专利名称：采用标记链霉亲和素——生物素技术的蛋白质芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于生命科学领域，特别涉及一种采用荧光或酶标记链霉亲和素-生物素技术(Fluorescence/Enzyme labeled Streptavidin Biotin Method，FLSAB/ELSAB)的蛋白质芯片。
背景技术：
标记链霉亲和素-生物素技术是近年来发展迅速的新型生物反应放大系统，可应用于免疫测定。
运用常规免疫标记技术的蛋白质芯片，荧光或酶直接标记在可与待测物质特异性结合的蛋白质上，反应结果未经过进一步放大，检测灵敏度有局限，对设备、试剂和人员操作等要求较高。反应过程中由于一些非特异性的结合，背景会有一些干扰信号，在点样浓度较高或条件控制稍差的情况下，还可能出现假阳性反应。另外，由于荧光标记物难于标记在酸性蛋白质上，其运用范围受到一定的限制，例如某些抗原是酸性蛋白质，荧光标记物标记抗原的效率极低，无法直接用荧光标记抗原来检测抗体。而酶标由于分子的位阻效应而会影响抗原抗体的结合效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片，它改进了制作方法，使得检测结果清晰、稳定，可靠性强。
本发明的又一目的是提供采用标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片的应用方法，利用不同的标记方法在不同性质的蛋白质上作标记，扩大蛋白质芯片的应用范围。
本发明的技术方案如下一种采用标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片，蛋白质的点样和制作技术采取下列步骤(1)使用高速点样机器人将蛋白质样品抗原或者抗体点印于经戊二醛处理过的载玻片上或硝酸纤维素膜或尼龙膜上；(2)于室温过夜或者于37℃温育1小时固定于固相载体；(3)在载玻片表面加上以牛血清白蛋白(BSA)和吐温为主的封闭液，于37℃温育1小时；(4)用双蒸水充分洗涤并室温干燥；杂交反应采取下列步骤(1)在点好样的芯片上滴加待测样品，于37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应；(2)用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，于室温晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗净晾干；(4)滴加以封阻液稀释过的生物素标记的蛋白质，于37℃温育30分钟；(5)洗净并于室温晾干；(6)滴加以封阻液稀释过的荧光或酶标记链霉亲和素，于37℃避光温育30分钟；(7)洗净并于室温晾干；(8)若(6)中采用酶标记链霉亲和素，则滴加底物，避光温育30分钟，以终止液终止反应；反应结束后，利用芯片扫描分析仪对结果进行判读，检测结果。
所述蛋白质芯片技术用于测定抗原，将与待测抗原相对应的各种单克隆抗体或者多克隆抗体点阵、固定于固相载体上，这些过量的固相抗体和病人血清的抗原结合，洗去未结合的其它物质后，加入生物素标记的另一抗体-荧光或酶标记的链霉亲和素，再次洗涤固相后，测定荧光强度，或者加入酶相对的底物，并测颜色变化后的灰度值，其值与被测的抗原浓度成正比。
所述蛋白质芯片技术用于测定抗体，将与待测抗体相对应的抗原点阵、固定于固相载体上，这些过量的固相抗原和病人血清的抗体结合，洗去未结合的其它物质后，加入生物素标记的另一抗原或者二抗-荧光或酶标记的链霉亲和素，再次洗涤固相后，测定荧光强度，或者加入酶相对的底物，并测颜色变化后的灰度值，其值与被测的抗体浓度成正比。
所述蛋白质芯片技术用于检测与蛋白质特异性结合的物质，将与待测物质相对应的蛋白质点阵、固定于固相载体上，这些过量的蛋白质和待测物质结合，洗去未结合的其它物质后，加入生物素标记的与待测物质结合的另一蛋白质-荧光或酶标记的链霉亲和素，再次洗涤固相后，测定荧光强度，或者加入酶相对的底物，并测颜色变化后的灰度值，其值与被测的物质浓度成正比，这一检测方法用于配体、受体的检测、筛选，也用于信号传导的研究和药物的筛选。
本发明的采用荧光或酶标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片，与采用常规免疫荧光技术的蛋白质芯片相比较，反应试剂是用生物素(Biotin)标记的可特异性结合待测物质(如抗原)的蛋白质(如抗体)，用荧光(Fluorescence)或酶(Enzyme)标记的链霉亲和素(Streptavidin)，利用链霉亲和素与生物素的特异性高度亲和性进行生物反应放大。
本发明的蛋白质芯片具有如下优点1、灵敏度和可检测范围比采用传统标记方法的蛋白质芯片提高10倍以上，其检测信号强。
2、具有高度特异性，背景信号低，其非特异性着色淡，检测结果清晰、稳定，可靠性强。
3、操作时样品可高度稀释，进一步减少背景着色的可能性，背景噪音低，特异性进一步提高。
4、秉承了蛋白质芯片微列阵技术的高效性，操作简便。
5、利用不同的标记方法可以在不同性质的蛋白质上作标记，由此可测蛋白质的种类增多，扩大蛋白质芯片的应用范围。
6、减少酶的位阻效应，提高反应效率。
本发明利用不同的生物素标记方法，可以标记不同性质的蛋白质，扩大蛋白质芯片的应用范围。例如，将生物素活化为生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(biotinyl-N-hydroxy-succinimide ester，BNHS)适用于标记中性或偏碱性的蛋白质；将生物素活化为生物素酰肼(biotin hydrazide，BHZ)主要用于标记偏酸性的糖蛋白。
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
图1是采用荧光标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片测定抗体(Ag-Ab-二抗结合)的原理图。
图2是采用荧光标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片测定抗原(双抗体夹心法)的原理图。
图3是采用荧光标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片测定抗体(双抗原夹心法)的原理图。
图4是采用酶标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片测定抗体(Ag-Ab-二抗结合)的原理图。
图5是采用酶标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片测定抗原(双抗体夹心法)的原理图。
图6是采用酶标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片测定抗体(双抗原夹心法)的原理图。
图7是采用荧光标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片检测病人血清的荧光扫描结果示意图。
图8是使用单一的荧光标记技术检测原浓度血清的荧光扫描结果示意图。
图9是采用荧光标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片检测病人血清，将病人血清稀释10倍后的实验结果示意图。
图10是使用单一的荧光标记技术检测原浓度血清，将病人血清稀释10倍后的实验结果示意图。
具体实施例方式
本发明是一种采用标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片，该蛋白质芯片的固相载体可以是载玻片或者硝酸纤维素膜(NC膜)或尼龙膜。
蛋白质的点样和制作技术采取下列步骤(1)使用高速点样机器人将蛋白质样品抗原或者抗体点印于经戊二醛处理过的载玻片上或硝酸纤维素膜或尼龙膜上。
(2)于室温过夜或者于37℃温育1小时固定于固相载体。
(3)在载玻片表面加上以牛血清白蛋白(BSA)和吐温为主的封闭液，于37℃温育1小时。
(4)用双蒸水充分洗涤并室温干燥。
杂交反应采取下列步骤(1)在点好样的芯片上滴加待测样品，于37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应。
(2)用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，于室温晾干。
(3)加封阻液封阻并再次洗净晾干。
(4)滴加以封阻液稀释过的生物素标记的蛋白质，于37℃温育30分钟。
(5)洗净并于室温晾干。
(6)滴加以封阻液稀释过的荧光或酶标记链霉亲和素，于37℃避光温育30分钟。
(7)洗净并于室温晾干。
(8)若(6)中采用酶标记链霉亲和素，则滴加底物，避光温育30分钟，以终止液终止反应。
反应结束后，利用专业的芯片扫描分析仪对结果进行判读，检测结果。
本发明的应用方法如下参看图1、图3、图4和图6，将蛋白质芯片技术用于测定抗体，将与待测抗体相对应的抗原点阵、固定于固相载体上，这些过量的固相抗原和病人血清的抗体结合，洗去未结合的其它物质后，加入生物素标记的另一抗原或者二抗-荧光或酶标记的链霉亲和素，再次洗涤固相后，测定荧光强度，或者加入酶相对的底物，并测颜色变化后的灰度值，其值与被测的抗体浓度成正比。
参看图2和图4，将蛋白质芯片技术用于测定抗原，将与待测抗原相对应的各种单克隆抗体或者多克隆抗体点阵、固定于固相载体上，这些过量的固相抗体和病人血清的抗原结合，洗去未结合的其它物质后，加入生物素标记的另一抗体-荧光或酶标记的链霉亲和素，再次洗涤固相后，测定荧光强度，或者加入酶相对的底物，并测颜色变化后的灰度值，其值与被测的抗原浓度成正比。
将蛋白质芯片技术用于检测与蛋白质特异性结合的物质，将与待测物质相对应的蛋白质点阵、固定于固相载体上，这些过量的蛋白质和待测物质结合，洗去未结合的其它物质后，加入生物素标记的与待测物质结合的另一蛋白质-荧光或酶标记的链霉亲和素，再次洗涤固相后，测定荧光强度，或者加入酶相对的底物，并测颜色变化后的灰度值，其值与被测的物质浓度成正比，这一检测方法用于配体、受体的检测、筛选，也用于信号传导的研究和药物的筛选。
本发明以丙肝常用临床检验指标丙肝病毒(HCV)的检测为其中一个实施例参看图7至图10，用蛋白质芯片检测某病人血清所得到的荧光扫描结果，图中第一行和第二行的10个点为检测结果，最后两行为阳性对照，中间两行无信号为阴性对照。
图7和图8为检测原浓度血清，其中图7利用了荧光标记链霉亲和素-生物素技术，而图8则使用单一的荧光标记技术。从图中可以看出，采用荧光标记链霉亲和素-生物素技术的反应结果阳性反应信号强，图像清晰，背景信号低；而使用单一的荧光标记技术的反应结果，相对背景信号较高，图像相对模糊。
图9和图10是将病人血清稀释10倍后的实验结果。图9利用了荧光标记链霉亲和素-生物素技术，而图10则使用单一的荧光标记技术，可见前者结果仍然很清晰，而后者结果信号已经很弱，图像模糊难辩，由此可能会产生假阴性的结论。
权利要求
1.一种采用标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片，蛋白质的点样和制作技术采取下列步骤(1)使用高速点样机器人将蛋白质样品抗原或者抗体点印于经戊二醛处理过的载玻片上或硝酸纤维素膜或尼龙膜上；(2)于室温过夜或者于37℃温育1小时固定于固相载体；(3)在载玻片表面加上以牛血清白蛋白(BSA)和吐温为主的封闭液，于37℃温育1小时；(4)用双蒸水充分洗涤并室温干燥；杂交反应采取下列步骤(1)在点好样的芯片上滴加待测样品，于37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应；(2)用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，于室温晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗净晾干；其特征在于，杂交反应接着采取下列步骤(4)滴加以封阻液稀释过的生物素标记的蛋白质，于37℃温育30分钟；(5)洗净并于室温晾干；(6)滴加以封阻液稀释过的荧光或酶标记链霉亲和素，于37℃避光温育30分钟；(7)洗净并于室温晾干；(8)若(6)中采用酶标记链霉亲和素，则滴加底物，避光温育30分钟，以终止液终止反应；反应结束后，利用芯片扫描分析仪对结果进行判读，检测结果。
2.根据权利要求1所述的采用标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片的应用方法，其特征在于，所述蛋白质芯片技术用于测定抗原，将与待测抗原相对应的各种单克隆抗体或者多克隆抗体点阵、固定于固相载体上，这些过量的固相抗体和病人血清的抗原结合，洗去未结合的其它物质后，加入生物素标记的另一抗体-荧光或酶标记的链霉亲和素，再次洗涤固相后，测定荧光强度，或者加入酶相对的底物，并测颜色变化后的灰度值，其值与被测的抗原浓度成正比。
3.根据权利要求1所述的采用标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片的应用方法，其特征在于，所述蛋白质芯片技术用于测定抗体，将与待测抗体相对应的抗原点阵、固定于固相载体上，这些过量的固相抗原和病人血清的抗体结合，洗去未结合的其它物质后，加入生物素标记的另一抗原或者二抗-荧光或酶标记的链霉亲和素，再次洗涤固相后，测定荧光强度，或者加入酶相对的底物，并测颜色变化后的灰度值，其值与被测的抗体浓度成正比。
4.根据权利要求1所述的采用标记链霉亲和素-生物素技术的蛋白质芯片的应用方法，其特征在于，所述蛋白质芯片技术用于检测与蛋白质特异性结合的物质，将与待测物质相对应的蛋白质点阵、固定于固相载体上，这些过量的蛋白质和待测物质结合，洗去未结合的其它物质后，加入生物素标记的与待测物质结合的另一蛋白质-荧光或酶标记的链霉亲和素，再次洗涤固相后，测定荧光强度，或者加入酶相对的底物，并测颜色变化后的灰度值，其值与被测的物质浓度成正比，这一检测方法用于配体、受体的检测、筛选，也用于信号传导的研究和药物的筛选。
全文摘要
本发明涉及一种采用标记链霉亲和素——生物素技术的蛋白质芯片,将蛋白质点样并制作,杂交反应采取下列步骤:在点好样的芯片上滴加待测样品,用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品,加封阻液封阻并再次洗净晾干,滴加以封阻液稀释过的生物素标记的蛋白质,洗净并于室温晾干,滴加以封阻液稀释过的荧光或酶标记链霉亲和素,洗净并于室温晾干。本发明的蛋白质芯片技术用于测定抗原、抗体,用于检测与蛋白质特异性结合的物质。本发明改进了制作方法,使得检测结果清晰、稳定,可靠性强。本发明利用不同的标记方法在不同性质的蛋白质上作标记,由此可测蛋白质的种类增多,扩大蛋白质芯片的应用范围。
文档编号G01N33/543GK1335505SQ0111332
公开日2002年2月13日 申请日期2001年7月11日 优先权日2001年7月11日
发明者张涛, 李宾, 彭永济, 葛海鹏, 任一萍 申请人:上海晶泰生物技术有限公司