以链亲和素为载体的短肽融合表达热诱导重组质粒及其制备方法

专利名称：以链亲和素为载体的短肽融合表达热诱导重组质粒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地涉及采用链亲和素(Stv)核心蛋 白作为目的短肽(6-20肽，如8肽或18肽)生物合成载体，可专供抗原表位扫描 鉴定用的原核生物热诱导Stv重组表达质粒(如pXXStv-l和pXXStv-2)及其制备 方法。
背景技术：
众所周知，就探究一个新蛋白的功能，特别是研制靶抗原合成肽疫苗而言， 扫描鉴定它的线性B-细胞表位(B-cdl epitope, BCE)始终是非常重要的研究内容。最早最经典的抗原表位鉴定方法是始于1963年的固相肽化学合成法，但这 一技术过于繁琐， 一直未能获得广泛应用。八十年代中先后发展了聚苯乙烯针 (polypropylene pin)多肽合成技术(Gensen HM, et al.: Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single acid. iVoc /VaZMcad Sc/ 81: 3998-4002, 1984)和聚苯乙烯网袋(polypropylene mesh bag)合成技术 (Houghten RA.: General method for the the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: Specificith of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids.尸roc胸"ca"c/园，82: 5131-5135， 1985)，从而促进 了连续且部分重叠的肽探针BCE扫描法的应用。这二项重要技术的特点是针洗 涤完全，可反复使用，而且能直接转入酶标板中进行ELISA检测，或大大简化 肽合成过程，因而在抗原表位扫描鉴定中相对应用较多。但由于氨基酸残基合 成费用高，检测技术要求高且需要特殊仪器设备，因而限制了其广泛应用。随 着分子生物学技术的进步，八十年代中期也建立了基因亚克隆表位鉴定法 (Mehra V, et al.: Efficient mapping of protein antigenic determinants. fVoc TVaf/ Jc^/Sc/83: 7013-7017, 1986)。该方法的要点是将耙基因用DNA酶随机 切割成200 1， OOO碱基大小不等的片段，并将它们亚克隆重组插入入gtll表达 载体，然后用特异的单抗筛选免疫反应阳性的克隆，并进行DNA测序，最后依 据那些插入片段共有的核苷酸序列推断出该单抗识别的BCE基序。因为酶切条件不易控制，或者说不易获得足以比较推断的BCE基序的不同长度片段亚克隆， 所以应用该方法成功鉴定出耙BCE的报道屈指可数。至于表位扫描鉴定原理与化学合成肽法和基因亚克隆法相似的化学合成 肽库法(Jung G and Beck-Sickinger AG: Multiple peptide synthesis methods and their applications. Z/ gepr C力e/s Znt Wf/2g7， 31: 367-486, 1992; Geysen HM and Mason TJ: Screening chemically synthesized peptide libraries for biologically-relevant molecules. Sioorgyl/eV C/ e//7 Ae". 3: 397-404， 1993) 和基因工程肽库法或称噬菌体表位展示文库法(Scott JK and Smith GP: Searching for peptide ligands with an epitope library. 5bie/ ce， 249: 386-390, 1990)，很显然，它们的应用也存在很大的局限性，因为建库工作量 大和表位筛选麻烦，特别是建库成本高，常规实验室的靶抗原表位扫描鉴定不 适宜采用此类方法，除非所需筛选鉴定的抗原特别重要特别有意义。2004年为检测抗hCG多表位嵌合肽抗血清中是否存在抗各嵌入BCE抗体， 本发明人曾经构建了利用IPTG诱导系统表达人绒毛膜促性腺激素(hCG) 3亚基 三个不同BCE单表位短肽(short p印tide， SP)的融合蛋白。结果在Western blot检测中，IPTG诱导表达的单表位融合蛋白都能被它们的单抗或多抗特异 识别，进而提示可建立以一高表达蛋白为载体的生物合成肽表位扫描鉴定技 术。随后华荣虹等报道了利用IPTG诱导的pGEX-6P-l质粒表达GST-SP融合蛋 白法，扫描鉴定了严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的BCE[华荣虹等. SARS冠状病毒S蛋白受体结合结构域的表达及其表位作图.主激众学与f笏激 湮_^展，32(11):1030-1037， 2005]。相比前述目前应用最多的化学合成肽法，此生物合成(融合表达)肽表位鉴 定法优点明显，即目前DNA碱基合成费用低，l个氨基酸残基的DNA正负链片 段合成费用仅约是l个残基合成费用的l/20;分子克隆、表达和蛋白印迹鉴定 等都是目前成熟的技术，因而实验操作也相对更简便， 一般实验室都能开展； 构建的克隆能保存备用，鉴定结果明确且可重复检验等。但它尚处于发展初期 阶段，在实际操作中还存在这样那样的问题。例如，在申请人前述hCG单表位 短肽融合表达利用IPTG诱导的场合，会出现目的融合蛋白不表达或未诱导对照 菌"泄漏表达"(Leaky expression)的等情况，造成不便前期通过简单的 SDS-PAGE判定目的短肽融合蛋白是否表达，或所筛选克隆是否是重组质粒克 隆，包括对照菌的"泄漏表达"也会使免疫印迹试验中的阴性对照出现阳性结
果(上述论文中未显示IPTG诱导的阴性对照)。另外，GST融合蛋白表达量过高，即GST或GST融合蛋白表达产物占细菌总 蛋白的30%，在此情况下，使用鉴定的一抗数量也要增多。此外，GST-8肽或 GST-18肽的位置与一个约30kD的大肠杆菌强抗原的位置非常接近。由于用绝大 多数方法纯化目的表达产物都会污染此蛋白，而抗重组蛋白多抗中难免混有抗 该约30kD的大肠杆菌强抗原的抗体，而且其抗体滴度极高。因此在使用抗体重 组蛋白多抗的场合，由于这一特征印迹带的存在，不易判定印迹免疫结果。综上所述，本领域迫切需要寻找更佳的质粒表达系统和融合蛋白表达载 体，以完善这一短肽融合表达抗原表位鉴定新技术。发明内容为了建立抗原表位鉴定生物合成肽法一一其原理或特征与化学合成肽法 和基因亚克隆法相似，但短肽合成花费大幅度降低且操作更方便，因而适宜在 大多数实验室应用，本发明旨在提供以一蛋白为载体，可在其羧基端连接不同 6-20个残基短肽，以使连续但有一定长度残基重叠的系列短肽可被生物表达的 热诱导型表达质粒制品，专供抗原线性表位扫描鉴定用。在本发明的第一方面，提供了一种可用于靶抗原B细胞表位扫描的产品，所 述产品包括(a) 下式I所示的融合蛋白，Z陽A 式(I)式中，Z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为 100个氨基酸(如100-140aa)的链亲和素蛋白片段； A为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及(b) 下式II所示的对照蛋白，Z-COOH 式(II) 式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为IOO个氨基酸的链亲和素蛋白片段；附加条件是式i和式n中的z是相同的。在另一优选例中，所述的产品包括2-100个(更佳地4-50个，最佳地5-20个)式I所示的融合蛋白。在另一优选例中，各式I所示的融合蛋白中所携带的短肽来自同一个蛋白的。
在另一优选例中，A元件是长度为8-18个氨基酸的短肽。 在另一优选例中，所述的载体蛋白元件的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示。 在本发明的第二方面，提供了一种可用于靶抗原B细胞表位扫描的产品，所述 的产品包括(i) 第一核酸分子，所述的第一核酸分子编码下式I所示的融合蛋白，Z-A 式(I) 式中，Z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为 100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；A为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及(ii) 第二核酸分子，所述的第二核酸分子编码下式II所示的对照蛋白，Z-COOH 式(II) 式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为IOO个氨基酸的链亲和素蛋白片段；附加条件是式i和式n中的z是相同的。在本发明的第三方面，提供了一种可用于靶抗原B细胞表位扫描的产品，所述的产品包括(i) 第一表达载体，所述的第一表达载体为热诱导型且含有第一核酸分子，所 述的第一核酸分子编码下式I所示的融合蛋白，Z-A 式(I)式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；A为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及(ii) 第二表达载体，所述的第二表达载体为热诱导型且含有第二核酸分子，所述的第二核酸分子编码下式n所示的对照蛋白，Z-COOH 式(II)式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为IOO个氨基酸的链亲和素蛋白片段；附加条件是式i和式n中的z是相同的。
在另一优选例中，所述的第一表达载体依次含有以下元件复制起点(ori)、 Clts857元件、PrPl元件、Stv元件、多克隆位点、和抗性筛选基因(如Ampr、潮霉素 抗性基因等)，其中多克隆位点用于将式I中A元件的编码序列插入在Stv元件的下 游，以形成式I所示的融合蛋白。在另一优选例中，所述的第一表达载体是在序列如SEQ ID NO: 3所示的质粒 中，将式I中A元件的编码序列插入多克隆位点而形成的。在本发明的第四方面，提供了一种可用于靶抗原B细胞表位扫描的产品，所述 的产品包括(i)第一宿主细胞，所述的第一宿主细胞含有第一表达载体，所述的第一表达 载体中含有第一核酸分子，所述的第一核酸分子编码下式I所示的融合蛋白，<formula>formula see original document page 9</formula>(I)式中，Z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为 100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；A为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及(i)第一宿主细胞，所述的第一宿主细胞含有第二表达载体，所述的第二表达 载体含有第二核酸分子，所述的第二核酸分子编码下式II所示的对照蛋白，<formula>formula see original document page 9</formula>(II) 式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；附加条件是式i和式n中的z是相同的。在另一优选例中，所述的第一宿主细胞和第二宿主细胞是大肠杆菌。 在本发明的第五方面，提供了本发明上述任一所述的产品的用途，它们蓓用于靶抗原B细胞表位扫描。在本发明的第六方面，提供了一种靶抗原B细胞表位扫描方法，包括步骤(a)在相同条件下，培养第一宿主细胞和第二宿主细胞，并诱导所述的宿主细胞分别表达式i和式n所示的蛋白；其中所述的第一宿主细胞含有第一表达载体，所述的第一表达载体中含有第 一核酸分子，所述的第一核酸分子编码下式I所示的融合蛋白，<formula>formula see original document page 9</formula> 式(I) 式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为 100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；A为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及所述的第一宿主细胞含有第二表达载体，所述的第二表达载体含有第二核酸分子，所述的第二核酸分子编码下式n所示的对照蛋白，z-cooh 式(n) 式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为IOO个氨基酸的链亲和素蛋白片段；附加条件是式i和式n中的z是相同的；(b)将表达的式i所示的融合蛋白和式ii所示的对照蛋白分别与抗体混合，观察 抗体是否与式i所述的融合蛋白和式n所示的对照蛋白发生抗体-抗原反应；其中，如果抗体与式i所述的融合蛋白发生抗体-抗原反应而与式n所示的对照蛋白不发生抗体-抗原反应，那么就表述所述融合蛋白中的A元件是一靶抗原B细胞表位。在另一优选例中，所述的第一宿主细胞和第二宿主细胞是大肠杆菌。本发明还提供了一种能以截断Stv蛋白为载体，分别稳定高表达8或18肽左右目 的短肽融合蛋白的热诱导原核重组质粒构建方法及其制品。其特征是分别构建成 pXXStv-l和pXXStv-2—组2个表达质粒，前者pXXStv-l可在载体蛋白编码基因后的 BamHI和sal I克隆位点插入目的短肽编码基因，转化大肠杆菌宿主菌后，可热诱 导高表达任一不同长度目的短肽(融合蛋白形式)，后者pXXStv-2作为对照仅表达 Stv蛋白。因此，pXXStv-l质粒可作为短肽生物合成的工具，替代化学合成肽法用 于靶抗原的BCE扫描鉴定.本发明还提供了重组的pXXStv-l和pXXStv-2质粒，其特征是都选用了申请人 构建含Clts857突变基因和合适的SD序列的pSY621质粒，因而可使转化宿主菌在提 高培养温度的条件下，热诱导PRPL启动子表达下游的Stv-短肽融合蛋白或直接诱 导Stv蛋白。另夕卜，在它们的EcoRI和BamHI或其后SalI和PstI任一克隆位点重组插 入带ATG起始密码子的外源基因，也可热诱导直接表达其他目的蛋白。本发明还提供了重组pXXStv-l和pXXStv-2质粒，其特征是为实现抗原表位鉴 定用短肽的生物合成目的，选用了可以融合形式恒定高表达的长118个氨基酸残基 的StV作为载体蛋白。本发明还提供了pXXStv-l质粒，其特征是在Stv编码基因后的BamH I-Sal I多克 隆位点后添加了TAATAG终止密码子，以避免在免疫印迹反应中靶短肽后更多残基 可能产生的干扰。若欲排除Sal I位点6个碱基编码的两个残基，也允许在合成短肽 编码基因片段后直接添加TAA碱基(仅增加6个DNA碱基合成费用)。另外，pXXStv-l 质粒还可以用于表达其他Stv融合蛋白。本发明还提供了pXXStv-2质粒，其特征是在重组插入的Stv编码基因3'-端尾和 BamH I位点之间插入了TAA终止密码子，因而热诱导宿主菌后可在SDS-PAGE凝胶 上显示细胞总蛋白中约13kDa的Stv蛋白带。因此，在扫描鉴定靶抗原表位的场合， 该质粒表达产物可作为对照，用于确认所选用单抗、多抗或抗重组蛋白多抗与之有 无交叉反应；也可在重组质粒进行插入片段DNA测序或先对融合表达产物进行蛋 白印迹实验(以后再测序)前，用作通过SDS-PAGE初步鉴定pXXStv-l是否表达目的 短肽的对照(短肽融合蛋白一般比Stv蛋白的分子量大l kDa或以上)，以排除氨苄青 霉素平板上挑选的克隆是非pXXStv-l质粒自连产物，或避免蛋白印迹试验的盲目 性。


图1为pSY621原核热诱导质粒示意图。图2为构建的pXXStv-l质粒示意图。图中BamH I和Sal I为目的短肽编码 基因片段的重组插入克隆位点。图3为构建的pXXStv-2质粒示意图。与pXXStv-l质粒比较，不同点仅是删 除Sal I位点后TAATAG终止密码子，并在Stv编码基因3'-端尾BamH I位点前 增加一个TAA终止密码子。图4A， huZP3172—^和huZP3172—，融合表达的SDS-PAGE检测图。B， huZP3172—181 和huZP3172—19°短肽的免疫印迹图。各泳道如下1，蛋白分子量标准；2和3， huZP3172—181短肽未诱导和诱导菌总 蛋白；4和5， huZP3172—，短肽未诱导和诱导菌总蛋白；6和7， Stv未诱导和诱导 菌总蛋白。图5为huZP3^，^七个不同8肽融合表达的SDS-PAGE检测图。 各泳道如下1，蛋白分子量标准；2和3， MEENWNAE177—184短肽诱导和未诱导菌 总蛋白(箭头指示目的表达产物位置，下略)；4和5， EENWNAEK'78—185短肽诱导和未 诱导菌总蛋白；6和7， ENWNAEKR179—186短肽诱导和未诱导菌总蛋白；8和9， 酬AEKRS,187短肽诱导和未诱导菌总蛋白；lO和ll，丽AEKRSP181—188短肽诱导和未 诱导菌总蛋白；12和13， NAEKRSPT182—189短肽诱导和未诱导菌总蛋白；14和15， AEKRSPTF'83,短肽诱导和未诱导菌总蛋白。图中，在细菌总蛋白上样量基本一致的情况下，未热诱导对照栏都未见目的 短肽融合蛋白明显泄漏表达，热诱导栏都能看到表达量基本一致的耙短肽融合蛋白 高表达。图6为huZP3177—19°7个不同8肽融合蛋白表达的SDS-PAGE检测图。 各泳道如下1禾n 10， MEENWNAE'"^4和EENWNAEK178—185融合蛋白未诱导菌总蛋 白阴性对照；2，蛋白分子量标准；3 9，MEENWNAE177—184、EENWNAEK178—'85、ENWNAEKR179—186、 NWNAEKRS18。—187、 WNAEKRSP181—188、 NAEKRSPT182—189和AEKRSPTF183—19。诱导菌总蛋白。图7为使用兔抗重组人ZP3肽'77—348抗血清的7个不同8肽融合蛋白的免疫印 迹图。各泳道如下1和10， MEENWNAE177—184和EENWNAEK178—185融合蛋白未诱导菌总蛋 白阴性对照；2，蛋白分子量标准；3 9，MEE丽NAE177-184、EENWNAEK'78—185、ENWNAEKR 、 國AEKRS'8。—187、丽AEKRSP181—188、 NAEKRSPT182—189和AEKRSPTF183—19。诱导菌总蛋白。(各栏 上样蛋白样品同图6)图中在各目的8肽融合蛋白上方产生大肠杆菌抗原特征印迹条带，在它 们的条带下方，唯见3和4栏的MEE丽NAE177—，和EE丽NAEK178—185融合蛋白与兔抗重 组人ZP3肽177—348抗血清产生清晰的印迹条带，依据两者共有残基顺序，可判定 EE丽NAE178—，基序为人ZP3蛋白的一个线性BCE。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，将各种结构的短肽接于 一截断的Stv蛋白的末端，在所形成的融合蛋白中短肽的构象基本上不受影 响并且也不影响其表达，具有极好的通用性。基于此发现，本发明人首次开 发了一个能在大肠杆菌宿主菌中高表达Stv-SP融合蛋白的热诱导表达质粒 pXXStv-l，供抗原表位扫描鉴定用。具体而言，本发明人将编码118个氨基酸残基的链亲和素(Streptavidin， Stv)核心蛋白编码基因，通过EcoR I和BamH I位点重组插入现有的热诱导
表达质粒中，分别构建了在BamH I-Sal I位点后添加TAATAG两个终止密码 子和在BajiiH I-Sal I位点前添加一个TAA终止密码子的一组两个pXXStv-l 热诱导原核表达质粒(扫描质粒)和pXXStv-2热诱导原核表达质粒(对照质 粒)。扫描质粒可热诱导连接在Stv羧基端的系列重叠的8-18肽融合蛋白，以 替代化学合成肽法进行靶蛋白线性B细胞表位(B- cell印itope, BCE)的扫 描鉴定；对照质粒作为对照，仅热诱导约13kDA的Stv蛋白。在另一优选例中，本发明提供了利用该热诱导表达质粒进行短肽融合表 达，并扫描鉴定人卵透明带蛋白-3(huZP3)—个BCE抗原表位的实例，即，先 将欲鉴定靶蛋白的系列部分重叠8或18肽编码基因片段分别重组插入 pXXStv-l的BajEH I和Sal I位点之间，继而热诱导融合蛋白形式的系列短 肽，将SDS-PAGE凝胶上的表达产物转移到硝酸纤维索膜上后，用抗重组人卵 透明带蛋白-3(huZP3)肽段"7，抗血清进行Western blot试验，最后依据所 产生印迹染色带的若干短肽确定它的BCE基序，从而证明了 Stv作为短肽融 合表达载体以及热诱导pXXStv-l重组质粒在抗原表位扫描鉴定方面的适用 性和应用性。术语如本文所用，术语"本发明产品"或"可用于靶抗原B细胞表位扫描的产 品"可包括以下产品类型(a) 蛋白产品，即式I所示融合蛋白和式II所示对照蛋白的蛋白产品；(b) 核酸产品，即编码式I所示融合蛋白的核酸分子和编码式II所示对照蛋 白的核酸分子；(c) 表达载体产品，即携带编码式I所示融合蛋白的核酸分子的第一表达载 体和携带编码式II所示对照蛋白的核酸分子的第二表达载体(较佳地所述的表 达载体是热诱导型)(d) 宿主细胞产品，即含有携带编码式I所示融合蛋白的核酸分子的第一 表达载体的第一宿主细胞和含有携带编码式II所示对照蛋白的核酸分子的第 二表达载体的第二宿主细胞(所述的宿主细胞宜为大肠杆菌)；(e) 所述产品的任意组合。 如本文所用，术语"载体蛋白元件"指在式I所述融合蛋白中去除了短肽之后的多肽部分。优选的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为ioo个氨基酸的链亲和素蛋白片段。一种特别优选的载体蛋白元件是长度为118氨基酸的链亲和素 (Str印tavidin, Stv)核心蛋白元件，其氨基酸序列和编码序列分别如SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: l所示。所述的载体蛋白元件可含有或不含有起始的甲硫氨酸。如本文所用，术语"第一表达载体"指携带了表达式I融合蛋白的编码序列的 载体。第一表达载体也可称为扫描质粒。如本文所用，术语"第二表达载体"指携带了表达式II对照蛋白的编码序列 的载体。第二表达载体也可称为对照质粒。如本文所用，术语"A元件"、"候选抗原短肽"或"抗原候选短肽"可互换 使用，指长度为6-20个(8-18个为佳)氨基酸的短肽。较佳地，所述的候选抗原短 肽来自同一个蛋白或同一个家族的蛋白。第一表达载体和第二表达载体在本发明中，各元件的结构都是现有技术中已知的，可通过常规方法(如人工 合成法)制备或直接购得。在另一优选例中，为了克服IPTG诱导型表达系统常常发生目的蛋白或融合蛋 白"泄漏表达"的情况，以利于挑取克隆经热诱导后细菌总蛋白的SDS-PAGE初步 鉴定，即便于判定在氨苄青霉素(Amp)LB平板上挑取的克隆是非载体质粒自连产 物，同时在免疫印迹试验中避免出现阴性对照也产生阳性结果，本发明选用了已有 的构建且能髙表达外源蛋白的质粒为基础质粒，从而制得第一表达载休。玎作为基 础质粒的生物材料可购自ATCC等保藏机构或由文献报道的， 一种优选的质粒是 pSY621质粒(图l)[沈芸，应康，徐万祥，谢毅大肠杆菌高效表达载体pSY621 的构建.复^学说(^然辨学/发)，39(3):313 - 317， 2000]作为新构建重组 pXXStv-1的载体质粒。在一优选例中，所述的第一表达载体是pXXstv-l。其中的Stv元件是依据Stv 基因公开信息[Argarana CE, Kuntz ID, Birken S, Axel R， Cantor CR. Molecular cloning and nucleotide sequence of the str印tavidin gene. A^cJej.c y4cicte fes' 14(4):1871-82,1986; Sano T, Cantor CR. Expression vectors for str印tavidin-containing chimeric proteins. 近ocA棚^/o/zAys A*es Co咖叫 176(2):571-7, 1991.]，人工合成的Stv核心蛋白基因(编码118氨基酸残基，外 加N端1个ATG编码的甲硫氨酸残基)，热诱导后该元件在SDS-PAGE凝胶上显示约 13 kDA分子量的短肽蛋白条带。以8个氨基酸的短肽为例，使用该第一表达载体进行扫描时，在诱导菌总蛋 白的SDS-PAGE染色凝胶上，显示约14 kDa的Stv8肽融合蛋白条带上下无明显的 细菌蛋白条带(图5和6)，因而便于判别耙短肽融合蛋白是否被表达;实验证明Stv 载体适合不同残基组成的SP融合蛋白的稳定高表达(图5和6);在用抗重组蛋白 huZP3b多克隆抗体(徐万祥，何亚萍，洪爱真，季朝能，钱吉，王曙，谢貌人卵 透明带蛋白huZP3a22—178和huZP3177—3"肽段在大肠杆菌中的表达及其纯化.4^^^^"避 孕，24:143-148, 2004;宋力雯，汪玉宝，倪崖，何亚萍，洪爱真，Hinsch E， Hinsch KD， 周思畅，袁玉英，石其贤,徐万祥.人卵透明带蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及 其其抗血清体外研制人精子-半透明带结合.主理^^， 57: 682 - 688， 2005) 进行靶抗原表位扫描鉴定的蛋白印迹膜上，也避开了纯化重组蛋白中污染强细菌蛋 白(尽管染色凝胶上几乎看不出相应的蛋白条带，图7)所产生抗体与细菌自身抗原 的较强印迹反应带位置(用单抗或非重组蛋白多抗时则蛋白转移膜上一般不会出现 任何印迹杂带)，因而便于判定Stv-短肽条带处的抗原抗体反应结果。另外，使用pXXStv-1质粒表达连续且前后肽段相互有6 9个氨基酸残基重 叠的系列短肽，可用抗重组蛋白多抗进行BCE鉴定也是一突出的优点(图7)。提供 的热诱导pXXStv-l质粒经几十个不同短肽融合表达检验，它们都能以表达量约占 细菌总蛋白的10%水平在宿主菌中被稳定高表达，而且在电泳凝胶上对照未诱导菌 无泄漏表达情况发生，从而也利于蛋白印迹结果的判定(图5)。在载体蛋白Stv羧 基端BainH I-Sal I后接上TAATAG终止密码子，目的是避免生物合成的靶短肽后续 过多残基对特定抗原抗体反应可能产生的干扰(若欲排除Sal I碱基编码的Val和 A印两个残基，可将TAA或TAG加在所合成靶短肽编码基因片段3'-端后Sal I 位点前，略增加6个DNA碱基合成费用)。本发明还提供一个对照质粒。在一优选中，所述的对照质粒是在Stv蛋白编 码基因3'-端尾BamH I前接上TAA终止密码子的热诱导表达质粒pXXStv-2(图3)。 在扫描鉴定耙抗原表位的场合，该质粒表达的分子量约13 kDa的Stv蛋白,可先用 于确认所选用单抗、多抗或抗重组蛋白多抗与之有无交叉反应；也可用作通过 SDS-PAGE鉴定pXXStv-l是否表达Stv-8肽融合蛋白(两者分子量相差1 kDa，在电 泳后染色凝胶上可清楚辨别)的对照。在送出Amp抗生素平板上挑取的重组质粒克 隆进行DNA测序之前，以pXXStv-2诱导总蛋白为对照，先诱导表达一次很重要，
经过SDS- PAGE鉴定可确保送出的质粒克隆或质粒是Stv-SP重组阳性克隆，否则 可能会误送自连质粒克隆或质粒，而增加DNA测序费用和延误表位鉴定进程。如果 是可信赖生物技术公司提供的短DNA片段合成服务，也可在SDS-PAGE初步鉴定之 后，直接进行Western blot检验，然后就表位判定相关的或印迹反应有疑问的重 组质粒克隆送出测序，以最终确认表位鉴定结果并备案。制备方法对于本发明的表达载体而言，可用将表达载体的各元件用常规方法构建在一 起，从而形成本发明所述的用于靶抗原B细胞表位扫描的表达载体。具体地，在另一优选例中，本发明的第一表达载体和第二表达载体是用如下 方法制备的(1) 设计编码链亲和素(Stv)40到157位的正负链8段cDNA片段，包括在其 5' -端添加后连ATG起始密码子的EcoR I和3'-端添加BamH I粘性限制性酶切 位点碱基(2) 委托上海捷瑞生物工程有限公司合成的16个冃的基因片段，通过互补的正负链片段退火复性和两两相邻片段逐一连接反应，产生完整拼接基因编码片段；(3) 通过DNA重组技术将目的Stv基因插入用EcoR I和BamH I双酶切的pSY621 质粒，转化大肠杆菌宿主菌，在加Amp的LB平板上挑取重组克隆，委托上海联合 基因集团公司进行DNA测序；(4) 将插入基因测序正确的pSY621-Stv克隆扩增抽取质粒，然后用Sal I和 Pst I限制性酶进行双酶切，再重组插入两个酶切位点中间含TMTAG双终止密码 子的Sal I和Pst. I合成短片段，测序正确的重组质粒新命名为pXXStv-l质粒；(5) 用一对引物PCR扩增在Stv后添加TAA终止密码子的Stv基因片段，用 EcoR I和BamH I双酶切后，重组插入pSY621质粒，重组质粒测序正确的新命名 为pXXStv-2质粒。抗原表位扫描基于本发明所提供的扫描质粒和对照质粒，可以方便地进行抗原表位扫描。 例如，利用本发明提供的pXXStv-l和pXXStv-2热诱导表达质粒，在它们的EcoR I 和BainH I或其后其他克隆位点重组插入带ATG起始密码子的外源基因，可热诱导 直接表达其他目的蛋白。pXXStv-l质粒也可诱导表达与Stv融合的其他目的蛋白。 在一优选例中，本发明利用pXXStv-l质粒表达系列且序列部分重叠的 Stv-SP融合蛋白，从而扫描鉴定了人卵透明带-3(humanzonapellucida-3， huZP3) 蛋白一个新的线性BCE(EENWNAE178,184)。在另一优选例中，所述的扫描包括以下步骤基于与huZP3"w"完全保守的已鉴定mZP3""80—个BCE肽段的报道(Lou YH, McElveen MF, Garza KM, Tung KSK. Rapid induction of autoantibodies by endogenous ovarian antigens and activated T cell. J Immunol, 156: 3535-3540, 1996),先用pXXStv-l质粒融合表达了huZP3W""和huZP3^，两个短肽，用兔 抗huZP3m^抗血清的免疫印迹试验表明huZP3W"，肽段中存在一个线性 BCE，但它的表位基序是位于177-l卯肽段中(兔抗huZP3"w"和huZP3""M抗血 清都不识别huZP3172—181)。进而合成huZP3'"—190的各重叠7个残基的系列8肽编码基因，融合表达产物再 次用兔抗huZP3177—'，抗血清进行免疫印迹鉴定，依据产生印迹反应的两个肽段 EENWNAEK177,，和ENWNAEKR卧'肪共有顺序，最终确定该BCE基序是ENWNAEK"8—'糾。本发明的主要优点在于(a) 提供了能替代短肽化学合成的生物合成(融合表达形式)原核表达质粒；(b) pXXStv-l热诱导表达质粒操作方便，而且更经济(无需加IPTG诱导)，也避免了目的融合蛋白泄漏表达的情况；(c) pXXStv-l和pXXStv-2热诱导表达质粒，也可用于表达与Stv融合的其他目的大分子蛋白。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照 常规条件和[美]J.萨姆布鲁克和D. W.拉塞尔编著黄培堂等译的第三版《分子克 隆实验室手册》(科学出版社，2002)中所述的步骤，或按照生产销售商所建议的 条件进行。实施例
材料和方法1. 热诱导表达质粒pSY621(图1)和大肠杆菌BL21(DE3)菌株购自。2. 所设计Stv编码基因的正负链16个(八对)DNA碱基片段由上海捷瑞生物工 程有限公司合成。3. 限制性内切酶EcoR I、 BamH I、 Sal I和Pst I以及T4DNA连接酶购自日 本TaKaRa Biotecchnology公司，蛋白质低分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊 抗兔二抗(IgG /服P)、 二氨基联苯胺(DAB)和硝酸纤维索膜购自华美生物工程公司 产品。DNA分子量标准(50 bp DNA Ladder)购自天根生化科技公司。4. QIApr印spin minipr印Kit质粒抽提试剂盒、QIAquick PCR产物纯化i式 剂盒和quick凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司。5. 兔抗huZP3a和huZP3b抗血清购自上海市计划生育科学研究所。实施例lpXXStv-1和pXXStv-2重组质粒制备具体步骤如下1. 具118个残基Stv核心蛋白4°—'"编码基因的八对16条互补DNA片段设计 Stv核心蛋白的氨基酸顺序序列见SEQ ID NO: 1，对应的核苷酸顺序序列见SEQ ID NO: 2。全长363个碱基对Stv核心蛋白肽段编码cDNA，包括在5'-增加1个粘性EcoR I位点和ATG翻译起始密码子以及3'-增加1个粘性BaraH I位点的分段设计在计 算机辅助下完成，以确保两两相邻DNA片段之间产生合适的6 8个碱基互补区段。2. Stv基因的拼接外送合成的31聚到57聚的DNA片段，分别加ddH20稀释成20 pmol/|al,经 16%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定它们的纯度后，各取16 pi (不包括正负链 5，-端两个片段)在0. 5 pi 10U/|al的T4多核苷酸激酶(外加2 pi 10 mmol/L ATP) 催化下进行14个片段的5'-端磷酰化。继之使正负链对应互补片段分别两两退火 复性(94'C加热5 min，自然降至室温)，再通过DNA连接酶反应让相邻的DNA片段 分三次两两相连，将最后一次完整基因连接反应液进行5。/。非变性PAGE分离，溴乙 锭(EB)染色，在长波长紫外光下切割对应核苷酸分子量350bp处含全长基因片段的 凝胶，用"压碎浸泡法"(经加入0.5 M Nacl溶液后放置37"过夜、离心取上清
液和酚氯仿抽提DNA等步骤)回收DNA片段。3. pXXStv-l (pSY621-Stv)质粒构建用EcoR I和BaraH I双酶切pSY621质粒(图1，购自复旦大学遗传所)，反应液 走琼脂糖凝胶后用凝胶回收试剂盒回收酶切线性质粒；用DNA连接酶在pSY621中 重组插入Stv编码DNA片段；连接液转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌，挑取在氨苄 LB平板上的克隆外送进行DNA插入片段测序；用Sal I和Pst I双酶切测序正确 的pSY621-Stv质粒；合成一对在粘性Sal I和Pst I之间插入TAATAG终止密码子 的DNA片段，退火复性后重组插入pSY621-Stv质粒，继而连接液转化BL21 (DE3) 宿主菌，挑选克隆外送进行DNA测序；测序正确的在SalI位点后插入两个终止密 码子的pSY621-Stv质粒被命名为pXXStv-1;测序正确的阳性克隆扩增培养后抽取 pXXStv-1 (图2)，作为第一表达载体保藏于-2CTC冰箱。4. pXXStv-2质粒构建依据加ATG的Stv编码cDNA序列，设计目的在其3'-端尾增加1个TM终止 密码子的一对PCR扩增引物(配对正负链两端分别带EcoR I和BamH I位点)；在 94。C预变性3min， 94。C变性35sec， 55'C退火35 sec，完成35个循环后72'C延 伸60 sec的条件下，用合成引物扩增形成完整读框的Stv核心蛋白编码基因片段； 用EcoR I和BamH I双酶切用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段，重组插入用 同样两个酶酶切的pSY621-Stv质粒中，转化宿主菌后挑取阳性克隆外送DNA测序； 测序正确的在Stv编码片段3，-端添加TAA的pSY621-Stv质粒被命名为pXXStv-2; 测序正确的阳性克隆扩增培养后抽取pXXStv-2 (图3)，作为本发明第二表达载体保 藏于-2(TC冰箱。重组质粒pXXStv-1的DNA正链序列如SEQ ID NO: 3所示，全长为3989bp。 实施例2用pXXStv-1和pXXStv-2质粒的短肽融合表达法鉴定huZP3 —个线性抗原表位Lou等人曾经报道，从覆盖全长mZP3蛋白和相邻肽段重叠10个残基的系列 20聚肽中，鉴定出mZP3171—18°肽内存在一个线性BCE(Lou YH， McElveen MF, Garza KM, Tung KSK. Rapid induction of autoantibodies by endogenous ovarianantigens and activated T cell. J Immunol, 156: 3535-3540， 1996)，而huZP3172—190的 残基顺序与之完全保守。因此，本发明人尝试借助本发明构建的pXXStv-l完成短 肽生物合成，并用制备的抗hnZP3a22—176和抗huZP3b177—348抗血清扫描鉴定huZP3172—19° 肽段中是否也存在一个BCE，进而鉴定其BCE基序，从而提供以Stv核心蛋白为载 体和热诱导表达系统进行短肽生物合成和抗原表位鉴定的实例。 huZP3172—19°肽段中BCE所在区段的初步鉴定第一步依据公开信息(Chamberlin ME, Dean J. Human homolog of the mouse sperm rec印tor.尸roc vfeW Zcat/5"ci 〃5>1， 87:6014-6018, 1990)，先人工化学 合成编码huZP3172—^和huZP3172—19°的DNA片段(配对复性片段两端分别带一个BamH I 或Sal I粘性位点)，将1或2个0D的互补正负链片段用ddH20溶解成20 (imol/)il 储存液(根据DNA合成报告单数据)；各取10 pi储存液和20 ddH20于1.5 ml Eppendorf管中，94。C水浴加热5 min,自然降至室温后，在15 |il反应体积中吸 入2 pi退火片段、1 约200 ng/|il经BamH I和Sal I双酶切的pXXStv-1质 粒、1 |il T4 DNA连接酶和其1. 5 pi缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21 (DE3) 宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37"培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上 长出的单克隆转接平板或扩增培养抽提质粒后外送进行DNA测序；第二步将插入片段测序结果正确的克隆接种加入A即的3 ml LB培养液中， 于3(TC振荡培养过夜，翌日晨按l/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，3(TC 振荡培养2 3 h至菌体浓度达到0. 6 0. 8 0D后，调高温度至42'C热诱导4 h， 离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5 min备用；第三步将诱导和未诱导细菌蛋白样品同时走15。/。SDS-PAGE,电泳结束后，一 块凝胶用考马斯亮蓝染色， 一块进行硝酸纤维素膜电(100 mA)转移2 h，用丽春红 染膜2 min，在目的短肽融合蛋白条带处用针头打孔标记，将膜一切为二(上样蛋 白样品一致)，用水冲洗掉丽春红染色；第四步印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5%脱脂奶粉封闭过夜，PBS 缓冲液洗涤四次，分别在8 10 ml反应液中加入30 pl兔抗huZP3a22—176或抗 huZP3b177—348抗血清(一抗)，室温反应2 h， PBS缓冲液洗涤后加入10 pl羊抗兔IgG /HRP(二抗)，室温反应1 h，用PBS缓冲液洗涤后进行DAB显色。结果如图4所示。图4A， huZP3'72—'s'和huZP3172—，融合表达的SDS-PAGE检测图。B， huZP3'72—'81 和huZP3'72,短肽的免疫印迹图。各泳道如下1，蛋白分子量标准；2和3， huZP3'72—181
短肽未诱导和诱导菌总蛋白；4和5， huZP3172—19°短肽未诱导和诱导菌总蛋白；6 和7， Stv未诱导和诱导菌总蛋白。另外，huZP3b177—，抗体能识别huZP3172—'9°短肽，这表明该线性BCE存在于huZP3 蛋白顺序177到190位之间。实施例3huZP3 177—348肽段中BCE基序精细鉴定在实施例2的实验结果基础上和依据huZP3 cDNA顺序，人工合成编码覆盖 huZP3177—19°区段连续相互重叠7个残基的7个八肽正负链DNA片段，以后从合成片 段配对退火、重组插入pXXStv-l质粒、测序、诱导表达、SDS-PAGE检测到用 huZP3b177—348特异抗体的免疫印迹试验，步骤和过程同实施例2。结果如图5-7所示。图5为huZP3""'J，七个不同8肽融合表达的SDS-PAGE检测图。各泳道如下 1，蛋白分子量标准；2和3， MEENWNAE177—184短肽诱导和未诱导菌总蛋白(箭头指示 目的表达产物位置，下略)；4和5， EE丽NAEK178—'85短肽诱导和未诱导菌总蛋白;6 和7， E丽NAEKR179—186短肽诱导和未诱导菌总蛋白；8和9， NWNAEKRS'8°—187短肽诱导和 未诱导菌总蛋白；lO和ll，丽AEKRSP181—,短肽诱导和未诱导菌总蛋白；12和13， NAEKRSPT182—鹏短肽诱导和未诱导菌总蛋白；14和15， AEKRSPTF183—19。短肽诱导和未 诱导菌总蛋白。图中，在细菌总蛋白上样量基本一致的情况下，未热诱导对照栏都未见目的 短肽融合蛋白明显泄漏表达，热诱导栏都能看到表达量基本一致的靶短肽融合蛋白 高表达。图6为huZP3177Sjl9°7个不同8肽融合蛋白表达的SDS-PAGE检测图。各泳道如 下I和IO， MEENWNAE1"—^和EE丽NAEK178—185融合蛋白未诱导菌总蛋白阴性对照；2， 蛋白分子量标准；3 9， MEE酬AE177—184、 EEN丽AEK178—185、 ENWNAEKR179—186、 NWNAEKRS18。—187、 丽AEKRSP181—188、 NAEKRSPT182—'89和AEKRSPTF183—19°诱导菌总蛋白。图7为使用兔抗重组人ZP3肽177—348抗血清的7个不同8肽融合蛋白的免疫印 迹图。各泳道如下1和10， MEE誦AE177—184和EENWNAEK178—185融合蛋白未诱导菌总蛋 白阴性对照；2，蛋白分子量标准；3 9，MEE丽NAE177—184、EENWNAEK're—185、ENWNAEKR179—'86、 N丽AEKRS18。—187、 WNAEKRSP181-188、 NAEKRSPT182—189和AEKRSPTF183—19。诱导菌总蛋白。(各栏 上样蛋白样品同图6)图中在各目的8肽融合蛋白上方产生大肠杆菌抗原特征印迹条带，在它们的条带下方，唯见3和4栏的MEENWNAE177—184和 EE丽NAEK178—185融合蛋白与兔抗重组人ZP3肽177—348抗血清产生清晰的印迹条带， 依据两者共有残基顺序，可判定EENWNAE178—184基序为人ZP3蛋白的一个线性 BCE。实施例4huZP3 177—348肽段中BCE基序的鉴定重复实施例2和3,不同点在于将短肽的长度由8肽分别改为6肽、12肽、18 肽、和20肽。结果获得了相同的结果，即EENWNAE178—^基序为人ZP3蛋白的一个线性BCE。 显然，以上短肽融合表达的pXXStv-1和pXXStv-2质粒构建，特别是用之具 体扫描确定了人ZP3 —个线性BCE在该蛋白氨基酸顺序中的位置及其表位基序，为 今后蛋白类抗原表位的扫描鉴定提供了经济、操作相对方便，因而易在大多数实验 室开展应用的一种新方法——生物合成肽法。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权 利要求书所限定的范围。
序列<110〉上海市计划生育科学研究所 复旦大学 上海科学院<120〉以链亲和素为载体的短肽融合表达热诱导重组质粒及其制备方法 <130〉 073764 <160〉 3<170〉 Patentln version 3.4<210> 1<211〉 354<212〉 廳<213〉 人工序列<220><221〉 misc—feature 〈223〉 Stv编码序列<400〉 1ggcatcaccggcacctggtacaaccagctcggctcgaccttcatcgtgaccgcgggcgcc60gacggcgccctgaccggaacctacgagtcggccgtcggcaacgccg柳gccgctacgtc120ctgaccggtcgttacgacagcgccccggccaccgacggc已gcggcaccgccctcggttgg180acggtggcctggaagaataactaccgcaacgcccactccgcgaccacgtggagcggccag240tacgtcggcggcgccgaggcgaggatcaacacccagtggctgctgacctccggcaccacc300gaggccaacgcctggaagtccacgctggtcggccacgacaccttcaccaaggtg354<210〉 2<211〉 118<212〉 PRT <213〉人工序列<220〉<221> inisc—feature <223〉 Stv氨基酸序列<400〉 2Gly lie Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr Pro lie Val15 10 15Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val20 25 30Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala 35 40 45Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly50 55 Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr 65 70 75Tyr VaJ Gly Gly AI3 Glu Ala Arg lie Asn Thr85 90 Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Val Lys Ser100 105 Asp Thr Phe Thr Lys Val 115Trp Thr Val Ala Trp 60Thr Trp Ser Gly Gin 80Gin Trp Leu Leu Thr 95Thr Leu Val Gly His 110<210〉 3<211> 3989<212〉 DNA <213>人工序列<220><221> misc—feature〈223〉 重组质粒pXXStv-1的DNA正链序列<400〉 3ttagg,agaattcatgggcatcaccggcacctggtacaaccagctcggctcgaccttc60atcgtgaccgcgggcgccgacggcgccctgaccggaacctacgagtcggccgtcggcaac120gccgagagccgctacgtcctgaccggtcgttacgacagcgccccggccaccgacggcagc180ggcaccgccctcggttggacggtggcctgga^gaataactaccgcaacgcccactccgcg240accacgtggagcggccagtacgtcggcggcgccgaggcgaggatcaacacccagtggctg300ctgacctccggcaccaccgaggccaacgcctggaagtccacgctggtcgg360ttcaccaaggtgggatccgtcgactaatagctgcagccaagcttggctgttttggcggat420tttcagcctgaatcagaacgc卿agcggtctgataaaac480agaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccg540tgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcg柳gtagggaactgcc600ggctcagtcg犯卿ctgggcctttcgttttatctgttgt660ttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcg720犯gcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaatt780,cag肌ggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttttgtttatt840tttctaaatac at t c aaat atgtatccgcttaaccctgataaatgcttca900gtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctt960ttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtga1020tgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttac3tcg犯ctggatctcaacagcggtaa1080gatccttgagagttttcgccccgaag犯cgttttccaatgatgagcacttttaaagttct1140gctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcat1200acactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacgga1260tggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggc1320caacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcac犯cat1380gggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagc cataccaaa1440cgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaac t at t aac1500tggcgaactacttactctagcttcccggcaacaat taatagactggatggaggcggataa1560agttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatc1620tggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagcc1680 <image>image see original document page 25</image>
权利要求
1. 一种可用于耙抗原B细胞表位扫描的产品，其特征在于，所述产品包括 0)下式I所示的融合蛋白，Z-A 式(I)式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；A为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及(b)下式II所示的对照蛋白，Z-cooh 式(II)式中，Z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为IOO个氨基酸的链亲和素蛋白片段；附加条件是式I和式II中的z是相同的。
2. 如权利要求l所述的产品，其特征在于，所述的产品包括2-100个式I所示的融合蛋白。
3. 如权利要求1或2所述的产品，其特征在于，各式I所示的融合蛋白中所携带 的短肽来自同一个蛋白的。
4. 如权利要求l所述的产品，其特征在于，所述的载体蛋白元件的氨基酸序列 如seq ID no: 2所示。
5. —种可用于耙抗原B细胞表位扫描的产品，其特征在于，所述的产品包括:(i) 第一核酸分子，所述的第一核酸分子编码下式I所示的融合蛋白，Z-A 式(I) 式中，Z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为 IOO个氨基酸的链亲和素蛋白片段；A为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及(ii) 第二核酸分子，所述的第二核酸分子编码下式II所示的对照蛋白，z隱cooh 式(n)式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为IOO个氨基酸的链亲和素蛋白片段； 附加条件是式I和式II中的Z是相同的。
6. —种可用于靶抗原B细胞表位扫描的产品，其特征在于，所述的产品包括:(i) 第一表达载体，所述的第一表达载体为热诱导型且含有第一核酸分子，所 述的第一核酸分子编码下式I所示的融合蛋白，Z-A 式(I)式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；A为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及(ii) 第二表达载体，所述的第二表达载体为热诱导型且含有第二核酸分子，所述的第二核酸分子编码下式n所示的对照蛋白，Z-COOH 式(II)式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为IOO个氨基酸的链亲和素蛋白片段；附加条件是式i和式n中的z是相同的。
7. 如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述的第一表达载体依次含有以下 元件复制起点(ori)、 Clts857元件、PrPl元件、Stv元件、多克隆位点、和抗性筛 选基因，其中多克隆位点用于将式I中A元件的编码序列插入在Stv元件的下游，以 形成式I所示的融合蛋白。
8. —种可用于靶抗原B细胞表位扫描的产品，其特征在于，所述的产品包括 (i)第一宿主细胞，所述的第一宿主细胞含有第一表达载体，所述的第一表达载体中含有第一核酸分子，所述的第一核酸分子编码下式I所示的融合蛋白，Z-A 式(I)式中，Z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为 IOO个氨基酸的链亲和素蛋白片段；A为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及(i)第一宿主细胞，所述的第一宿主细胞含有第二表达载体，所述的第二表达 载体含有第二核酸分子，所述的第二核酸分子编码下式II所示的对照蛋白，Z-COOH 式(II) 式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为 100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；附加条件是式I和式I沖的z是相同的。
9. 如权利要求l、 5、 6或8中任一所述的产品的用途，其特征在于，用于靶抗 原b细胞表位扫描。
10. —种靶抗原b细胞表位扫描方法，其特征在于，包括步骤(a) 在相同条件下，培养第一宿主细胞和第二宿主细胞，并诱导所述的宿主细胞分别表达式i和式n所示的蛋白；其中所述的第一宿主细胞含有第一表达载体，所述的第一表达载体中含有第 一核酸分子，所述的第一核酸分子编码下式I所示的融合蛋白，z-a 式(I)式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；a为长度为6-20个氨基酸的短肽；以及所述的第一宿主细胞含有第二表达载体，所述的第二表达载体含有第二核酸分子，所述的第二核酸分子编码下式n所示的对照蛋白，z-cooh 式(n) 式中，z为载体蛋白元件，所述的载体蛋白元件是链亲和素蛋白或长度至少为100个氨基酸的链亲和素蛋白片段；附加条件是式i和式n中的z是相同的；(b) 将表达的式I所示的融合蛋白和式II所示的对照蛋白分别与抗体混合，观察抗体是否与式i所述的融合蛋白和式n所示的对照蛋白发生抗体-抗原反应；其中，如果抗体与式i所述的融合蛋白发生抗体-抗原反应而与式n所示的对照蛋白不发生抗体-抗原反应，那么就表述所述融合蛋白中的a元件是一靶抗原b细胞表位。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，具体地涉及采用链亲和素(Stv)核心蛋白作为目的短肽(6-20肽，如8肽或18肽)生物合成载体，可专供抗原表位扫描鉴定用的原核生物热诱导Stv重组表达质粒及其制备方法。本发明的实验证明了Stv作为短肽融合表达载体以及热诱导pXXStv-1重组质粒在抗原表位扫描鉴定方面的适用性和应用性。
文档编号G01N33/68GK101121752SQ20071004326
公开日2008年2月13日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者何亚萍, 季朝能, 徐万祥, 毅 谢, 顾少华 申请人:上海市计划生育科学研究所;复旦大学;上海科学院