接到50mL液体发酵培养基中，于3035°C、150r/min条件下培养48h;将48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH8.0Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液；(2)中性内切葡聚糖酶的分离纯化-(a)疏水层析用平衡液为含1M硫酸铵的pH8.0Tris-HCl缓冲液对PhenylSepharose6FastFlow(highsub)疏水层析柱平衡后，将Sacz7/ussp.III-3菌培养48h的粗酶液12000r/min离心后取上清液上样，先用含O.IM(NH4)2S04的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行阶段洗脱后，再用不含硫酸铵的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集酶活峰；(b)中性内切葡聚糖酶离子交换层析将上述酶活性峰收集到的样品合并、透析后，上预先用pH8.0Tris-HC评衡液充分平衡的DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱，先用NaCl浓度为0.3M的pH8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，再用NaCl浓度为0.35M的pH8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集酶活峰，得到中性内切葡聚糖酶。6、根据权利要求5所述的中性内切葡聚糖酶，其特征在于所述中性内切葡聚糖酶的MALDI-TOF质谱分析得到质荷比分别为1355.6392、1449.6802、1484.7736、1531.7273、1582.8152、1754.8843、1874.9072、2062.0493、2126.0027、2211.0094、2367.2075、2953.2473、3428,5294的特征峰；所述中性内切葡聚糖酶蛋白分子量为45kD;最适pH为6.08.0;最适反应温度为405(TC;对Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+、SDS、EDTA或EGTA有耐受性。7、权利要求3所述的碱性内切葡聚糖酶在洗涤剂或纺织品工业中的应用。8、权利要求5所述的中性内切葡聚糖酶在洗涤剂或纺织品工业中的应用。全文摘要本发明公开了一种嗜碱芽孢杆菌，是从造纸厂碱性淤泥中筛选得到的产内切葡聚糖酶菌株。本发明还公开了上述嗜碱芽孢杆菌产生的中性内切葡聚糖酶和碱性内切葡聚糖酶，两种内切葡聚糖酶均可在洗涤剂或纺织品等工业中应用。本发明的嗜碱芽孢杆菌属于嗜碱的极端微生物，与当前工业用酶菌株相比，其可在高碱性条件下培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。文档编号C12N1/20GK101173230SQ20071003078公开日2008年5月7日申请日期2007年10月10日优先权日2007年10月10日发明者刘森林,苗邢,陈伟钊申请人:邢苗;刘森林;陈伟钊