专利名称：一种基因芯片的酶联显色检测法及其专用读片仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸检测技术，特别是涉及一种基因芯片的酶联显色检测法及其专用读片仪。
背景技术：
将大量的生物大分子有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500μm)排列在玻璃、硅等载体上，称之为生物芯片。其中使用最广泛，技术亦最成熟的是基因芯片，也叫基因微矩阵(Microarray)。利用基因芯片可以快速获取和处理大量的生命信息。
目前，在基因芯片杂交结果的检测中应用最广的是荧光标记检测法，其具有毒副作用小、灵敏度高以及可进行多样本平行处理等优点。
然而，由于该检测方法常用的一些荧光标记物如Cy3或Cy5等在实际应用过程中很容易猝灭，故会对实验操作带来不便。此外，荧光标记物本身价格不菲；再加之使用该检测方法就必须要使用价格昂贵的信号读取设备——激光共聚焦扫描仪，故实验成本非常高，从而极大地制约了基因芯片技术在临床医学诊断中的应用。
中国专利公开号CN 1323984A，
公开日2001年11月28日，发明名称为“一种基因芯片的显色检测法”，该申请案公开了一种新的检测方法，即在待测样本的PCR扩增过程中，加入地高辛或生物素标记，然后将PCR产物与芯片进行杂交，杂交以后用抗体与地高辛或生物素标记结合，再加入显色液就可得到相应的信号，再用一般的光学扫描仪进行检测分析。其缺点是由于芯片表面对底物的吸附作用较弱，所以杂交信号较弱，检测灵敏度低于荧光检测法，当样本DNA含量较低时，则不易被检测出来。
中国专利公开号CN 1330155A，
公开日2002年1月9日，发明名称为“一种基因芯片的膜转印检测法”，该申请案则是在上述检测方法的基础上有所改进，即在抗体和地高辛或生物素标记结合后，再用浸润了显色液的尼龙膜或者硝酸纤维膜将杂交结果转印到膜上，从而提高杂交信号强度，使检测灵敏度与荧光法基本相同，弥补了显色法的不足。其缺点有三1.操作步骤繁琐，实验成本高；2.用浸润了显色液的膜显色，增加了背景噪声，检测信噪比低；3.使用普通光学扫描仪，在成像效果上仍不甚理想。
另外，在芯片读片仪方面，中国专利授权公告号CN 2450662Y，授权公告日2001年9月26日，名称为“生物芯片阅读仪”的实用新型专利公开了一种利用CCD成像技术的芯片读片仪，其特点如下1.采用线阵CCD，以扫描方式成像，需有传动装置，故易出故障，且造价高，读片速度慢；2.采用反射式点光源，用凹透镜汇聚光源后用三色棱镜形成色散，这样可以选择合适的光色，提高CCD对颜色的分辨能力，其缺点是由于采用了凹透镜，光中央强，四周弱，无法做到照度均匀。以上诸多因素限制了基因芯片检测技术在业界的广泛应用。
发明内容
本发明克服了现有技术的缺点，提供了一种检测灵敏度与荧光法基本相等，且实验操作简便，成本低廉的基因芯片酶联显色检测法。
本发明还提供了一种专用于该检测法的生物芯片读片仪。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案即将传统的酶联显色反应技术应用于基因芯片杂交结果检测中，配合使用专用的读片仪进行信号的检测及分析。
具体地说，本检测方法包括如下步骤1)用生物素或地高辛标记的引物对待测样本DNA进行PCR反应扩增；2)将PCR反应产物和芯片杂交；3)洗片、酶联显色并用专用读片仪检测所述的样品处理和标记过程为将待测样本的DNA抽提液2ul与23ul PCR混合液及2.5U的Taq酶混合均匀后，通过PCR热循环过程制备生物素或地高辛标记的DNA样本目的片断，引物5’端加生物素或地高辛标记。扩增条件为首先95℃，5分钟，以95℃，30秒，58℃30秒，72℃20秒循环35次，最后，72℃延伸5分钟；用电泳法检测PCR产物。
所述的PCR产物与芯片的杂交过程为
取8μl PCR产物，加2.0ul阳性对照，加经75℃预热的杂交液3μl，混匀离心后置PCR仪94℃变性3分钟，迅速移至冰上，取样品全部加到芯片点样区域，加盖玻片(注意不能有气泡)；杂交舱里加几滴水，以保持湿度；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进48℃(±1℃)恒温箱中杂交30分钟。
所述的洗片、酶联显色及检测的过程为1)室温下，取出芯片，用溶液I冲掉盖玻片，然后放入20ml溶液I中摇床荡洗2分钟；2)将芯片取出，甩干。在点样区滴上POD稀释液(以盖住点样区为准)，加盖玻片，计时5分钟；3)将芯片转入20ml溶液II中，室温轻摇2分钟，洗两次，甩干；4)将芯片转入10ml显色液中，避光，显色5分钟，晾干即可；5)用专用读片仪进行检测和分析。
本发明之生物芯片读片仪是通过如下技术方案实现的它由机壳、底座、光源、载片台、光电耦合器、图像采集卡、计算机主机及外围设备组成；光源、载片台、光电耦合器依次垂直安装在底座上；载片台上放置芯片，载片台上设有一透光孔，光源发出的光线通过透光孔照射到芯片点样区上；机壳固定在底座上，机壳一侧面与载片台边缘相对处设有一开口；电缆把光电耦合器的传感输出接口与计算机主机的输入接口相连接。
所述光源为平面透射光源，可采用发光二极管阵列或者液晶面发光材料等实现平面光照面，为提高平面光照度均匀性，可在平面光源和载片台之间插入一层或多层毛玻璃；光源面积大于芯片点样区面积；其最低照度大于1.0 LUX，表面不均匀度小于1‰；。
所述载片台上设有一载片槽，芯片可嵌入载片槽内并可沿X轴(以光源发出的光线为Z轴)方向移动；载片槽上设有一透光孔，其面积大于或等于芯片点样区的面积。更佳的方案是在载片台上嵌有一可沿X轴方向移动的滑块，滑块上设有一载片槽，芯片可嵌入载片槽内；载片台和滑块载片槽上各设有一透光孔，其面积均大于或等于芯片点样区的面积。滑块的一端设有一拉柄，拉柄从机壳侧面开口处延伸至机壳外。此外，为防止芯片脱离载片槽，可在载片槽上、下缘用螺栓等加以限位。
所述光电耦合器为面阵CCD，由透镜组和CCD传感器组成，透镜组镜头焦距可调。所述载片台透光孔、滑块透光孔、光源、透镜组镜头、CCD传感器五者共轴。同时，载片台、载片台载片槽、滑块载片槽、光源、透镜组镜头、CCD传感器各光平面之间的夹角小于1
计算机主机内安装有A/D卡，其作用是将CCD传感器产生的图象模拟信号转化为数字信号。主机内其他部件以及计算机的外围设备均为常规现有技术，在此不作赘述。
用本发明之生物芯片读片仪进行检测和分析的过程为将杂交、显色后的芯片插入载片台或者滑块上的载片槽内，接通电源，沿X轴方向手动调节芯片的位置或者借助滑块拉柄手动调节滑块的位置，使平面光源发射出的光线通过载片台透光孔或者通过载片台透光孔和滑块透光孔照射到芯片点样区上，必要时可手动调节透镜组镜头的焦距，使检测结果聚焦成像在CCD传感器上，通过CCD传感器将光信号转化为电信号，由电缆将信号传送至计算机主机内的A/D卡，由其将电信号数字化，再使用专门编制的应用软件进行分析，最后从显示器上读取结果。
与现有技术相比，本发明的优点是在确保检测灵敏度和传统荧光法持平的前提下，简化了实验步骤，降低了实验成本。具体地说，其一，本发明的酶联显色方法实验操作简便；其二，本发明的生物芯片读片仪采用平面光源和面阵CCD，一次成像，读片速度快；无需传动装置，成像稳定，成像重复性好；照度均匀，成像效果好。同时，该仪器结构简单，易学易用；体积小巧，便于携带，造价也相对低廉。
图1是本发明的生物芯片读片仪的外观示意图。
图2是本发明的生物芯片读片仪的结构示意图。
图3是本发明的生物芯片读片仪载片台两种结构的(以A、B表示)示意图。
图4是本发明的生物芯片读片仪载片台结构B的分解示意图。
图5是用本发明方法检测，并用本发明的读片仪进行检测分析后所得结果。
图6是用荧光法检测，激光诱导的荧光检测仪扫描后所得结果。
具体实施例方式
下面结合本发明的实施例及其附图对本发明作进一步说明。
本发明基因芯片的酶联显色检测法的具体实施方式
如下1.准备材料与试剂1)DNA芯片自制(制备方法见“陈君男，李瑶，李亚莉等，寡核苷酸DNA Microarray用于HLA DRB1基因分型的研究。遗传学报，2001，28(10)887-894”)；
2)PCR混合液200μM dNTPs，各0.4μM上游及下游引物，引物的5’端用生物素或地高辛标记。
3)Taq DNA聚合酶，(购于上海生工生物工程技术服务有限公司)；4)PCR Thermo Hybaid购于Thermo Life Sciences公司；5)溶液I8×SSC，O.4％SDS；6)POD稀释液用溶液I和水稀释Streptavidin-POD(购于Roche公司)(0.5ulPOD+25ul溶液I+75ul H2O)；7)溶液II0.5×SSC+0.1％SDS；8)溶液III0.1mol/L柠檬酸钠，PH5.0；9)显色液配方10ml溶液III，0.125mlTMB(购于Roche公司)，6ul溶液IV(3％H2O2)(购于Roche公司)2.本发明的生物芯片读片仪由机壳1、底座2、光源3、载片台4、光电耦合器5、计算机主机及外围设备共同构成。
光源3、载片台4、光电耦合器5依次垂直安装在底座2上。光源3为由发光二极管阵列构成的平面光照面，面积3×2.2cm，照度为2.0 LUX，在光源3和载片台4之间插入一层毛玻璃以提高平面光照度的均匀性。
载片台4上嵌有一可沿X轴方向移动的滑块13，滑块13上设有一载片槽12，芯片可嵌入载片槽12内；载片台4上设有一透光孔9，面积为1.5×1.5cm，滑块载片槽12上设有另一透光孔10，面积为4×1.5cm，芯片点样区的面积为0.9×0.9cm。光源3发出的光线通过载片台透光孔9和滑块透光孔10照射到芯片点样区上。滑块载片槽12的上下缘用螺栓16限位以防芯片脱离载片槽。
机壳1固定在底座2上，机壳1侧面与载片台4边缘相对处设有一开口15；滑块13一端的拉柄14从机壳1侧面的开口15处延伸至机壳1外。
电缆8把光电耦合器5的传感输出接口与计算机主机的输入接口相连接。
光源3、载片台4、载片台载片槽11、滑块载片槽12、透镜组镜头6、CCD传感器7各光平面之间的夹角为0.5°。
光电耦合器5为面阵CCD，由透镜组6和CCD传感器7组成，透镜组镜头6焦距可调。
载片台透光孔9、滑块透光孔10、光源3、透镜组镜头6、CCD传感器7五者共轴。
计算机主机内装有A/D卡，计算机外围设备包括显示器、键盘、鼠标。
3.具体步骤1)将2ul的待测样本的DNA(用Qiagen公司基因组DNA抽提KIT进行抽提)与23ul PCR混合液以及2.5U的Taq酶混合均匀后，通过PCR热循环过程制备生物素或地高辛标记的DNA样本目的片断，引物5’端加生物素或地高辛标记，扩增条件为首先95℃，5分钟，以95℃，30秒，58℃ 30秒，72℃ 20秒循环35次，最后，72℃延伸5分钟；用电泳法检测PCR产物。
2)取9μl PCR产物，加经75℃预热的溶液I 3μl，混匀离心后置PCR仪94℃变性3分钟，迅速移至冰上，取样品全部加到芯片点样区域，加盖玻片(注意不能有气泡)；杂交舱里加几滴水，以保持湿度；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进48℃(±1℃)恒温箱中杂交30分钟，使DNA样品与芯片上的特异性寡核苷酸探针结合。
(以下步骤均在室温下进行)3)打开杂交舱，取出芯片，用0.25X溶液I冲掉盖玻片，然后放入20ml 0.25X溶液I中摇床荡洗2分钟。
4)将芯片取出，甩干。在点样区滴上POD稀释液(以盖住点样区为准)，加盖玻片，计时5分钟。
5)将芯片转入20ml溶液II中，室温轻摇2分钟，洗两次，甩干。
6)将芯片转入10ml显色液中，避光，显色5分钟，凉干即可。
7)将杂交、显色后的芯片插入载片槽11或者载片槽12内，接通电源，借助拉柄14沿X轴方向手动调节滑块13的位置，使平面光源3发射出的光线通过载片台透光孔9和滑块透光孔10照射到芯片点样区上，必要时还可手动调节透镜组镜头6的焦距，以使检测结果聚焦成像在CCD传感器7上，通过CCD传感器7将光信号转化为电信号，由电缆8将信号传送至计算机主机内的A/D卡，由其将电信号数字化，再使用专门编制的应用软件进行分析，最后从显示器上读取结果。
A/D卡和计算机主机内的其他部件以及外围设备均为现有技术，图中未画出。
权利要求
1.一种基因芯片酶联显色检测法，包括如下步骤1)用生物素或地高辛标记的引物对待测样本DNA进行PCR反应扩增；2)将生物素或地高辛标记的PCR产物和芯片杂交；3)洗片、酶联显色并用专用读片仪检测分析；其特征在于，在步骤3中使用POD链酶亲和素交联显色并用专用读片仪进行信号的检测和分析。
2.如权利要求1所述的基因芯片酶联显色检测法，其特征在于，所述洗片、酶联显色及检测过程为1)在室温下，从杂交舱中取出芯片，用溶液I冲掉盖玻片，然后放入20ml溶液I中摇床荡洗2分钟；2)将芯片取出，甩干。在点样区滴上POD稀释液，以盖住点样区为准，加盖玻片，计时5分钟；3)将芯片转入20ml溶液II中，室温下轻摇2分钟，洗两次，甩干；4)将芯片转入10ml显色液中，避光，显色5分钟，凉干即可；5)用专用读片仪进行检测和分析。
3.一种专用于基因芯片酶联显色检测法的生物芯片读片仪，其特征在于，它由机壳(1)、底座(2)、光源(3)、载片台(4)、光电耦合器(5)、计算机主机及外围设备组成；光源(3)、载片台(4)、光电耦合器(5)依次垂直安装在底座(2)上；载片台(4)上放置芯片，载片台(4)上设有一透光孔(9)，光源(3)发出的光线通过透光孔(9)照射到芯片点样区上；机壳(1)固定在底座(2)上，机壳(1)一侧面与载片台(4)边缘相对处设有一开口(15)；电缆(8)把光电耦合器(5)的传感输出接口与计算机主机的输入接口相连接。
4.如权利要求3所述的生物芯片读片仪，其特征在于，所述光源(3)为平面透射光源，面积大于芯片点样区面积；其最低照度大于1.0LUX，表面不均匀度小于1‰。
5.如权利要求3所述的生物芯片读片仪，其特征在于，所述载片台(4)上设有一载片槽(11)，芯片可嵌入载片槽(11)内并可沿X轴方向移动；载片槽(11)上设有一透光孔(9)，其面积大于或等于芯片点样区的面积。
6.如权利要求3所述的生物芯片读片仪，其特征在于，所述载片台(4)上嵌有一可沿X轴方向移动的滑块(13)，滑块上设有一载片槽(12)，芯片可嵌入载片槽(12)内；载片台(4)上设有一透光孔(9)，滑块载片槽(12)上设有另一透光孔(10)，其面积均大于或等于芯片点样区的面积。
7.如权利要求6所述的生物芯片读片仪，其特征在于，所述滑块(13)的一端设有一拉柄(14)，拉柄(14)从机壳(1)侧面开口(15)处延伸至机壳(1)外。
8.如权利要求3所述的生物芯片读片仪，其特征在于，所述光电耦合器(5)为面阵CCD，由透镜组(6)和CCD传感器(7)组成，透镜组镜头(6)焦距可调。
9.如权利要求3或6或8所述的生物芯片读片仪，其特征在于，所述载片台透光孔(9)、滑块透光孔(10)、光源(3)、透镜组镜头(6)、CCD传感器(7)五者共轴。
10.如权利要求3或5或6或8所述的生物芯片读片仪，其特征在于，所述光源(3)、载片台(4)、载片台载片槽(11)、滑块载片槽(12)、透镜组镜头(6)、CCD传感器(7)各光平面之间的夹角小于1°。
11.如权利要求3所述的生物芯片读片仪，其特征在于，所述的计算机主机内装有A/D卡，计算机外围设备包括显示器、键盘、鼠标。
12.如权利要求3所述的生物芯片读片仪，其特征在于，所述光源(3)和载片台(4)之间设有一层或多层毛玻璃。
13.如权利要求3所述的生物芯片读片仪，其特征在于，在载片槽(11)或载片槽(12)的上下缘用螺栓(16)限位。
全文摘要
本发明公开了一种检测灵敏度与荧光法持平，且操作简便，成本低廉的基因芯片酶联显色检测法即先用生物素或地高辛标记的引物对待测样本DNA进行PCR扩增，然后将扩增产物和芯片杂交，再用POD链酶亲和素交联显色，最后用专用读片仪检测。本发明还公开了一种专用于该检测法的生物芯片读片仪，它由机壳、底座、光源、载片台、光电耦合器、计算机主机及外围设备组成；光源、载片台、光电耦合器依次垂直安装在底座上；载片台上放置芯片，载片台上设有一透光孔，光源发出的光线通过透光孔照射到芯片点样区上；机壳固定在底座上，机壳一侧面与载片台边缘相对处设有一开口；电缆把光电耦合器的传感输出接口与计算机主机的输入接口相连接。
文档编号G01N21/25GK1482446SQ0213691
公开日2004年3月17日 申请日期2002年9月10日 优先权日2002年9月10日
发明者李瑶, 施卫, 裘敏燕, 韩志勇, 李荣宇, 李成涛, 谢毅, 毛裕民, 李 瑶 申请人:上海博星基因芯片有限责任公司, 上海博星基因芯片研究所