专利名称：新的嗜碱芽孢杆菌菌株及其在苎麻脱胶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新的，具有以高产率产生碱性果胶酶和碱性甘露聚糖酶能力的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)菌株，其人工诱变和筛选方法，以及该菌株在苎麻脱胶中的应用。
苎麻是一种荨麻科植物，其中纤维含量在60％以上，仅次于棉花。它的韧皮纤维特别长而结实，可代替棉花，亚麻，生产各种产品，因此是一种重要的纺织工业原料。然而苎麻纤维上粘附着大量的胶质，主要是果胶，半纤维素，木质素等，根据苎麻品种的不同，其含量可高达24-45％。所以要得到工业上可利用的纤维，首先必须进行脱胶处理。从工业应用目的看，随着胶质含量的减少，苎麻纤维的物理、化学性能均得到改善。苎麻脱胶效果的好坏，将直接影响到纱制产品的质量。目前本领域中常用的脱胶方法为化学烧碱高压煮炼法。该方法耗用大量的酸碱，随着酸碱原料大幅度涨价，导致成本成倍上涨；同时，化学法脱胶产生大量的酸碱废水，可造成严重的环境污染。为此，本领域的许多研究人员一直努力寻找苎麻脱胶的新手段，特别是将注意力集中在生物脱胶上。
苎麻生物脱胶主要是利用微生物产生的高度特异性果胶酶，半纤维素酶类水解果胶、半纤维素类物质，以达到脱胶的目的。生物脱胶法减掉了大量的酸碱原料，因而与化学法相比，具有处理条件温和(常压，常温)，成本低，纤维质量好，对环境污染小等优点。目前主要用于苎麻脱胶的微生物为真菌和中性细菌。1958年，Mchammad(Aaal.Microb.，687，1958)和Betrabet(Ibid，6，89，1958)分别报导了多粘芽胞杆菌和假单胞菌的浸解活性。藤重升永进而公开了一种利用微生物进行苎麻脱胶的方法(日本专利，特开昭51-149976)。真菌产生的脱胶酶中，多含有纤维素酶，并且最适作用pH多为酸性，而酸性pH条件则造成纤维强度的下降。另外真菌的生长速度慢，也导致脱胶周期长(一般为5-7天)。而中性细菌则容易污染杂菌，造成酶活力下降，脱胶效果不稳定。因此目前尚难以实现工业上实际应用的目的。目前用于苎麻生物脱胶技术的菌株均为真菌和细菌。
中国专利CN85104285，CN85104284中公开了使用中性芽孢杆菌属的微生物，利用其产生果胶酶的能力进行生物脱胶的方法。中国专利CN89104529公开了利用芽孢杆菌进行苎麻生物脱胶的方法。但这些专利都没有说明所说芽孢杆菌属细菌的种名及筛选方法，也没有按照布达佩斯条约的规定保藏他们筛选到的微生物样品，致使本领域技术人员不可能再现其发明。
本发明的目的是提供新的用于苎麻脱胶的嗜碱芽孢杆菌菌株，其特征在于该菌株具有在适当的培养和发酵条件下，以高产率产生碱性果胶酶和甘露聚糖酶的能力。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的嗜碱芽孢杆菌菌株产生的碱性果胶酶的酶活力为600-1100U/ml发酵液，碱性甘露聚糖酶的酶活力为600-11100U/ml发酵液。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，所说的嗜碱芽孢杆菌菌株具有如为专利目的保藏于(武汉)中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的，保藏登记号为CCTCCM96009的嗜碱芽孢杆菌NTT33-CL301的菌学性质及生物特性。
本发明的另一个目的是提供一种诱变和筛选用于苎麻脱胶目的的嗜碱芽孢杆菌菌株的方法，该方法包括(1).在适当分离培养基中培养得自野生型芽孢杆菌属的细菌；(2).将步骤1中得到的芽孢杆菌属细菌依次培养在含果胶的营养培养基和含槐豆胶的营养培养基中进行定向驯化；(3).按常规方法从上述的培养基中选择出具有产果胶酶和甘露聚糖能力的菌株；(4).在含有渐增浓度的利福平的的营养培养基中对步骤(3)中得到的产果胶酶和甘露聚糖能力的经选择的的芽孢杆菌属菌株进行诱变，使之获得抗利福平抗性；(5).从上述诱变的培养基中分离具有利福平抗性并以高产率产生果胶酶和甘露聚糖酶的菌株。
根据本发明的一个优选实施方案，按上述方法诱变并筛选的芽孢杆菌菌株为嗜碱芽孢杆菌的菌株，并具有如保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏登记号为CCTCC M96009的嗜碱芽孢杆菌的生物学和形态学特征。
本发明的再一个目的是提供一种苎麻脱胶的方法，该方法包括在适合嗜碱芽孢杆菌生长并产生果胶酶和甘露聚糖酶的条件下，使上述嗜碱芽孢杆菌与欲进行脱胶处理的生苎麻在适当的培养基中接触一定的时间。
根据本发明的一个优选方案，本发明的具有产生果胶酶和甘露聚糖酶的嗜碱芽孢杆菌与待处理的生苎麻的接触时间通常为12-48小时，较好为16-24小时。
本发明提供了具有在适当的培养和发酵条件下以高产率产生果胶酶和甘露聚糖酶之能力的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)菌株。
为了得到本发明的具有以高产率产生碱性果胶酶和甘露聚糖酶能力的新的嗜碱芽孢杆菌突变株，本发明人首先从中国内蒙古自治区哲里木盟地区土壤中按常规方法分离出一株芽孢杆菌属的细菌。该菌种的菌体呈杆状，外形大小为0.5-0.65×2.6-3.4μ，染色均匀，有运动力，鞭毛侧生，内生孢子呈椭园形，孢子囊稍大，好氧；过氧化氢酶阳性，菌落呈圆形，表而光滑，有同心圆。该菌株生长于常规培养基上时对葡萄糖的作用缓慢，并且在培养基中检查不出酸的产生。该菌株分解淀粉，但不还原硝酸盐。特别是该菌株在pH10的培养基中生长良好。基于这些菌学特征和理化性质，参照伯杰氏细菌鉴定手册(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology，8th Edition，theWilliams & Wilkins Company，Baltimore，1974)，本发明人将该菌株确定为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)按本领域技术人员已知的方法，在含有碳源、氮源及无机盐的分离培养基中培养并分离用于本发明的野生菌株。所说的碳源例如可选葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖等。所说的氮源例如可选自胰蛋白胨、酪蛋白水解物、酵母浸膏等。所说的无机盐例如可选自磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、碳酸等的盐类，例如碱金属盐、锌盐、镁盐及其他金属盐。在一个优选实施方案，用于本发明的分离培养基含有葡萄糖，10g；蛋白胨，5g；酵母膏，5g；K2HPO4，1g；MgSO4.7H2O，0.2g；琼脂，18g。上述成份加水1000ml后，在室温下充分搅拌混匀。为了选择特别适合于碱性条件下生长的嗜碱芽孢杆菌，可使用Na2CO3调整pH9-11，最好是调整到pH10。
将样品材料接种于如上制得的分离培养基中，按Horikoshi(Agr.Biol.Chem.，36285-293，1972)的方法选择出具有前述形态学和菌学特征的芽孢杆菌属的菌株。依据伯杰氏细菌鉴定手册，将如此选择的菌株确定为嗜碱芽孢杆菌。
为了得到按上述方法筛选以高产率产生果胶酶和甘露聚糖酶的嗜碱芽孢杆菌，将所得菌株相继培养于本发明的以果胶作为碳源的液体果胶培养基和以槐豆胶作为碳源的液体槐豆胶培养基中。
为了诱导果胶酶的产生，首先将大约106细菌细胞接种于每升含有果胶20g，酵母膏1g，K2HPO41g，MgSO4.7H2O 0.2～0.5g，ZnSO4.7H2O 0.01g，FeSO40.01g，KCl0.5g，琼脂18g，并用Na2CO3调至pH9-11的果胶培养基中，37℃培养，直至长出菌落。
为了诱导甘露聚糖酶的产生，将经在果胶培养基中诱导的上述嗜碱芽孢杆菌进一步培养在本发明的槐豆胶培养基中。所说的培养基每升含有槐豆胶10g，酵母膏5～10g，蛋白胨10g，K2HPO41g，MgSO4.7H2O 0.1g，琼脂18g并用Na2CO3调至pH9-11。
简单地说，为完成这一诱导，首先用分离培养基自土壤样品中筛选嗜碱芽孢杆菌，再于果胶培养基和槐豆胶培养基中复筛得到产生果胶酶和甘露聚糖酶的嗜碱芽孢杆菌菌株。由于果胶酶和甘露聚糖酶均为诱导酶，它们只能在相应的底物存在时才被诱导产生，因此必须在如前所述的果胶和槐豆胶培养基中诱导其果胶酶和甘露聚糖酶的产生，方能筛选得到高产果胶酶和甘露聚糖酶的菌株。
按Horikoshi(Agr.Biol.Chem.1972，36，285-293.)和Akino(Agr.Biol.Chem.1988，52，773-779.)的方法测定所得菌株产生的果胶酶和甘露聚糖酶活力，并以产生足够酶活性的菌株作为进一步诱变的起始菌株。
进一步采用抗利福平自发突变的方法从所得到的产果胶酶和甘露聚糖酶菌株，筛选抗利福平自发突变菌株，再从中筛选高产菌株。由于果胶酶和甘露聚糖酶均为诱导酶，它们的表达一般都会受到葡萄糖或某些代谢产物的代谢阻遏(Forgarty，W.M.and Kelly，C.T.，Microbial Enzymes and Biotechnology，Edited by W.M.Forarty，1983，131-182，Applied Science Publishers，London and New York.)。利福平是一种能够抑制RNA聚合酶起始反应的抗菌素，有许多微生物对利福平敏感，而不能生长在含利福平的培养基中。如果某菌株的RNA聚合酶由于自发突变或人工诱变而发生了改变，利福平就不会再对它起作用。这个菌株就能抗利福平，并在含利福平的培养基中生长。而RNA聚合酶的改变，就会影响基因的翻译和表达(Sippel A.and Hartmann，G.，Bichim.Biophys.，1968，157，218-219.)。这一系列的改变就有可能解除葡萄糖或某些代谢产物对果胶酶和甘露聚糖酶产生的代谢阻遏。
活化好的产果胶酶和甘露聚糖酶菌株的菌体，涂于含不同浓度利福平的平皿上，利福平平皿含有葡萄糖20g；酵母膏5g；蛋白胨5g；K2HPO41g；MgSO4.7H2O 0.1g；水1000ml；琼脂18g；用Na2CO3调pH10，使用前加入不同浓度的利福平。于37℃培养直至长出抗性菌落。分别于液体果胶培养基和槐豆胶培养基培养后，测定产生的果胶酶和甘露聚糖酶活力。
在以上培养基中培养的菌株，按Horikoshi(Agr.Biol.Chem.1972，36，285-293.)和Akino(Agr.Biol.Chem.1988，52，773-779.)所述的方法测定果胶酶和甘露聚糖酶活性，一个酶活力单位定义为在测定条件下，每分钟释放1μg半乳糖醛酸或甘露糖所需的酶量。
按上述方法选择，诱导并经过利福平抗性筛选后得到的嗜碱芽孢杆菌具有以高水平产生果胶酶和甘露聚糖酶的能力。简单地说，该方法包括嗜碱芽孢杆菌的分离，产果胶酶和甘露聚糖酶菌株的筛选，抗利福平自发突变菌株的筛选几个步骤，最后按Horikoshi(Agr.Biol.Chem.1972，36，285-293.)和Akino(Agr.Biol.Chem.1988，52，773-779.)的方法检测所得菌株产生的果胶酶和甘露聚糖酶活性。按上述方法获得一株高产菌株编号为NTT33-CL301，其产果胶酶活力为600-1100U/ml，甘露聚糖酶活力为600-11100U/ml。
将按上述方法制得的菌株定名为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)NTT33-CL301。按布达佩斯条约的规定，于1996年10月7日将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏登记号为CCTCCM96009.
利用本发明的高产果胶酶和甘露聚糖酶的嗜碱芽孢杆菌进行苎麻生物脱胶的方法包括将于液体果胶培养基中生长良好的菌种加入含有生苎麻的苎麻培养基中进行保温16-24小时，使苎麻纤维分散成棉花纤维状。苎麻培养基其成分为每升水含有生苎麻10g，(NH1)2SO41.5g，K2HPO40.2g，MgSO4.7H2O 0.25g，并用Na2CO3调至pH9-11。
生物脱胶苎麻经水洗后，用1-5％稀烧碱，2％纯碱，1％三聚磷酸钠溶液煮炼1-2小时，水洗，漂白，中和，水洗，甩干，给油，烘干，即可得到精干麻。
利用本发明提供的技术制得的精干麻，残胶率＜3％；硬条率＜1％；束纤维强度＞6.9克/旦，回潮率8.6％左右伸长率3-9％，正品率＞90％。外观质量脱胶均匀，纤维松散，柔软，富有光泽，硬条，硬块，夹生少。
用该技术制备的精干麻纺出的36公支管纱达到部颁一等一级水平以上。平均强力为513.8CN，修正强力697.9CN，平均伸度19.6毫米，伸度不匀率3.9％，各项指标均优于化学法脱胶的同支数纯麻纱。
绞纱染色色泽光亮鲜艳，下易出现色花，色条，色块，色差等染色庇点；与同号棉纱相比，染色牢度在某些范围内高出国家标准半级至一级水平。
织物质量坯布入库一等品率为93％，试产的生物脱胶纯麻织物布身挺括似绸，色泽鲜亮柔和，配色得当，并具有吸湿性强，透气性好，刺痒感有明显减少等特点。
该技术还具有生物脱胶周期短(一般不超过24小时)，脱胶率高达90％以上，菌种不易被污染，酶活力稳定等特点。
以下结合实施例作进一步举例描述本发明。
实施例1产酶菌株的筛选将土壤样品1g悬于无菌水中，混合均匀，上清液接入分离培养基中，其成分为葡萄糖10g；蛋白胨5g；酵母膏5g；K2HPO41g；MgSO4.7H2O 0.2g；琼脂18g；水1000ml；用Na2CO3调pH10。28℃培养24-48小时，挑选单菌落转入果胶培养基中，其成分为果胶20g酵母膏1gK2HPO41g；MgSO4·7H2O 0.5g；ZnSO4·7H2O 0.01g；FeSO40.01g；KCl 0.5g；水1000ml；琼脂18g；用Na2CO3调pH10.5，28℃培养，选择菌落周围产生透明圈的菌株。将这些菌株分别在液体果胶培养基(果胶培养基成分为果胶20g；酵母膏1g；K2HPO41g；MgSO4·7H 2 O 0.5g；ZnSO4·7H2O 0.01g；FeSO40.01g；KCl 0.5g；水1000ml；用Na2CO3调pH10.5，和槐豆胶培养基(培养基含有槐豆胶10g；酵母膏5g；蛋白胨5g；K2HPO41g；MgSO4·7H2O 0.1g；水1000ml；用Na2CO3调pH10)中28℃振荡培养24小时后测定其果胶酶和甘露聚糖酶活性。
实施例2抗利福平自发突变菌株的筛选(1)利福平培养基的制备在1升水中加入葡萄糖20g，酵母膏5g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0.1g，琼脂18g用Na2CO3调pH10，并在使用前加入利福平，使终浓度为0.1-70μg/ml。
(2)离心收集于液体培养基上活化24-36hr的菌体，涂于上述含不同浓度利福平(0.1-70μg/ml)的平皿上，37℃培养直至长出抗性菌落。分别在上述液体果胶培养基中和槐豆胶培养基，37℃培养这些抗性菌落，并在不同时间测定其果胶酶和甘露聚糖酶活力。一个酶活性单位定义为在测定条件下，每分钟释放1μg半乳糖醛酸或甘露糖所需的酶量。
按上述方法获得一株高产菌株编号为NTT33-CL301，其产果胶酶活力为600-1100U/ml，甘露聚糖酶活力为600-11100U/ml。
实施例3苎麻生物脱胶(1)将菌株NTT33-CL301于液体果胶培养基中37℃培养24-48小时诱导，然后转入含有苎麻的培养基中，其成分为苎麻10g；(NH4)2SO41.5g；K2HPO40.2g；MgSO4·7H2O 0.25g；水1000ml；用Na2CO3调pH10.37℃下振荡培养16-24小时，观察其纤维分散情况。
实施例4生物脱胶苎麻的后处理(1)将经生物脱胶后分散如棉花状的苎麻水洗后，在含5％NaOH，1％三聚磷酸钠的溶液中，2kg/cm2煮炼1小时，按化学脱胶的一般处理方法进行水洗，离心甩干，漂白(有效氯0.2g/L)，水洗，酸洗(pH2.5)，水洗，甩干，给油后，甩干，干燥，得精干麻。
(2)将经生物脱胶后分散如棉花状的苎麻水洗后，在含2％NaOH，1％NaCO3，1％三聚磷酸钠的溶液中，2公斤/cm2煮炼2小时，按化学脱胶的一般处理方法进行水洗，离心甩干，漂白(有效氯0.5g/L)，水洗，酸洗(pH2.5)，水洗，甩干，给油后，甩干，干燥，得精干麻。
权利要求
1.一株应用于苎麻脱胶目的的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)菌株NTT33-CL301，其特征在于该菌株是样品保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCC M96009这样的微生物菌株。
2.按权利要求1所述的嗜碱芽孢杆菌菌株，其特征在于该菌株具有以高产率产生碱性果胶酶和碱性甘露聚糖酶的能力。
3.按权利要求1所述的嗜碱芽孢杆菌菌株，其特征在于该菌株菌体呈杆状，外形大小为0.5-0.65×2.6-3.4μ，染色均匀，有运动力，鞭毛侧生，内生孢子呈椭园形，孢子囊稍大，好氧，过氧化氢酶阳性，菌落呈圆形，表面光滑，有同心圆，生长于常规培养基上时对葡萄糖的作用缓慢，并且在培养基中检查不出酸的产生，该菌株分解淀粉，但不还原硝酸盐。
4.一种诱变和筛选应用于苎麻脱胶目的的嗜碱芽孢杆菌菌株的方法，其特征在于该方法包括4.1.在适当分离培养基中培养得自野生型芽孢杆菌属的细菌；4.2.将步骤4.1中得到的芽孢杆菌属细菌依次培养在含果胶的营养培养基和含槐豆胶的营养培养基中进行定向驯化；4.3.按常规方法从上述的培养基中选择出具有产果胶酶和甘露聚糖能力的菌株；4.4在含有渐增浓度的利福平的的营养培养基中对步骤4.3中得到的产果胶酶和甘露聚糖能力的芽孢杆菌属菌株进行诱变，使之获得抗利福平抗性；4.5.从上述诱变的培养基中分离具有利福平抗性并以高产率产生果胶酶和甘露聚糖酶的菌株；
5.按权利要求4所述的诱变和筛选应用于苎麻脱胶目的的嗜碱芽孢杆菌菌株的方法，其特征在于步骤4.1中所说的分离培养基含有碳源、氮源及无机盐，使用Na2CO3将pH调整到9-11。
6.按权利要求4或5所述的诱变和筛选应用于苎麻脱胶目的的嗜碱芽孢杆菌菌株的方法，其特征在于所说的碳源选自葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖，所说的氮源选自胰蛋白胨、酪蛋白水解物、酵母浸膏，所说的无机盐选自磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、碳酸的碱金属盐、锌盐、镁及其它金属盐类。
7.按权利要求4所述的诱变和筛选应用于苎麻脱胶目的的嗜碱芽孢杆菌菌株的方法，其特征在于步骤4.2中所说的营养培养基分别是以果胶作为碳源的液体果胶培养基和以槐豆胶作为碳源的液体槐豆胶培养基。
8.按权利要求4所述的诱变和筛选应用于苎麻脱胶目的的嗜碱芽孢杆菌菌株的方法，其特征在于步骤4.4中所说利福平的渐增浓度为0.1-0.7μg/ml
9.一种苎麻生物脱胶的方法，其特征在于使嗜碱芽孢杆菌菌株NTT33-CL301在苎麻培养基中与待处理的苎麻于通气条件下接触16-24小时。
全文摘要
本发明公开了一株新的嗜碱芽孢杆菌菌株及其在苎麻脱胶中的应用,本发明提供的嗜碱芽孢杆菌菌株NTT33－CL301,CCTCCM96009是由土壤分离,依次经果胶和槐豆胶定向驯化,再经利福平诱变后筛选而获得的以高产率产生碱性果胶酶和碱性甘露聚糖酶能力的嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)菌株,该菌株能够直接用于苎麻脱胶。本发明提供的技术具有脱胶周期短,脱胶效率高,菌种不易被污染,酶活力稳定,处理成本低,纤维质量好等优点。
文档编号C12N1/20GK1177003SQ9710904
公开日1998年3月25日 申请日期1997年3月19日 优先权日1997年3月19日
发明者曹军卫, 陈漱涢, 郑连爽 申请人:武汉大学