专利名称：CdTe纳米晶偶联链霉亲和素荧光标记生物分子的方法
技术领域：
本发明属生物分子的检测方法，特别涉及一种利用具有高发光效率CdTe纳米晶偶联链霉亲和素从而标记生物分子的荧光标记方法。
背景技术：
具有高发光效率的纳米晶荧光标记作为高灵敏度的非同位素荧光分析法，在实时监测生物体内尤其是细胞内的蛋白质间相互作用以及研究细胞分化、细胞间相互作用方面的优势日益受到人们的重视。用有机荧光染料来荧光标记细胞和生物分子的方法早已用于此，但是传统的荧光染料有着不可逾越的缺陷激发光谱窄；射光谱很宽；易光漂白和光解；纳米晶具有狭窄对称的荧光谱峰，可调的发射光谱，它的发射波长(色)可以是单一的，也可以是多重的。可通过改变核心物质的数目而改变，也能通过改变核心物质某成份的数量调整其荧光强度。这样就能在相同光谱范围内分辨多种纳米晶的光谱特征。相对于有机荧光染料，纳米晶对化学物质和生理代谢的降解有很强的抵抗力，其光漂白域值也高。
跟本发明最相近的背景技术是美国的一份专利，公开号为US 6468808 B1。该专利公开了用发光CdSe纳米晶荧光标记生物分子的方法。在无水、无氧的手套箱中制备由CdSe核及ZnS壳层组成的纳米晶，并通过在其表面修饰巯基乙酸而使发光CdSe纳米晶具有水溶性，从而与生物分子在偶联剂的作用下相连接最终使生物分子标记上荧光。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新型荧光标记方法水溶性高发光效率CdTe纳米晶与链霉亲和素经由水溶性缩合剂的作用形成共价键而偶联在一起，生物分子生物素化后，经由亲和素与生物素的高度特异性结合而使生物分子标记上荧光。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明在实验中采用的是水相中合成的单壳层CdTe半导体纳米晶。以巯基羧酸作为稳定剂，常温常压条件下在水相中合成。使发光CdTe纳米晶共价连接上链霉亲和素，生物分子经生物素化后，即可通过经由生物素和链霉亲和素的特异性结合将生物分子标记上特定的不同颜色的荧光。
本发明包括以下步骤1，生物分子的生物素化；2，纳米晶共价偶联到链霉亲和素上；3，生物分子标记荧光。所说的生物分子的生物素化是将生物分子的碳酸钠溶液加入到羟基琥珀亚胺生物素脂溶液中，混合后室温反应1-3小时；对磷酸缓冲液透析12-24小时，冻干；所说的纳米晶共价偶联是在发光CdTe纳米晶胶体溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液和链霉亲和素，在pH8-11的条件下反应1-4小时，再对磷酸缓冲液透析12-24小时；所说的生物分子标记荧光的过程是将生物分子的生物素化所得产物与发光纳米晶共价偶联链霉亲和素所得产物混合，在25-40℃保温1-2小时，得到标记荧光的生物分子。
所说的发光CdTe纳米晶微粒的粒度是2.5-4.0nm，发光CdTe纳米晶胶体溶液的浓度在10-7M-10-5M；N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度在30-70mM；链霉亲和素的量在0.5-3mg/ml；所说的磷酸缓冲液透析是在0-8℃温度下进行的，磷酸缓冲液的浓度是50mM。
本发明中采用的发光CdTe纳米晶由于是在水相中常温常压下一步合成的，表面修饰的巯基羧酸是作为稳定剂加入的，由此制备出的发光CdTe纳米晶在水溶性、生物相溶性上、荧光稳定性以及发光效率上要优于CdSe纳米晶。作为高灵敏度的非同位素荧光分析法，在实时监测生物体内尤其是细胞内的蛋白质间相互作用以及研究细胞分化、细胞间相互作用方面的优势与CdSe纳米晶一样明显优于有机荧光染料。选用的CdTe纳米晶是单壳层材料，成分单一，不具毒副作用，给实际应用带来方便。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，而不是要以此对本发明进行限制。
实施例11蛋白质生物素化。
将40mg羟基琥珀亚胺生物素脂溶于1ml二甲基甲酰胺中；用0.1M pH8.0碳酸钠溶液将蛋白质配成10mg/ml的溶液，在此溶液中加入50μl羟基琥珀亚胺生物素脂溶液，混合后室温反应1-3小时；对50mM磷酸缓冲液4℃透析12-24小时，冻干。
2CdTe纳米晶与链霉亲和素的共价偶联。
取具有各种颜色荧光的CdTe纳米晶胶体溶液(10-7M)1ml，加入50mM N-羟基琥珀酰亚胺溶液0.5ml，链霉亲和素1mg，在pH9-10的条件下反应1-4小时。对50mM磷酸缓冲液4℃透析12-24小时。即可得到标记了各种颜色荧光的链霉亲和素。
3将1和2中制得的溶液混合，25℃-40℃保温1-2小时，即可得到标记了各种颜色荧光的蛋白质。
实施例21单克隆抗体的生物素化将40mg羟基琥珀亚胺生物素脂溶于1ml二甲基甲酰胺中；用0.1M pH8.0碳酸钠溶液将单克隆抗体配成10mg/ml的溶液，在此溶液中加入50μl羟基琥珀亚胺生物素脂溶液，混合后室温反应1-3小时；对50mM磷酸缓冲液4℃透析12-24小时，冻干。
2CdTe纳米晶与链霉亲和素的共价偶联。
取具有各种颜色荧光的CdTe纳米晶胶体溶液(10-7M)1ml，加入50mM N-羟基琥珀酰亚胺溶液0.5ml，链霉亲和素1mg，在pH9.5的条件下反应2小时。对50mM PBS溶液4℃透析过夜。即可得到标记了各种颜色荧光的链霉亲和素。
3将1和2中制得的溶液混合，37℃保温1小时即可得到标记了各种颜色荧光的单克隆抗体。
实施例31免疫球蛋白的生物素化将40mg羟基琥珀亚胺生物素脂溶于1ml二甲基甲酰胺中；用0.1M pH8.0碳酸钠溶液将免疫球蛋白配成10mg/ml的溶液，在此溶液中加入50μl羟基琥珀亚胺生物素脂溶液，混合后室温反应1-3小时；对50mM磷酸缓冲液4℃透析12-24小时，冻干。
2CdTe纳米晶与链霉亲和素的共价偶联。
取具有各种颜色荧光的CdTe纳米晶胶体溶液(10-6M)1ml，加入50mM N-羟基琥珀酰亚胺溶液0.5ml，链霉亲和素1mg，在pH9.5的条件下反应2小时。对50mM PBS溶液4℃透析过夜。即可得到标记了橙色荧光的链霉亲和素。
3将1和2中制得的溶液混合，37℃保温1小时即可得到标记了各种颜色荧光的免疫球蛋白。
实施例41小肽的生物素化在按常规方法合成肽时，将D-生物素以氨基酸偶联的方式接到树脂肽的氨基端，从而制备得到生物素化的小肽。
2CdTe纳米晶与链霉亲和素的共价偶联。
取具有各种颜色荧光的CdTe纳米晶胶体溶液(10-5M)1ml，加入50mM N-羟基琥珀酰亚胺溶液0.5ml，链霉亲和素溶液1mg，在pH 9.5的条件下反应2小时。对50mM PBS溶液4℃透析过夜。即可得到标记了各种颜色荧光的链霉亲和素。
3将1和2中制得的溶液混合，37℃保温1小时即可得到标记了各种颜色荧光的小肽。
实施例51核糖核酸的生物素化将40mg羟基琥珀亚胺生物素脂溶于1ml二甲基甲酰胺中；用0.1M pH8.0碳酸钠溶液将待标记核糖核酸配成10mg/ml的溶液，在此溶液中加入50μl羟基琥珀亚胺生物素脂溶液，混合后室温反应1-3小时；对50mM磷酸缓冲液4℃透析12-24小时，冻干。
2CdTe纳米晶与链霉亲和素的共价偶联。
取具有各种颜色荧光的CdTe纳米晶胶体溶液(10-6M)1ml，加入50mM N-羟基琥珀酰亚胺溶液0.5ml，链霉亲和素1mg，在pH9.5的条件下反应2小时。对50mM PBS溶液4℃透析过夜。即可得到标记了橙色荧光的链霉亲和素。
3将1和2中制得的溶液混合，37℃保温1小时即可得到标记了各种颜色荧光的核糖核酸。
实施例61脱氧核糖核酸的生物素化将40mg羟基琥珀亚胺生物素脂溶于1ml二甲基甲酰胺中；用0.1M pH8.0碳酸钠溶液将待标记脱氧核糖核酸配成10mg/ml的溶液，在此溶液中加入50μl羟基琥珀亚胺生物素脂溶液，混合后室温反应1-3小时；对50mM磷酸缓冲液4℃透析12-24小时，冻干。
2CdTe纳米晶与链霉亲和素的共价偶联。
取具有各种颜色荧光的CdTe纳米晶胶体溶液(10-6M)1ml，加入50mM N-羟基琥珀酰亚胺溶液0.5ml，链霉亲和素1mg，在pH9.5的条件下反应2小时。对50mM PBS溶液4℃透析过夜。即可得到标记了红色荧光的链霉亲和素。
3将1和2中制得的溶液混合，37℃保温1小时即可得到标记了各种颜色荧光的脱氧核糖核酸。
权利要求
1.一种CdTe纳米晶偶联链霉亲和素荧光标记生物分子的方法，其特征在于，包括生物分子的生物素化—纳米晶共价偶联链霉亲和素—生物分子标记荧光的过程；所说的生物分子的生物素化是将生物分子的碳酸钠溶液加入到羟基琥珀酰亚胺生物素脂溶液中，混合后室温反应1-3小时，对磷酸缓冲液透析12-24小时，冻干；所说的纳米晶共价偶联链霉亲和素是在发光CdTe纳米晶胶体溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液和链霉亲和素，在pH8-11的条件下反应1-4小时，再对磷酸缓冲液透析12-24小时；所说的生物分子标记荧光的过程是将生物分子生物素化所得产物与发光纳米晶共价偶联链霉亲和素所得产物混合，在25-40℃保温1-2小时，得到标记荧光的生物分子。
2.按照权利要求1所述的CdTe纳米晶偶联链霉亲和素荧光标记生物分子的方法，其特征在于，所说的发光CdTe纳米晶微粒的粒度是2.5-4.0nm，发光CdTe纳米晶胶体溶液的浓度在10-7M-10-5M；N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度在30-70mM；链霉亲和素的量在0.5-3mg/ml；所说的磷酸缓冲液透析是在0-8℃温度下进行的，磷酸缓冲液的浓度是50mM。
3.按照权利要求1或2所述的CdTe纳米晶偶联链霉亲和素荧光标记生物分子的方法，其特征在于，所说的生物分子是小肽；所说的生物素化是在合成肽时，将D-生物素以氨基酸偶联的方式接到树脂肽的氨基端。
全文摘要
本发明的CdTe纳米晶偶联链霉亲和素荧光标记生物分子的方法属于生物分子的检测方法。包括生物分子的生物素化—纳米晶共价偶联链霉亲和素—生物分子标记荧光的过程。生物素化是将生物分子的碳酸钠溶液加入到羟基琥珀酰亚胺生物素脂溶液中，混合反应1－3小时；纳米晶共价偶联链霉亲和素是在发光CdTe纳米晶胶体溶液中加入N－羟基琥珀酰亚胺溶液和链霉亲和素，在pH 8－11条件下反应1－4小时；最后将生物素化所得产物与偶联链霉亲和素所得产物混合，得到标记荧光的生物分子。本发明采用的发光CdTe纳米晶在水溶性、生物相溶性上、荧光稳定性以及发光效率上要优于其它材料纳米晶；荧光标记生物分子无毒副作用方便实际应用。
文档编号G01N33/531GK1540349SQ20031010994
公开日2004年10月27日 申请日期2003年10月28日 优先权日2003年10月28日
发明者王丽萍, 张皓, 房学迅, 李惟, 杨柏 申请人:吉林大学