制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法

专利名称：制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法
技术领域：
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种制备链霉亲和素标记的别 藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法。 技术背景藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据 其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、 藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和 别藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和变藻蓝 蛋白含alpha ( a )和beta ( P )亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键 与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类 及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合 形成特定的构象，使得藻红蛋白主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；藻红 蓝蛋白吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；藻蓝蛋白吸收约620nm的可见光， 发射约640nm的荧光；变藻蓝蛋白吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧 光。藻红蛋白结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB);藻红蓝蛋白 的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB);藻红蓝蛋白的 beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB);藻蓝蛋白和变藻蓝 蛋白结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。藻胆蛋白具有提高人体免疫力，促进动物血细胞再生等功能，能抑制癌细胞生长，对癌细胞有很强的杀伤力，是一种无毒无副作用的理想光敏剂，可减轻肿瘤化疗的副作用。 藻胆蛋白作为一种天然色素，也可作为高级天然色素应用于食品和化妆品中。藻胆蛋白由 于还具有强烈的荧光性，在分子生物学上可用于制备荧光探针，适用于免疫学、细胞学、 生理学和分子生物学等方面的研究。链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放 大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医 疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。藻蓝胆素生物合成基因由力o7和；^^组成，可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产藻 蓝月旦素(F. T. Landgraf, C. Forreiter, et al. Recombinant holophytochrome in Echerichia coli[J]. FEBS Letters, 2001， 508:459-462)。与前人的方法不同，在Z/7a6ae/7asp. PCC7120 中a^W77基因和5>/7ec/ oc_F"& sp. PCC 6803中sZrW必基因分别编码beta裂合酶，
在其它蓝藻中也存在同源的beta裂合酶。这些beta裂合酶能催化藻蓝胆素与别藻蓝蛋白 亚基脱辅基蛋白及其同源蛋白质共价结合，从而生成具有优良荧光性质的别藻蓝蛋白类荧 光蛋白质。通过基因工程技术，把链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白基因拼接 后克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白 的融合蛋白，直接实现链链霉亲和素和别藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接，而不需要通过 化学交联等方法来实现链霉亲和素标记。藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。别藻蓝蛋白 类荧光蛋白质具有优良的荧光性质，通过直接实现链链霉亲和素和别藻蓝蛋白亚基脱辅基 蛋白的连接，可用于生物学检测以及医疗检测领域。本发明为别藻蓝蛋白类色素蛋白质功 能材料应用于医药和生物工程领域，特别是检测领域奠定了基础。发明内容本发明的目的在于提供一种制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法， 它是应用beta裂合酶催化藻蓝胆素与链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结 合，从而制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质；将含有beta裂合酶基因、链 霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白拼接的基因、藻蓝胆素生物合成酶基因的表达质粒依 次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过这种方法得到的基因工程菌生产链霉亲和素标记 的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的目的是这样实现的 一种制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的 方法，包括下述步骤(1) 将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒；(2) 将链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个 表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(ZwJ和；xy^)或其同源基因克隆于第三个表达载 体中，得到藻蓝胆素合成质粒；(4) 将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒和藻蓝胆素生 物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌；当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程 菌，将此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的别藻 蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的述的制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法中所述的宿主 菌为大肠杆菌；所述的beta裂合酶基因是指与力朋6朋朋sp. PCC7120中alr^W7基因或 5y"ec力ocj^"s sp. PCC 6803中s^^似^基因同源的基因；所述的别藻蓝蛋白类脱辅基 蛋白基因是指与力朋6ae朋sp. PCC7120或分"ec力oc/"j's sp. PCC 6803中别藻蓝蛋白基因同源的基因。本发明与现有技术相比，具有以下优点1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产别藻蓝蛋白类荧光蛋白质，大肠杆菌繁 殖快，可以大大縮短周期；2、 与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；3、 通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质 类似的蛋白，提取方便；4、 产物中链霉亲和素与荧光藻胆蛋白类色素蛋白质直接结合，不需额外进行处理， 有利于发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质在检测领域的应用。


图1为本发明制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质ApcA的吸收与荧光光 谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。图2为本发明制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质ApcA2的吸收与荧光光 谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。图3为本发明制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质ApcB的吸收与荧光光 谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。图4为本发明制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质ApcD的吸收与荧光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。图5为本发明制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质ApcF的吸收与荧光光 谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详述 实施例1(1) 从GeneBank中可以査到，藻种J/7aA3e朋sp. PCC7120和5y/ ec/wc/"is sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。力/ a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019; 5y"ec/ ocysz^s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022;可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将」朋tee朋sp. PCC7120中的a7r^77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-WrW77，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将Z朋力ae朋sp. PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因spc力和链霉亲和素
基因(简称幼)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-邵M，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白A。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o/和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-^/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵d在pET30中是在fcoRV和i7wl两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在^cotI和i9^/n两个酶切位点之间；裂合酶基因sZrt 《77在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是A^fe I和屈o I ; PCB合成酶基因是2个(力o/和pcW)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I禾n之间，在第二个多克隆位点，在A^e I和i7w I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-alrt W7、 pET30-sa~apc/I和pACYCDuet-力a -p《W转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A。其吸收与荧 光光谱见图l所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mLLB培养基，37 t:振荡培养过夜；取100pL饱和培养物，无菌转接至5mLLB培养基，37。C振荡培养至0D6。。 =0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟(10000g， 4°C)弃去上清，收集沉淀菌体；用lmL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体,离心30 秒(10000g, 4。C)去上清，菌体沉淀用100nL预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰上，
加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30分钟，42'C热休克90秒，冰浴5分钟后 加入300nL LB培养基，37'C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培 养基平板上，倒置于37'C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和； 分别从中取100pL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37'C振荡培养至OD6。。=0. 5-0. 7 时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、2(TC、 150转/分，表达约12小时。离 心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株 进行大量表达。实施例2(1) 从GeneBank中可以查到，藻种/J/ a6ae朋sp. PCC7120和5y"ec力oc;^tj^sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；/l朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019; 5y/ ec力ocy"is sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022;可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将七a6ae朋sp. PCC7120中的aZrt W7基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-Wr^77，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将yl朋6ae朋sp. PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因apcA和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-sa"邵cA，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白A2。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。 (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o -pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵c^在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在J/ " I和)fein两个酶切位点之间；裂合酶基因3介W77在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是AWe I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc州)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在I和At I之间， ; cj^在第二个多克隆位点，在A^e I和i7 o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，
把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-aZrt^7;7、 pET30-sa"邵cA禾卩pACYCDuet-Z o7-pc州转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-13-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A2;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A2。其吸收与荧 光光谱见图2所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例3(1) 从GeneBank中可以査到，藻种如aZ^e朋sp. PCC7120和6y/ ec/ ocys"s sp. PCC 6803的全序列己经测定完成；^朋6sm3 sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019; 5y/7ec/ ocys^'s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022;可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将J朋Z^e/ a sp. PCC7120中的s&M77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-aZrt W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，禾U用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^7a&e/7asp.PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因邻 c万和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-sa -apcA链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得 到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白 别藻蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和/7C^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-Z o7-; c州，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵c^在pET30中是在ScoRV和两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在I和《^n两个酶切位点之间；裂合酶基因aZrt^/7在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是Afafe I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc_M)， 它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和/^n之间， pc州在第二个多克隆位点，在AWe I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-alrt^77、 pET30-wapc^和pACYCDuet-力o7-转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌，将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lramol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白B;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白B。其吸收与荧 光光谱见图3所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例4(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^ a6ae朋sp. PCC7120和5y"ec/ ocys"s sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；/(/7a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5>/ ec/ ocj^"'s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将^7a6ae朋sp. PCC7120中的WrM77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a7rM77，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^7a/^e朋sp. PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因apc/ 和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-stapcZ ，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白D。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pcyA在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵c/ 在pET30中是在fcoRV和J7w I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在和i9WII两个酶切位点之间；裂合酶基因alrt^77在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是/fefe I和i7w I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和/7C/力)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在yVco I和尸"I之间， pc/力在第二个多克隆位点，在yWe I和J/ o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-a7r。W7、 pET30-幼-邵c"和pACYCDuet-力o7-; c/力转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-(5-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白D;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白D。其吸收与荧 光光谱见图4示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例5(1)从GeneBank中可以査到，藻种^ a力a朋a sp. PCC7120和5y"ec/ oc;^tis sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。勘a6織a sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5y/ ec/ ocj^"s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将力朋6ae朋sp. PCC7120中的Wr^《77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-Wr^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段。通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^7s^朋asp.PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因apcF和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-sta/ cF，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白F。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-p《W，在大肠杆菌中能同时表达HOi和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵c尸在pET30中是在fcoRV和两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在I和^^1I两个酶切位点之间；裂合酶基因Wr^W7在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是A^e I和i7 o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc/力)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间， pc/J在第二个多克隆位点，在M/e I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板，经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收，所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-aZrW7;7、 pET30-sa-邵c尸和pACYCDuet-/ o7-pc^转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37"C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白F，离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白F。其吸收与荧 光光谱见图5，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例6(1)从GeneBank中可以查到，藻种/1/Ja6ae朋sp. PCC7120和5)77ec/ ocy"j's sp. PCC 6803的全序列已经测定完成，力朋6雄a sp.PCC7120在GeneBank中编号为BA000019, 5y; ec力ocj^"s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将5y/ ec力oc;^"s sp. PCC 6803中的W/^似9基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet- W/^似9，在大肠杆菌中能表达 beta裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，禾U用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段；通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^73&e朋sp.PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因邵d和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-stap"，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白A。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-/w7-; c/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵d在pET30中是在fcoRV和i7 o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因ss在和S《7II两个酶切位点之间；裂合酶基因Wri^必在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是A^e I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcjo4)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸W I之间， pcy力在第二个多克隆位点，在We I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板，经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet- W/^,、 pET30，-邵d和pACYCDuet-力。7-; 一转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例7:(1) 从GeneBank中可以査到，藻种勘atee朋sp. PCC7120和5y"ec/ oc/s"s sp. PCC 6803的全序列已经测定完成,J"a6ae朋sp.PCC7120在GeneBank中编号为:BA000019， 6y/7ec力oc/Wis sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将5y/7ec7 oc/Wis sp. PCC 6803中的slri"似^基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet- sZri"似^，在大肠杆菌中能表达 beta裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，禾U用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段；通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将Z"a力ae/7asp.PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因邻 c^和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-s『apcA，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白A2。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(7 o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pc//I，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵cA在pET30中是在ScoRV和X/wI两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在1和^71I两个酶切位点之间；裂合酶基因Wr^^9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是yVofe I和J/w I ; PCB合成酶基因是2个(力W和pcy/D， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o/处于第一个多克隆位点，在Abo I和尸W I之间， pc州在第二个多克隆位点，在A^e I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板，经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet- Wr^似久pET30-sa-apc力和pACYCDuet-力o7-pc/力转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养
基中，37。C振荡培养至0D柳为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmraol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A2;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A2。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例8(1)从GeneBank中可以查到；藻种^7a6ae朋sp. PCC7120和5y"ec力ocysZ^'s sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；j朋力3e朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为..BA000019， 5"/7 ec力oc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将5)77ec/ oc/"/s sp. PCC 6803中的sZr^似^基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet- Wri^4仏在大肠杆菌中能表达 beta裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段；通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将力朋力朋朋sp.PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因apM和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-st邵cA链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。 (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o/和pc;^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-;;c/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因砂c万在pET30中是在fcoRV和J力ol两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在A>/71和i9^II两个酶切位点之间；裂合酶基因sZri^^在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是Mfe I和化o I ; PCB合成酶基因是2个(力o/和；xr力)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸W I之间， pc_M在第二个多克隆位点，在Abfe I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet- ^Zr^ 必、pET30-幼-邵c5和pACYCDuet-力o7-转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside,简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白B;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例9(1)从GeneBank中可以查到，藻种^/7a/we/ a sp. PCC7120和5y"ec/ oc;^z^s sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；加atee朋sp.PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5y"ec/ ocj^tis sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将5)77ec力oc/WA sp. PCC 6803中的W/^似9基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet- W/^似义在大肠杆菌中能表达 beta裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段；通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将A7^ae朋sp.PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因邵c/ 和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-s^apcA链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白D。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。 (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-/w7-/ cW，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵c"在pET30中是在feoRV和两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因m在A>/71和5《JII两个酶切位点之间；裂合酶基因s7/^^^在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是AWe I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcy力)，
它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o 处于第一个多克隆位点，在I和/^t I之间， pc州在第二个多克隆位点，在I和化o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet- sZr^似义pET30-sa-a; c"和pACYCDuet-/ o7-/ cj^转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至OD,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1誦1/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白D;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白D。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例10(1)从GeneBank中可以査到，藻种勘a&e朋sp. PCC7120和5y/jec/ oc/"j's sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；」朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5yy7ec力ocy"^ sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将5yy ec力ocy"is sp. PCC 6803中的WriW49基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet- s7ri^似9，在大肠杆菌中能表达 beta裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将/)/7a6a朋a sp. PCC7120中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因a/ c,和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-sa"a/ c尸，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白F。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。1
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和；xy^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pcj^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵c尸在pET30中是在fcoRV和两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在1和^^1I两个酶切位点之间；裂合酶基因s7/^^^在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是Mfe I和Z力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o/和pc/Zl)， 它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o7处于第一个多克隆位点，在Abo I和尸"I之间，在第二个多克隆位点，在yVofe I和X力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet- slriY 必、pET30-sa-a; c,和pACYCDuet-力o7了cj^转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37"振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白F;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白F。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例11(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120和Synoohocystis sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；力朋Anabaena p.PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，Synoohocystis sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的WrM77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a7rW77，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将Synechocystis sp.PCC 6803中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因邵d和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫
pET30-sa"apc4，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白A。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o/和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因s; c力在pET30中是在fcoRV和Z力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在勤/ I和5WII两个酶切位点之间；裂合酶基因alrW77在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是M/e I和I ; PCB合成酶基因是2个(/ o7和pcj^)， 它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o7处于第一个多克隆位点，在〃co I和尸"I之间， / c州在第二个多克隆位点，在y^e I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-aZrt^77、 pET30-sa和pACYCDuet-力o7-; 《W转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至006。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例12(1)从GeneBank中可以査到，藻种力/ atee朋sp. PCC7120和5y"ec/ oc;^tis sp. PCC 6803的全序列已经测定完成;」朋6細a sp.PCC7120在GeneBank中编号为:BA000019， 5)vjec力oc;^"s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将^ aZ ae朋sp. PCC7120中的aZr郎77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a&W/7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。 根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将5)77ec力ocj^z^s sp. PCC 6803中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因a/ c^和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-s^a/7cA链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-/ o7-/ c;^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵M在pET30中是在fcoRV和o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在yf; /7 1和i5^II两个酶切位点之间；裂合酶基因a7/^^77在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是7W/e I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力W和pc;^)， 它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和/^I之间， pc州在第二个多克隆位点，在Afcfe I和I力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-a^rt^ 7、 pET30-sa-邵c5和pACYCDuet-/ o7-pc州转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmraol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白B;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例13(1)从GeneBank中可以査到，藻种力朋6ae朋sp. PCC7120和5y/ ec力ocj^z^'s sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；力/ ^ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019,
分/ ec力oc/"is sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将力/ a力ae朋sp. PCC7120中的a7WW7基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-s7t^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将5)77ec/wcj^"s sp.PCC 6803中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因apc/ 和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-s『3/7cA链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白D。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和pc/力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o/-/7c州，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因spcZ 在pET30中是在feoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在1和^WII两个酶切位点之间；裂合酶基因Wj^W7在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是yVA I和/力o I ; PCB合成酶基因是2个(力W和；xt力)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间， pc/力在第二个多克隆位点，在yWe I和i7 o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-a^rt W7、 pET30-幼-apc/ 和pACYCDuet-力o7-pcy^转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至006。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白D;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过附2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白D。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例14(1)从GeneBank中可以査到，藻种^ a6ae朋sp. PCC7120和5>/ ec/ oc_K"is sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；力朋6ae朋sp.PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5>/7ec/wcy"is sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将^ atee朋sp. PCC7120中的aZrt W7基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a介W77，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总面A作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将5>77ec/ octis sp.PCC 6803中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因邵cf和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-s『spc,，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白F。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(Zw7和；xu^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-; c.W，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵c尸在pET30中是在AcoRV和J/wI两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在f/w I和5^1I两个酶切位点之间；裂合酶基因a介W77在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是A^e I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc_^)， 它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力W处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间， pc州在第二个多克隆位点，在We I和i7 o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-aZr。W7、 pET30-^-邵c,和pACYCDuet-/ o卜pc//1转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37r振荡培养至0仏。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-卩-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1腸1/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白F;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白F。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例15(1)从GeneBank中可以查到，藻种勘a6朋朋sp. PCC7120和6y/7ec/ ocj^tis sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；勘a力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5y/ ec/ ocys"s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022,可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将5y"ec/wcy"A sp. PCC 6803中的slr^似9基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet- sZri"似义在大肠杆菌中能表达 beta裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将6y/7ec/wcy^is sp.PCC 6803中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因邻w力和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-st邵cA链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白A。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。 (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-; cyA在大肠杆菌中能同时表达恥l和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵"在pET30中是在AcoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因ss在1和^^JII两个酶切位点之间；裂合酶基因Wt^^9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是Afafe I和Z力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o/和pc州)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o 处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸st I之间， pc/力在第二个多克隆位点，在I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet- pET30-sa-apc力和pACYCDuet-力o7-p《W转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0D朋。为0. 5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l画ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例16(1)从GeneBank中可以査到，藻种j朋6ae朋sp. PCC7120和5y/7ec力oc^"'ssp. PCC 6803的全序列已经测定完成；勘a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5y/ ec/ ocys"'s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022,可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将5y/ ec/wc/5"s sp. PCC 6803中的W/^似^基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet- Wr^似义在大肠杆菌中能表达 beta裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将5>/7ec/ oc/"A sp.PCC 6803中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因apc^和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-st邻M，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。 (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o/和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-/7C/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵^9在pET30中是在fcoRV和两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在1和两个酶切位点之间；裂合酶基因W/^似^在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是M/e I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力W和pcj^)， 他们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在/Vco I和尸"I之间，
在第二个多克隆位点，在;Vofe I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总副A作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet- Wr^似从pET30-wa/ c万和pACYCDuet-力o卜pcj^转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白B:离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白B。 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例17(1)从GeneBank中可以査到，藻种勘a6ae朋sp. PCC7120和5>/7ec/ oc;^^5 sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；」/7a/ ae朋sp.PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5)77ec力oc;^tk sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将5y/7ec/ oc/"A sp. PCC 6803中的sZr^^9基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet- Wr^似乂在大肠杆菌中能表达 beta裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将5y/7ec力oc/"A sp.PCC 6803中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因a; cZ 和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-s^apcZ ,链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白D。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。 (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l
中，所得质粒叫pACYCDuet-/ o7-在大肠杆菌中能同时表达HOI和PcyA。即脱辅基蛋白基因邵c"在pET30中是在化oRV和Wol两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在和《WII两个酶切位点之间；裂合酶基因sZ^似9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是〃& I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcW), 他们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o 处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸W I之间， Z cW在第二个多克隆位点，在/We I和I力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet- s7r^似9、 pET30-幼-apci 和pACYCDuet-/ o卜/)0^转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至0D印。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(is叩rophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1圆1/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白D;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白D。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例18(1)从GeneBank中可以査到，藻种力/ a/ ae/7a sp. PCC7120和5yy ec/ ocy"is sp. PCC 6803的全序列已经测定完成；力朋力ae朋印.PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5>/ ec/ oc_K"is sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将5y"ec力oc7ssp. PCC 6803中的^ri^必基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet- Wi^似9，在大肠杆菌中能表达 beta裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将5)77ec力ocj^^s sp.PCC 6803中的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因spc尸和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫
pET30-sapcF，链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白别藻蓝蛋白F。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(Z o7和pc/力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力W-/ 《W，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即脱辅基蛋白基因邻c尸在pET30中是在化oRV和J/w I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在A>/71和^^n两个酶切位点之间；裂合酶基因sZr^^^在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是AWe I和屈o I ;PCB合成酶基因是2个(力W和pc州)， 他们在同一个载体pACYCDuet-l中，Zw7处于第一个多克隆位点，在vVco I和尸W I之间， pcy力在第二个多克隆位点，在Afafe I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet- Wr^ 必、pET30-sa-邵oP和pACYCDuet-力o卜pcW转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0D咖为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白F;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过附2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-别藻蓝蛋白F。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例相同。 上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的beta裂合酶、别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白、藻蓝胆素生物合成酶基因或其同源基因以及链霉亲和素基因来制备链霉亲和素标记的别藻 蓝蛋白类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了GenBank中己公 开全序列的蓝藻力朋/ 朋朋sp. PCC7120和6y朋c力oc/"is sp. PCC 6803为例对本发明方 法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开的内容采用其它原料实施本发明。
权利要求
1. 一种制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒；(2)将链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(hol和pcyA)或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到藻蓝胆素合成质粒；(4)将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒和藻蓝胆素生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌；当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，将此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的beta裂合酶基因是指与X/^tewa sp. PCC7120中a7^^77基因或6y/ ec/ oc7"is sp. PCC 6803中sZri^必基因同源的基 因。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因 是指与^7a6ae朋sp. PCC7120或5)77ec/wc/"is sp. PCC 6803中别藻蓝蛋白基因同源的 基因。
全文摘要
本发明公开了一种制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，通过应用藻胆蛋白beta裂合酶催化藻蓝胆素与链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质；本发明的方法应用生物过程生产链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法；链霉亲和素标记的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于生物学和医药功能材料领域，特别是应用为生物学和医学检测领域的荧光探针。
文档编号C12N1/21GK101397555SQ20071003055
公开日2009年4月1日 申请日期2007年9月27日 优先权日2007年9月27日
发明者佟顺刚, 坤 夏 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司