专利名称：试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明试剂盒涉及生物技术，尤其是一种酶标记免疫检测技术，将链亲和素、生物素捕获技术应用于酶联免疫技术中，建立板式链亲和素双位点夹心一步法定量酶联免疫吸附试验(Streptavidin-ELISA)，用于检测患者血清cTnI水平。
在所有横纹肌中肌钙蛋白复合体的功能相近，但是心肌TnT、TnI(cTnT，cTnI)与骨胳肌的TnT、TnI在结构上有很大的不同，分别由不同的基因编码。编码心肌TnT的基因只在胚胎期在骨胳肌中有短暂表达，因此可用免疫学方法将心肌和骨胳肌的TnT、TnI区别开来。心肌TnC与骨胳肌TnC相同，因此检测方法应用价值不大。
心肌TnT检测方法由Katus等人于1989年报道[Katus HA，RemppisA，Looser S et alJ mol cell cardiol 1989；211349]。该方法是基于亲和纯的多抗和一种单抗建立起来。1992年罗氏(当时为宝灵曼)诊断产品公司推出了第一代心肌TnT EIA检测试剂盒。固相采用链亲和素(Streptavidin，SA)-牛血清白蛋白复合物包被的聚苯乙烯管，第一单抗用生物素标记，通过SA间接固定到固相上，第二单抗用辣根过氧化物酶标记。检测范围0.1-15μg/L。与骨胳肌的交叉反应性约2％，在不存在肌肉损伤的情况下，该水平的交叉反应性对诊断特异性影响不大。但是对有肌肉损伤或肌病患者，检测结果可能会受到影响。因此为了提高检测方法的特异性，1997年推出了第二代TnTEIA检测试剂盒，骨胳肌TnT浓度达到1000μg/L时，用第二代方法也不会出现交叉反应。1999年第三代以钌作标记的电化学发光TnTElecsysl010&2010也已推向市场。
1987年Cummins等人首先报道检测cTnI的RIA法[Cummins B，Auckland MC，Cummins P et alAm Heart J.1987；1131333]。目前，心肌TnI的定量和定性检测方法已有多种，包括竞争放免测定法、酶免疫测定法、金免疫层析法等。由于各种方法的灵敏度不一样，TnI的正常参考值变动较大10μg/L、3.8μg/L、0.35μg/L、0.1μg/L均有报道。研究资料表明，cTnT与cTnI水平的符合率可达90％，cTnT+/cTnI-为8.9％，cTnT-/cTnI+1.1％[Robert H，Christenson，Snow-Hong D et alClinical Chemistry 1998，44(3)494]。近年的研究认为，对于某些肾功能不全的病人及肌病患者，TnI的特异性高一些。
目前，cTnT和cTnI作为诊断心肌损伤的确定标志物，因其诊断灵敏性高、特异性强，有逐渐替代“金标准”CK-MB的趋势。国内均使用相应的进口试剂盒，价格昂贵，难在临床广泛使用。
正常情况下，心肌肌钙蛋白I在血中的含量很低(＜0.1μg/L)，一般酶免疫测定方法的敏感度达不到此要求。为了提高检测系统的敏感度，本发明提出一种新的技术方案。
本发明目的可通过下述技术方案实现的为了提高检测系统的敏感度，本发明是通过链亲和素一生物素捕获系统将抗体、抗原或免疫复合物间接地固定于固相之上。以链亲和素固相捕获技术及酶免疫技术为基础，建立板式链亲和素固相双位点夹心一步法ELISA定量检测血清cTnI，可供心脏梗死确诊使用，对于怀疑有AMI的胸痛病人，可以通过连续动态监测cTnI方法判断其预后。
在上述技术方案基础上，采用链亲和素固相，生物素标记一种抗cTnI单克隆抗体，辣根过氧化酶标记另一种单克隆抗体，建立板式链亲和素固相双位点夹心一步法。
在本发明中，与普通亲和素相比，链亲和素是一种偏酸性的蛋白质，等电点为5-6，且不含碳水化合物。因此用链亲和素包被酶标板可使阴性本底明显降低。应用该技术制备的酶标板具有稳定性能好、用途广泛等优点。有些物质，如半抗原、多肽、核酸等，很难直接包被到聚苯乙烯板上，但很容易制备成生物素化的结合物而对SA酶标板作间接包被。但SA直接包被需包被量较大。据文献报道，对抗体进行酸处理或热变性后[Conradie JD，Govender M，Visser L，et alJ.Immunol Method 1983；59289]，可改善抗体的包被效果，检测灵敏度可提高2-6倍。其机理可能是①改善了抗体的方向性，即更多的Fc段与固相结合；②暴露了更多的疏水性基团；③变性引起的聚合作用增加了聚合单体的质量。本发明采用酸处理SA后，发现包被量可比末处理SA降低二倍以上，阴性本底更低，从而可使检测系统的敏感度得到明显改善，应用于cTnI的检测，能够基本上符合缺血性心肌损伤的诊断要求。
生物素化单克隆抗体的制备以及辣根过氧化酶标记的单克隆抗体的制备采用常用的方法。标记结合物分别加等体积的甘油，-4℃可保存2年以上。
本发明优越性在于板式链亲和素-ELISA定量检测血清cTnI的方法具有简便、快速、低阴性本底和低成本。方法学考核表明本发明方法的最低检测限可达0.3ng/ml，批内差异3.5％-5.0％，批间差异7.6％-9.3％。与进口试剂对比试验证实，用本发明方法测得的cTnI水平与ELC cTnT(Elecsys 2010，Roche)测得的cTnT水平的符合率为88.2％，ECL cTnT阳性/本法cTnI阴性为9.8％，ECL cTnT阴性/本法cTnI阳性为2.0％；与化学发光法测得的cTnI(ACS180，Bayer)的阳性符合率为83.3％，阴性符合率为100％。说明本方法对检测血清cTnI有商用开发价值。
通过下述附图和实施例对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明范围。
图2是板式链亲和素固相双位点夹心一步法ELISA定量检测血清cTnI的定量标准曲线。
图3是用本方法测定的cTnI水平与采用进口电化学发光cTnT试剂测定的cTnT水平的符合率。
图4是本方法与进口化学发光cTnI试剂的对比测定结果。
链亲和素固相的制备取50μl链亲和素(1mg/ml)加入200μl蒸馏水稀释，再加50μl 3mol/l醋酸，室温放置5min，用2mol/l Tris调至pH 6.0，然后，用包被缓冲液(0.05mol/l，pH 9.5碳酸缓冲液)稀释成2μg/ml，加入聚苯乙烯ELISA微孔板，120μl/孔4℃过夜，用洗涤液洗涤3次，加入封闭液(0.5％BSA，0.02mol/l，pH 7.2 PBS)37℃1小时，弃去封闭液，吹干备用。
生物素化抗体的制备单克隆抗体腹水提纯采用辛酸法，生物素标记单克隆抗体方法参考文献 [Ternynck T，Avramer SMethods inEnzymology 1990；184469]，lmg/ml抗体溶液中以1∶100摩尔数之比加入NHS-LC-biotin，混匀后室温放置2小时，装入透析袋对PBS，0.02mol/l，pH 7.2透析48小时，加等体积甘油，-20℃储存备用。
酶标记抗体的制备辣根过氧化物酶(HRP)5mg溶于0.5ml双蒸水中，加0.06mol/l过碘酸钠0.5ml 4℃反应30分钟，然后，再加0.16mol/l乙二醇室温反应30分钟后，与1ml浓度为2mg/ml的抗体溶液混合，对0.05mol/l，pH 9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜。透析物与0.2ml，0.5％的四氢硼酸钠4℃反应2小时，加等量饱和硫酸铵4℃搅拌30分钟，1000g离心15分钟。沉淀溶于pH 7.4，0.02mol/lPBS中，对同样缓冲液透析过夜，加稳定剂-30℃保存。
实施例二双位点夹心一步法ELISA定量检测血清cTnI方法如
图1是本发明创建的板式链亲和素固相双位点夹心一步法ELISA定量检测血清cTnI的操作流程图所示，链亲和素预包被微孔板每孔加入20μl抗原标准品或持测血清样品，然后加100μl生物素化抗TnI单抗(约2μg/ml)及辣根过氧化物酶标记另一抗TnI单抗的混和液(pH7.2，0.02mol/l磷酸缓冲液)，37℃反应90分钟，洗涤。加邻苯二胺(0PD)底物液，37℃，15分钟，加2mol/l硫酸终止反应。酶标仪上测490nm处的吸光值(A)，以A490nm为纵坐标，各TnI浓度为横坐标，绘制标准曲线。
方法学考核标准曲线用纯化的牛心肌TnI抗原，经Bayer公司的TnI试剂盒(TnI)定量后，用正常人血清(TnI含量＜0.01ng/ml)稀释成TnI含量为0.3，1.0，3.0，8.0，15，30ng/ml各参照标准品，用本发明建立的方法进行定量，以A490nm为纵座标，各TnI参照标准品含量为横座标绘制标准曲线，如图2板式链亲和素固相双位点夹心一步法ELISA定量检测血清cTnI的定量标准曲线所示。
最低检测量用TnI为0的标准品，作12复管测定，计算平均吸光值为0.196(SD 0.027)。以平均值+2SD计算，0.3ng/ml标准品的0D值高于此计算值，所以最低检测限是0.3ng/ml。
精密度取TnI含量高(15ng/ml)、低(约3ng/ml)的2份血清标本分别做批内(8复管)和批间(连续8天)检测，结果批内CV3.5％，5.0％，批间CV为7.6％，9.3％。
对比试验见图3用本发明方法测定的cTnI水平与采用进口电化学发光cTnT试剂测定的cTnT水平的符合率，图中，1-n＝45，88.2％；2-n＝5，9.8％+cTnT/-cTnT；3-n＝1，2.0％，-cTnT/+cTnT图4本发明与进口化学发光cTnI试剂的对比测定结果所示，51例病人的血清经电化学发光cTnT试剂(ECL cTnT；Elecsys 2010，Roche)测定，阳性cut-off值定＞0.1ng/ml时，阳性例数15例，阴性例数36例。用本发明建立的方法对比测定，cTnI水平与cTnT水平同时升高例数10例，符合率为66.7％，cTnI和cTnT水平均正常的例数35例，符合率97.2％，总符合率88.2％，ECL cTnT阳性/本法cTnI阴性例数5例，占9.8％，ECL cTnT阴性/本法cTnI的阳性数有l例，占2.0％。与进口化学发光cTnI试剂(ACS180，Bayer)的阳性符合率为83.3％，阴性符合率为100％。
权利要求
1，一种试剂盒，在ELISA试剂盒基础上，其特征是通过链亲和素—生物素捕获系统将抗体、抗原或免疫复合物间接地固定于固相上，建立板式链亲和素双位点夹心一步法。
2，根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述板式链亲和素固相双位点夹心一步法是用链亲和素预包被酶标板，生物素标记抗cTnI单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记另一株抗cTnI单克隆抗体。
3，根据权利要求1、2所述的试剂盒的用途，其特征是用板式链亲和素固相双位点夹心一步法定量检测血清cTnI。
4，根据权利要求1、2所述的试剂盒制备方法，其特征是板式链亲和素固相双位点夹心一步法的制备方法，第一，链亲和素固相的制备取50μl、1mg/ml链亲和素加入200μl蒸馏水稀释，再加50μl 3mol/l醋酸，室温放置5min，用2mol/l Tris调至pH 6.0，然后用包被缓冲液(0.05mol/l，pH 9.5碳酸缓冲液)稀释成2μg/ml，加入聚苯乙烯ELISA微孔板，120μl/孔4℃过夜，洗涤液洗3次，加入0.5％BSA、0.02mol/l、pH 7.2 PBS封闭液，37℃、1小时，弃去封闭液，吹干备用；第二，生物素化抗体的制备单克隆抗体腹水提纯采用辛酸法，生物素标记单克隆抗体1mg/ml抗体溶液中以1∶100摩尔数之比加入NHS-LC-biotin，混匀后室温放置2小时，装入透析袋，对0.02mol/l、pH 7.2 PBS透析48小时，加入等体积甘油，在-20℃储存备用；第三，酶标记抗体的制备辣根过氧化物酶5mg溶于0.5ml双蒸水中，加0.06mol/l过碘酸钠0.5ml、4℃反应30分钟，再加入0.16mol/l乙二醇室温反应30分钟后，与1ml浓度为2mg/ml的抗体溶液混合，对0.05mol/l，pH 9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，透析物与0.2ml，0.5％的四氢硼酸钠4℃反应2小时，加等量饱和硫酸铵4℃搅拌30分钟，1000g离心15分钟，沉淀溶于pH7.4、0.02mol/l PBS中，对同样缓冲液透析过夜，加稳定剂-30℃保存。
5，根据权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征是用板式链亲和素固相双位点夹心一步法ELISA定量检测血清cTnI的方法，链亲和素预包被微孔板，每孔加入20μl抗原标准品或持测血清样品，然后加100μl生物素化抗TnI单抗2μg/ml及辣根过氧化物酶标记另一抗TnI单抗的混和液，用pH 7.2、0.02mol/l磷酸缓冲液，37℃反应90分钟后洗涤；加邻苯二胺(OPD)底物液，37℃、15分钟，加2mol/l硫酸终止反应；酶标仪上测490nm处的吸光值(A)，以A490nm为纵坐标，各TnI浓度为横坐标，绘制标准曲线；所述标准曲线是用纯化的牛心肌TnI抗原，经Bayer公司的TnI试剂盒(TnI)定量后，用正常人血清TnI含量＜0.01ng/ml，稀释成TnI含量为0.3、1.0、3.0、8.0、15、30ng/ml各参照标准品，进行定量，以A490nm为纵座标，各TnI参照标准品含量为横座标绘制标准曲线，其中，最低检测量用TnI为0的标准品，作12复管测定，计算平均吸光值，以平均值+2SD计算，最低检测限是0.3ng/ml。
全文摘要
本发明试剂盒涉及生物技术，尤其是一种可用于酶标记免疫检测技术，将链亲和素、生物素捕获技术应用于酶联免疫技术中，建立板式链亲和素双位点夹心一步法定量酶联免疫吸附试验，用于检测患者血清cTnI水平。本发明在ELISA方法基础上，通过链亲和素—生物素捕获系统将抗体、抗原或免疫复合物间接地固定于固相上，建立板式链亲和素双位点夹心一步法ELISA定量检测血清cTnI。本发明是用链亲和素预包被酶标板，生物素标记抗cTnI单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记另一株抗cTnI单克隆抗体。本发明具有简便、快速、低阴性本底等优点。与相关进口试剂对比二者有较高的符合率，本发明用于检测血清cTnI有良好的开发使用价值。
文档编号G01N33/535GK1402005SQ0213704
公开日2003年3月12日 申请日期2002年9月19日 优先权日2002年9月19日
发明者郑佐娅, 王鸿利 申请人:上海第二医科大学