专利名称：一种新的重组蛇毒金属蛋白酶的表达、复性及其生物学活性的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组蛇毒金属蛋白酶基因的构建、表达以及该重组蛇 毒金属蛋白酶的体外复性和活性测定。
背景技术：
蛇毒中含有很多具有生物学活性和医药及工业应用价值的蛋白酶类。其 中，蛇毒金属蛋白酶是主要组份之一。它常常是蝮蛇蛇毒的主要毒素，引起 被咬机体的局部或系统出血。由于蛇毒金属蛋白酶是一种蛋白酶，所以，与 其他工业用蛋白酶一样，它也具有潜在的和现实的医药和工业用价值。如蛇 毒降纤酶就是从蛇毒中分离得到的一种蛋白酶，目前已应用于人体血栓的临 床治疗中。此外，国外科学家试验表明，蛇毒蛋白酶还可去除衣物污渍。但 是，由于天然蛇毒的来源有限，品种资源的日益减少以及分离纯化的繁琐和 困难，因此，通过基因工程或蛋白质工程技术创造新的蛋白酶品种，以及通 过发酵大规模生产重组蛋白酶就具有特别重要的意义。目前，通过基因工程技术在大肠杆菌中表达重组蛋白已成为分子生物学 中的常规技术。但是，很多蛋白酶，尤其是含有多个二硫键的蛋白酶在大肠 杆菌中表达后往往形成没有生物学活性的不溶性的包涵体；经体外复性后， 很多蛋白酶还是没有生物学活性。为了绕过没有生物学活性的包涵体这个难 关，人们常常利用酵母和动物细胞来生产或表达真核蛋白。但是，利用酵母 和动物细胞生产重组蛋白的成本很高，表达量相对较低，生产周期较长，分 离纯化的难度相对较大，操作技术也更复杂，不利于工业化生产。另外，有 些毒性蛋白不适合于在动物细胞中生产，而更易于在大肠杆菌中以包涵体的 形式大量表达。因此，若能使在大肠杆菌中以包涵体形式表达的重组蛋白酶 复性后仍具有较强的生物学活性，那么，在大肠杆菌中生产重组蛋白酶就具 有极大的成本优势和大规模工业应用价值。 本发明利用已公开发表的巴西非出血蛇毒金属蛋白酶成熟酶区cDNA序 列和中国皖南尖吻蝮蛇出血蛇毒金属蛋白酶acutolysin A (该酶的名称)的 成熟酶区cDNA序列为材料，构建了一种自然界不存在的重组金属蛋白酶基 因，并在大肠杆菌中高效表达了该蛋白酶。经体外复性后，该蛋白酶具有明 显的蛋白水解活性。巴西蛇毒金属蛋白酶基因序列的参考文献1 ， Selistre de Araujo H.S. & Ownby C.L. (1995) Molecular cloning and sequence analysis of cDNAs for metalloproteinases from broad-banded copperhead々^/raticw cow/orzWx to/awd 爿rcA. 320, 141-148.2， Selistre de Araujo H.S.， de Souza E丄.，Bdtramini, L.M,, Ownby, C丄.& Souza, D.H. (2000) Expression^ refolding and activity of a recombinant nonhemorrhagic snake venom metalloprotease.尸ro/Ww Ex/^. &尸wn/ 19， 41-47.中国皖南尖吻蝮蛇出血毒金属蛋白酶acutolysin A (该酶的名称)的 成熟酶区cDNA序列参考文献1 ， Liu, Q., Xu, W.， Cheng, X., Jin， G.， Shen, X., Lou, H. & Liu, J. (1999) Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding hemorrhagic toxin acutolysin A from爿沐Wz-ocitow 7bx/co 37, 1539-1548.发明内容为了克服上述不足之处和开发新的工业用或医药用蛋白酶，本发明构建 了一种新的重组或嵌合蛇毒金属蛋白酶基因，并在大肠杆菌中以包涵体的形 式表达了该重组金属蛋白酶，经体外复性后，该重组蛋白酶具有对多种蛋白 底物的水解活性。这种新的重组或嵌合蛇毒金属蛋白酶基因，是具有序列1所示的核苷酸 或碱基序列；该重组蛇毒金属蛋白酶基因由巴西蛇毒金属蛋白酶基因的部分 序列和中国皖南尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶基因的部分序列组成，全长共有615 个核苷酸或碱基，编码205个氨基酸。该嵌合基因序列前面330个碱基来自 巴西蛇毒金属蛋白酶cDNA的5，端序列，后面285个碱基来自中国皖南尖吻 蝮蛇毒金属蛋白酶cDNA的3'端序列
该重组蛇毒金属蛋白酶用表达载体pET-15b在大肠杆菌中以包涵体的形 式表达出来；经体外复性后具有对多种蛋白底物的水解活性。所述重组蛇毒金属蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达、复性及其活性测定 方法，包括以下步骤(a) 以巴西蛇毒金属蛋白酶基因与皖南尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶基因为 模板或材料，通过PCR (聚合酶链式反应)技术构建重组或嵌合蛇毒金属蛋 白酶基因。(b) 在大肠杆菌中以包涵体的形式表达该重组蛇毒金属蛋白酶，以及 包涵体的纯化过程。(c )重组蛇毒金属蛋白酶包涵体的溶解和重组蛇毒金属蛋白酶的体外 复性过程。(d)重组蛇毒金属蛋白酶的蛋白水解活性测定。该重组蛇毒金属蛋白酶具有蛋白水解活性，能降解纤维蛋白原，明胶， 纤粘连蛋白，层粘连蛋白和酪蛋白。所以，该重组蛇毒金属蛋白酶具有潜在的应用价值。如该酶可用于制备水解明胶或多肽。随着国内对多肽研究不 断深入，从酪蛋磷酸肽、白蛋白多肽、大豆多肽、玉米多肽到水解明胶，越 来越多的功能性多肽产品及添加有多肽的产品被推向市场。因此，该发明具 有极大的市场应用潜力。说明书附1是用PCR技术构建重组蛇毒金属蛋白酶基因的原理示意图；图2为用12%的还原SDS-PAGE检测重组金属蛋白酶的表达试验结果图；图3为8%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛇毒金属蛋白酶对明胶的降解 试验l结果图4为8%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛇毒金属蛋白酶对明胶的降解 试验2结果图；图5为10%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛇毒金属蛋白酶对纤维蛋白原 的降解试验结果图；图6为8%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛇毒金属蛋白酶对纤粘连蛋白 的降解试验结果图；图7为8%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛇毒金属蛋白酶对层粘连蛋白 的降解试验结果图。
具体实施方式
一种新的重组蛇毒金属蛋白酶基因，由巴西蛇毒金属蛋白酶基因的部分 序列和中国皖南尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶基因的部分序列组成，全长共有615 个核苷酸或碱基，编码205个氨基酸。该基因序列前面330个碱基来自巴西 蛇毒金属蛋白酶cDNA的5'端序列，后面285个碱基来自中国皖南尖吻蝮蛇 毒金属蛋白酶cDNA的3，端序列。在大肠杆菌中表达的该重组蛇毒金属蛋白 酶经体外复性后，具有对多种蛋白底物的水解活性。所述重组蛇毒金属蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达、体外复性及其活性 测定方法，包括以下步骤(a)以已公开发表的巴西非出血蛇毒金属蛋白酶的基因与皖南尖吻蝮蛇 毒出血金属蛋白酶的基因为模板或材料，通过PCR (聚合酶链式反应)技术 构建了一种新的重组(或嵌合)蛇毒金属蛋白酶基因。用PCR技术构建蛇毒金属蛋白酶的原理图如
图1所示，以巴西蛇毒金属 蛋白酶基因为模板，Pl和P2作引物，将巴西蛇毒蛋白酶基因靠近5'端的 编码区扩增出来，即得到巴西蛇毒基因的5'端片段。同理，以中国皖南蝮 蛇毒蛋白酶基因为模板，P3和P4作引物，将皖南蝮蛇毒蛋白酶基因的3'
端编码区片段扩增出来。由于引物P2和P3的5'端有部分序列互补，所 以，当把扩增出来的两个基因片段混合后，巴西蛇毒基因片段的其中一条链 的3'端将和皖南蝮蛇毒基因片段中一条链的3'端互补，形成可延伸的部 分互补的嵌合双链基因。然后，再以引物Pl和P4进行PCR，就能将全长嵌 合基因扩增出来。图中空白框为巴西蛇毒金属蛋白酶基因，黑色框为中国皖 南蝮蛇毒金属蛋白酶基因。50 ul PCR反应体系(反应管)中含有引物 P1/P2或P3/P4;模板为巴西蛇毒蛋白酶基因或皖南蝮蛇毒蛋白酶基因；4种 dNTP(即4种脱氧核糖核苷酸，每种2. 5画1/L,各1 u 1); 5 u 1的10X DNA聚合酶缓冲液；3 — 5u高保真Taq DNA聚合酶。扩增程序如下94。C预 变性5分钟后进行以下循环93°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟。28 个循环后，72t:再延伸5分钟。4条引物(Pl， P2， P3和P4)的碱基序列分别是Pl: 5'-cgc cat atg gaa caa caa gga ttc cc-3' ; P2: 5'-tac agt gtc tcc atc aaa-3'; P3: 5，-ttt gat gga gac act gta gga ttg get tac gtg-3， ； P4: 5，-ccc gga tec tea ggg ttt att gag aat gca agg-3' 。 cat atg为甜e I的酶切 位点，gga tcc为^a威I的酶切位点。(b)将重组蛇毒金属蛋白酶在大肠杆菌中以包涵体的形式表达出来，以 及包涵体的纯化过程。按常规的分子克隆技术，将上述重组金属蛋白酶基因定向克隆在PET-15b载体的Abfe I和^rfl位点之间，将得到的重组质粒转入大肠杆菌 5Zi7(DE3)中。其中pET-15b为商业化的质粒DNA载体，用于在大肠杆菌中表达外源基因，载体上含有多克隆位点，可供外源基因插入。载体上的多克 隆位点其实就是特定的一小段DNA顺序或核苷酸顺序。为了将外源基因插 入，通常需先用限制性内切酶(如^/e I和Aa/^I等)将载体切开，然后
把经同样内切酶处理的外源基因与载体连接，即将外源基因克隆进去了。连 接后得到的含有外源基因的载体，又常称为重组载体。在37"C， 220转/分钟的条件下培养含有重组质粒的大肠杆菌，用IPTG (异丙基硫代半乳糖苷)诱导重组蛋白酶表达。经SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝 胶电泳)，确定重组蛇毒金属蛋白酶主要以包涵体的形式在大肠杆菌中得到 高效表达，表达量占菌体总蛋白的15-25%。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白的原理是根据大多数蛋白都能与阴 离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白分子所 带的负电荷远远超过天然蛋白分子的本身的净电荷，消除了不同蛋白分子的 电荷效应，使蛋白在电场中按分子大小(分子量)分离。如果某一蛋白底物 被重组蛋白酶降解或水解，那么，该蛋白底物就会被水解成若干个小分子量 片段，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳就能分辨出新产生的蛋白片段和底物分 子量的变化。包涵体的纯化过程通过3000-5000 g低速离心细菌培养液，弃上清， 收取细菌沉淀，用原菌液体积的1/20的缓冲液A溶解并混匀细菌沉淀，再 用超声波破碎细菌。破碎完全后，以8000-10000 g离心10-15分钟，弃上 清，收取重组蛋白包涵体沉淀，用缓冲液B洗涤包涵体2次，以8000 g离 心后再收取包涵体沉淀。(c )重组蛇毒金属蛋白酶包涵体的溶解和重组蛇毒金属蛋白酶的体外 复性过程用缓冲液C溶解包涵体沉淀，以8000 g离心15分钟后收取重组 蛋白上清。用缓冲液D稀释重组蛋白上清，SP:每隔5分钟往缓冲液D中加 入1/10的重组蛋白，须使稀释完成后重组蛋白的终浓度不高于0.5 mg/ml，并使稀释完成后，重组蛋白溶液中尿素或盐酸胍的终浓度维持在 0.5-1.5 mol/L之间。稀释完成后，用超滤法对蛋白质进行浓縮，使蛋白浓 度维持在0.5-2 mg/ml之间。最后，用缓冲液E透析重组蛋白溶液，以使重 组蛋白溶液中尿素的浓度低于20隱ol/L，于4。C或-2(TC保存。
以上实验步骤所用缓冲液配方如下-超声波破碎大肠杆菌时所用的缓冲液A: 50腿ol/L Tris-HCI (pH 8. 5) 1% TritonX-100，溶菌酶0.1 mg/ml， 50 mmol/L氯化钠，1 mmol/L DTT(二 硫苏糖醇)。洗涤包涵体的缓冲液B: 50 mmol/L Tris-HCI (pH 8.5)， 2mol/L尿 素，0.5% TritonX-100， 100 mmol/L氯化钠，1 mmol/L DTT。裂解(溶解)包涵体所用的缓冲液C: 50 mmol/L Tris-HCI (pH 8.5)， 8 mol/L尿素(或6 mol/L盐酸胍)，100 mmol/L氯化钠，1腿ol/L DTT。在稀释复性过程中所使用的缓冲液D: 50 mmol/L Tris-HCI (pH 8.0)， 5%甘油，0. 5 mmol/L还原型谷胱苷肽，0. 2 ramol/L氧化型谷胱苷肽，1-10 umol/L氯化锌，100 mmol/L氯化钠，10腿ol/L氯化钾。透析时所用缓冲液E: 50 mraol/L Tris-HCI (pH 8.0)， 5%甘油，100 mmol/L氯化钠，10mmol/L氯化钾，1-10umol/L氯化锌。 (d)重组蛇毒金属蛋白酶的蛋白水解活性测定。体外复性后重组蛋白酶的蛋白水解活性测定方法如下100 nlTris-HCI缓冲液(50 mmol/L， pH 8.0)的反应体系中含有蛋白底物和重组蛋白酶 的混合物。测定的蛋白底物分别是明胶，纤维蛋白原，纤粘连蛋白，层粘 连蛋白。反应体系中重组酶的浓度为0.05 ug/ul，明胶浓度为10 ug/u 1，其他蛋白底物的浓度为0.5 ug/ul。反应温度为37'C，反应时间为8 小时。阴性对照为在大肠杆菌中表达的没有酶活性的其他重组蛋白与上述蛋 白底物的混合物。SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测底物是否被降解。 实验结果表明，所有这些底物均能被重组的蛇毒金属蛋白酶降解或水解。 实验结果图解释如下-图2中12%的还原SDS-PAGE检测重组金属蛋白酶的表达，第1泳道为 蛋白质分子量标准，从上到下的条带分子量大小分别为97.4 kD， 66.2kD， 43 kD， 31 kD， 20.1 kD， 14.4 kD。第2泳道为表达重组蛋白酶的菌体样 品，在分子量为26 kD处明显有重组金属蛋白酶的表达，即最粗最浓的那条 带。第3泳道为包含体纯化后重组蛋白酶样品。图3中8%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛋白酶对明胶的降解，第 1， 2和7泳道为阴性对照，第3， 4， 5和6泳道为明胶被重组蛇毒金属蛋白 酶降解后的情况。由于明胶的上样量太大，所以染色后阴性对照呈现一片蓝 色(黑白照片表现为黑色)。图4中8%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛋白酶对明胶的降解，第 1， 2， 6， 7， 8和9泳道为明胶阴性对照，第3， 4， 5泳道为明胶被重组蛇 毒金属蛋白酶降解后的情况。由于明胶的上样量太大，所以染色后阴性对照 呈现一片蓝色(黑白照片表现为黑色)。图5中10%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛋白酶对纤维蛋白原的 降解，第1泳道为纤维蛋白原阴性对照，第2泳道为纤维蛋白原被重组蛇毒 金属蛋白酶降解的情况，第3泳道为蛋白分子量标准。图6中8%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛇毒金属蛋白酶对纤粘 连蛋白的降解，第4泳道为天然蛇毒金属蛋白酶对纤粘连蛋白的降解，第5 和6泳道为不同时间重组蛇毒金属蛋白酶对纤粘连蛋白的降解，其余泳道为 纤粘连蛋白的阴性对照。图7中8%的还原SDS-PAGE检测复性后的重组蛇毒金属蛋白酶对层粘连 蛋白的降解，第4泳道为层粘连蛋白被重组金属蛋白酶降解的情况，第5泳 道为天然蛇毒金属蛋白酶对层粘连蛋白的降解，其余泳道为层粘连蛋白的阴 性对照。
序列表<110>向开军<210> 1 <211〉 615 <212〉 DNA <213>人工序列<221> CDS<400〉 1gaacaacaaggattccccca aagatacgttgagcttgtcatagttgcgga tcacagaatg 60aacacgaaatacaatggtga ttcagataagataagacaatgggtacatca aattgtcaac120agatttacag acctttgaatattcgattcgcactggttgg cctagaaatt180tggtccaaccaagatttgat taccgtgacatcagtatcacatgatacttt ggcctcattt240ggaaactggagagagacaga cttgctaaggcgccaaagacatgataatgc ccagttactc300acggccattgactttgatgg agacactgtaggattggcttacgtggccag catgtgtgac360ccaaagcgttctgtaggagt tgttcaggatcatagctcagtaaatcattt ggttgccatt420accctggcccatgagattgc tcataatctgggcgttcgtcatgacgaagg ttcctgttct480tgtggtagtggttacacatg cattatgtctcctgtgataaactctgaagt tatcaaatat540ttcagcgattgtagttatat ccaatatcgggagta^tatcgaaggagaa cccaccttgc600attctcaata犯ccc61权利要求
1、一种新的重组蛇毒金属蛋白酶基因，其特征在于是具有序列1的核苷酸或碱基序列；该序列前面330个碱基来自巴西蛇毒金属蛋白酶cDNA的5’端编码序列，后面285个碱基来自中国皖南尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶cDNA的3’端编码序列。
2、 根据权利要求l所述的重组蛇毒金属蛋白酶基因，其特征在 于用表达载体pET-15b在大肠杆菌中以包涵体的形式表达了该重组 蛇毒金属蛋白酶；经体外复性后，该重组蛋白酶具有明显的蛋白水解 活性。
3、 根据权利要求1或2所述重组蛇毒金属蛋白酶基因在大肠杆 菌中的表达、复性及其活性测定方法，其特征在于包括以下步骤(a) 以巴西蛇毒金属蛋白酶基因与皖南尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶 基因为模板或材料，通过PCR (聚合酶链式反应)技术构 建了由这两种蛇毒金属蛋白酶基因片段组成的重组(或嵌 合)蛇毒金属蛋白酶基因；(b) 在大肠杆菌中以包涵体的形式表达了该重组蛇毒金属蛋白 酶，以及包涵体的纯化过程；(c) 重组蛇毒金属蛋白酶包涵体的溶解和重组蛇毒金属蛋白酶 的体外复性过程；(d) 重组蛇毒金属蛋白酶的蛋白水解活性测定。
全文摘要
本发明公开了一种新的重组或嵌合蛇毒金属蛋白酶基因，并在大肠杆菌中以包涵体的形式表达了该重组金属蛋白酶，经体外复性后，该重组蛋白酶具有对多种蛋白底物的水解活性。本发明还公开了所述重组蛇毒金属蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达、复性和活性测定的实验方法。该重组蛋白酶能降解纤维蛋白原，明胶，纤粘连蛋白，层粘连蛋白和酪蛋白等。
文档编号C12N15/57GK101397567SQ200710030709
公开日2009年4月1日 申请日期2007年9月30日 优先权日2007年9月30日
发明者向开军 申请人:向开军