梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及其制备方法，涉及梅毒的检测。试剂盒设有浓缩洗涤液瓶、阴阳性对照品瓶、生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶、包被有重组抗原微孔板。以梅毒螺旋体有传染性标准株Nichol株和梅毒螺旋体无传染性的标准株Reiter株，采用蛋白组学方法，通过双向电泳分离梅毒螺旋体蛋白质组，用不同病人或感染动物的血清鉴定出具有强免疫原性的蛋白质，寻找抗原标志物。用于梅毒确认试验，提高诊断灵敏度和特异性，缩短窗口期。可灵敏检测出梅毒螺旋体抗体并定量鉴定，价格便宜，操作简单，结果准确。
【专利说明】梅毒螺旋体I gM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及 其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及梅毒的检测，尤其是涉及一种梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联 免疫检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 梅毒是梅毒螺旋体引起的性传播性疾病，近年来在国内的发病率居高不下，梅毒 的防控已成为我国公共卫生服务的主要任务之一。
[0003] 梅毒的实验室诊断方法主要有如下几种（[1]林丽蓉，杨波，潘锡涛，等.潜 在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010,20(10): 1491-1494)：
[0004] (1)病原学检测：梅毒螺旋体感染早期，当梅毒抗体还未产生或含量较低时，暗视 野显微镜查找螺旋体成为最早的实验室诊断方法，但易受取材技术、取材部位、样本中梅毒 螺旋体含量、局部用药及送检时间等诸多因素影响，灵敏度较低。
[0005] (2)抗体检测试验：梅毒螺旋体不能进行体外培养，诊断主要依赖于实验室检查， 现有的血清学检测灵敏度、特异性不高，任何一种检测方法均存在缺陷，临床漏诊和误诊率 较闻。
[0006] 用于梅毒血清学检验的抗原主要以重组抗原TPN15、TPN17、TPN37、 TPN44. 5、TPN47 为主（[2]Lin，L.R.，Z.G.Fu，et al. "Development of a colloidal gold-immunochromatography assay to detect immunoglobulin G antibodies to Treponema pallidum with TPN17and TPN47. "Diagnostic microbiology and infectious disease. 2010. 68 (3) : 193-200.)，这些抗原大多来源于梅毒螺旋体外膜，但不能区分是否 为致病性螺旋体所致。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及其 制备方法。
[0008] 所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，设有：
[0009] 外包装盒、浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记抗人IgM特 异性片段μ链单克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、 反应终止液瓶、包被有重组抗原微孔板；
[0010] 浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记抗人IgM特异性片段μ 链单克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液Α瓶、显色液Β瓶、反应终止液 瓶和包被有重组抗原微孔板装在外包装盒内；
[0011] 浓缩洗涤液瓶内装有浓缩洗涤液，阴性对照品瓶内装有阴性对照品，阳性对照品 瓶内装有阳性对照品，生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体瓶内装有生物素标 记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素瓶内装有辣根过氧化 物酶标记亲和素，ΤΜΒ显色液Α瓶内装有ΤΜΒ显色液Α，显色液Β瓶内装有显色液Β，反应终 止液瓶内装有反应终止液；
[0012] 所述TMB显色液A为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺 (3, 3,，5, 5, -Tetramethylbenzidine，TMB)显色液；
[0013] 所述显色液B为3%的过氧化氢溶液。
[0014] 所述浓缩洗涤液可采用溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度 为0. 05%，使用时用蒸馏水进行20倍稀释。
[0015] 所述阴性对照品为梅毒螺旋体总抗体阴性对照品，由非梅毒感染的健康人群血 清配制而成，使用本试剂盒进行检测其0D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm为主波长， 450nm是测定的样本显色吸光值。
[0016] 所述阳性对照品为梅毒螺旋体总抗体阳性对照品，由梅毒患者的阳性血清配制而 成，用本试剂盒进行检测其〇D450nm吸光值大于0. 5 ;所述0D450nm为主波长，450nm是测定 的样本显色吸光值。
[0017] 所述TMB显色液A为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺 (3, 3'，5, 5' -Tetramethylbenzidine，TMB)显色液，商品名叫TMB显色液A，市售品可购自厦 门波生生物科技有限公司。
[0018] 所述显色液B为3%的过氧化氢溶液，商品名叫显色液B，市售品可购自厦门波生 生物科技有限公司。
[0019] 所述反应终止液可采用摩尔浓度2mmol/L的硫酸。
[0020] 所述瓶可采用聚乙烯瓶。
[0021] 所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备方法，包括以 下步骤：
[0022] 1)提取梅毒螺旋体Nichol株和Reiter株外膜蛋白进行双向电泳后，转移至硝 酸纤维素膜上，用梅毒血清进行免疫印迹实验，获得特征性的免疫印迹斑点，取对应的蛋白 点进行质谱分析，分别找出Nichol株和Reiter株具有较高免疫原性的外膜蛋白，并找出 Nichol株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白；
[0023] 2)在梅毒螺旋体的全基因组序列中找出对应基因，设计引物并构建相应的表达载 体，研究不同诱导条件对重组目标蛋白在大肠杆菌中表达量的影响，获得最佳诱导条件，大 量扩增目标蛋白，收集过表达的目标蛋白进行纯化，纯度高于90 %后，进行后续研究；
[0024] 3)将步骤2)候选抗原，通过免疫大鼠获得其相应多克隆抗体。采用酶联免疫方法 测定抗体滴度，并使用免疫印迹方法验证这些重组抗原的免疫原性。
[0025] 4)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使 其表达，得梅毒螺旋体重组抗原；
[0026] 在步骤4)中，所述重组抗原为梅毒螺旋体致病株Nichol株高表达，而梅毒非致 病株Reiter株无表达；所述梅毒螺旋体致病株Nichol株为Treponema pallidum ssp. pallidum strain Nichol ;所述梅毒非致病株 Reiter 株为 Treponema pallidum ssp. pallidum strain Reiter。
[0027] 5)将步骤4)中的梅毒螺旋体重组抗原用包被缓冲液稀释至20ug/mL，以每孔 0. lmL加入微孔板中，4?包被24h ;取出抗原板，风干；用0. Olmmol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液 配制的1. 0%脱脂奶粉，每孔0. 2mL，4°C封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、 消毒、密封，得重组抗原包被微孔板；
[0028] 6)以人IgM特异性片段μ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得 稳定分泌抗人IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0029] 7)将抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去 除未结合的生物素，制备生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体；
[0030] 8)采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记，得辣根过氧化物酶标记亲和素；
[0031] 9)ΤΜΒ显色液Α采用市售品，可购自厦门波生生物科技有限公司；
[0032] 10)显色液B采用市售品，可购自厦门波生生物科技有限公司；
[0033] 11)配制溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0· 05%，得浓 缩洗涤液，使用时可用蒸馏水进行20倍稀释；
[0034] 12)配制2mmol/L的硫酸作为反应终止液；
[0035] 13)由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋体抗体阴性对照品，使用本试剂 盒进行检测其〇D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm为主波长，450nm是测定的样本显色 吸光值；
[0036] 14)由梅毒患者的阳性血清配制梅毒螺旋体抗体阳性对照品，用本试剂盒进行检 测其0D450nm吸光值大于0· 5 ;所述0D450nm为主波长，450nm是测定的样本显色吸光值；
[0037] 15)将生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记亲 和素、ΤΜΒ显色液Α、显色液Β、浓缩洗涤液、反应终止液、阴性对照品、阳性对照品分别装在 瓶中，再将生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和 素瓶、ΤΜΒ显色液Α瓶、显色液Β瓶、浓缩洗涤液瓶、反应终止液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照 品瓶以及包被有重组抗原微孔板装入外包装盒中，得到梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素 酶联免疫检测试剂盒。
[0038] 本发明所述梅毒螺旋体抗原的特异性，其为梅毒螺旋体致病株Nichol株高表达， 而梅毒非致病株Reiter株无表达。
[0039] 本发明提供了一种梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，可用 于临床标本中梅毒特异性抗体的检测。能准确地检测出致病性梅毒螺旋体抗体，为梅毒检 测提供一种高效、简便的技术手段。
[0040] 本发明以国际公认的梅毒螺旋体有传染性标准株Nichol株和梅毒螺旋体无传染 性的标准株Reiter株，采用蛋白组学的方法，通过双向电泳分离梅毒螺旋体蛋白质组，再 用不同病人（或感染动物）的血清鉴定出具有强免疫原性的蛋白质，寻找抗原标志物。作为 梅毒螺旋体早期诊断的抗原标志物，建立一种灵敏、特异的梅毒螺旋体IgM抗体生物素-亲 和素酶联检测技术，用于梅毒确认试验，提高实验诊断的灵敏度和特异性，缩短窗口期，对 梅毒防治具有重要意义。且本发明的产品不仅可以灵敏检测出梅毒螺旋体抗体，并且可以 对其进行精确的定量鉴定，价格便宜，操作简单，结果准确，环保无污染，具有长远的好处。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1为所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒实施例的结构 组成示意图。
[0042] 在图1中，各标记为：1、外包装盒，2、浓缩洗涤液瓶，3、阴性对照品瓶，4、阳性对照 品瓶，5、生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，6、辣根过氧化物酶标记亲和素 瓶，7、ΤΜΒ显色液Α瓶，8、显色液Β瓶，9、反应终止液瓶，10、包被有重组抗原微孔板。
【具体实施方式】
[0043] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0044] 参见图1，所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒实施例，设 有：
[0045] 外包装盒1、浓缩洗涤液瓶2、阴性对照品瓶3、阳性对照品瓶4、生物素标记抗人 IgM特异性片段μ链单克隆抗体瓶5、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶6、TMB显色液A瓶7、 显色液B瓶8、反应终止液瓶9、包被有重组抗原微孔板10 ;
[0046] 浓缩洗涤液瓶2、阴性对照品瓶3、阳性对照品瓶4、生物素标记抗人IgM特异性片 段μ链单克隆抗体瓶5、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶6、TMB显色液A瓶7、显色液B瓶8、 反应终止液瓶9和包被有重组抗原微孔板10装在外包装盒1内；
[0047] 浓缩洗涤液瓶2内装有浓缩洗涤液，阴性对照品瓶3内装有阴性对照品，阳性对照 品瓶4内装有阳性对照品，生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体瓶5内装有生 物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素瓶6内装有辣 根过氧化物酶标记亲和素，ΤΜΒ显色液Α瓶7内装有ΤΜΒ显色液Α，显色液Β瓶8内装有显 色液B,反应终止液瓶9内装有反应终止液；
[0048] 所述TMB显色液A为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺 (3, 3,，5, 5, -Tetramethylbenzidine，TMB)显色液；
[0049] 所述显色液B为3%的过氧化氢溶液。
[0050] 所述浓缩洗涤液可采用溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度 为0. 05%，使用时用蒸馏水进行20倍稀释。
[0051] 所述阴性对照品为梅毒螺旋体总抗体阴性对照品，由非梅毒感染的健康人群血 清配制而成，使用本试剂盒进行检测其0D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm为主波长， 450nm是测定的样本显色吸光值。
[0052] 所述阳性对照品为梅毒螺旋体总抗体阳性对照品，由梅毒患者的阳性血清配制而 成，用本试剂盒进行检测其〇D450nm吸光值大于0. 5 ;所述0D450nm为主波长，450nm是测定 的样本显色吸光值。
[0053] 所述TMB显色液A为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺 (3, 3'，5, 5' -Tetramethylbenzidine，TMB)显色液，商品名叫TMB显色液A，市售品可购自厦 门波生生物科技有限公司。
[0054] 所述显色液B为3%的过氧化氢溶液，商品名叫显色液B，市售品可购自厦门波生 生物科技有限公司。
[0055] 所述反应终止液可采用摩尔浓度2mmol/L的硫酸。
[0056] 所述瓶可采用聚乙烯瓶。
[0057] 所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备方法，包括以 下步骤：
[0058] 1)提取梅毒螺旋体Nichol株和Reiter株外膜蛋白进行双向电泳后，转移至硝 酸纤维素膜上，用梅毒血清进行免疫印迹实验，获得特征性的免疫印迹斑点，取对应的蛋白 点进行质谱分析。分别找出Nichol株和Reiter株具有较高免疫原性的外膜蛋白，并找出 Nichol株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白；
[0059] 2)在梅毒螺旋体的全基因组序列中找出对应基因，设计引物并构建相应的表达载 体，研究不同诱导条件对重组目标蛋白在大肠杆菌中表达量的影响，获得最佳诱导条件，大 量扩增目标蛋白，收集过表达的目标蛋白进行纯化，纯度高于90 %后，进行后续研究；
[0060] 3)将步骤2)候选抗原，通过免疫大鼠获得其相应多克隆抗体。采用酶联免疫方法 测定抗体滴度，并使用免疫印迹方法验证这些重组抗原的免疫原性。
[0061] 4)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使 其表达，得梅毒螺旋体重组抗原；
[0062] 5)将步骤4)中的梅毒螺旋体重组抗原用包被缓冲液稀释至20ug/mL，以每孔 0. lmL加入微孔板中，4?包被24h ;取出抗原板，风干；用0. 01mmol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液 配制的1. 0%脱脂奶粉，每孔0. 2mL，4°C封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、 消毒、密封，得重组抗原包被微孔板；
[0063] 6)以人IgM特异性片段μ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得 稳定分泌抗人IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0064] 7)将抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去 除未结合的生物素，制备生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体；
[0065] 8)采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记，得辣根过氧化物酶标记亲和素；
[0066] 9)ΤΜΒ显色液Α采用市售品，可购自厦门波生生物科技有限公司；
[0067] 10)显色液B采用市售品，可购自厦门波生生物科技有限公司；
[0068] 11)配制溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0· 05%，得浓 缩洗涤液，使用时可用蒸馏水进行20倍稀释；
[0069] 12)配制2mmol/L的硫酸作为反应终止液；
[0070] 13)由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋体抗体阴性对照品，使用本试剂 盒进行检测其〇D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm为主波长，450nm是测定的样本显色 吸光值；
[0071] 14)由梅毒患者的阳性血清配制梅毒螺旋体抗体阳性对照品，用本试剂盒进行检 测其0D450nm吸光值大于0· 5 ;所述0D450nm为主波长，450nm是测定的样本显色吸光值；
[0072] 15)将生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记亲 和素、ΤΜΒ显色液Α、显色液Β、浓缩洗涤液、反应终止液、阴性对照品、阳性对照品分别装在 瓶中，再将生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和 素瓶、ΤΜΒ显色液Α瓶、显色液Β瓶、浓缩洗涤液瓶、反应终止液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照 品瓶以及包被有重组抗原微孔板装入外包装盒中，得到梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素 酶联免疫检测试剂盒。
[0073] 以下给出具体实施例。
[0074] 实施例一
[0075] 所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备方法，包括以 下步骤：
[0076] (1)外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究：
[0077] 提取梅毒螺旋体Nichol株和Reiter株外膜蛋白进行双向电泳后，转移至硝酸纤 维素膜上，用梅毒血清进行免疫印迹实验，获得特征性的免疫印迹斑点，取对应的蛋白点进 行质谱分析。分别找出Nichol株和Reiter株具有较高免疫原性的外膜蛋白，并找出Nichol 株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白。
[0078] (2)候选蛋白的克隆纯化
[0079] 在梅毒螺旋体的全基因组序列中找出对应基因，设计引物并构建相应的表达载 体。研究不同诱导条件对重组目标蛋白在大肠杆菌中表达量的影响，获得最佳诱导条件，大 量扩增目标蛋白。收集过表达的目标蛋白进行纯化。纯度高于90%后，进行后续研究。
[0080] (3)对候选蛋白的免疫原性进行检测
[0081] 将步骤（2)候选抗原，通过免疫大鼠获得其相应多克隆抗体。采用酶联免疫方法 测定抗体滴度，并使用免疫印迹方法验证这些重组抗原的免疫原性。
[0082] (4)制备重组抗原：采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插 入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体重组抗原；
[0083] (5)重组抗原包被微孔板
[0084] 将步骤⑷中的梅毒螺旋体重组抗原用包被缓冲液稀释至20ug/mL，以每孔0. lmL 加入微孔板中，4°C包被24h ;取出抗原板，风干；用0. 01mmol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液配制的 1. 〇%脱脂奶粉，每孔〇. 2mL，4°C封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、消毒、 密封备用。
[0085] (6)制备抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体
[0086] 以人IgM特异性片段μ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳 定分泌抗人IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0087] (7)抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体生物素标记
[0088] 将抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除 未结合的生物素，制备生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体；
[0089] (8)亲和素辣根过氧化物酶标记
[0090] 采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记；
[0091] (9) ΤΜΒ显色液Α为市售品，购自厦门波生生物科技有限公司；
[0092] (10)显色液B为市售品，购自厦门波生生物科技有限公司；
[0093] (11)浓缩洗涤液
[0094] 浓缩洗涤液为溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0· 05%， 使用时用蒸馏水进行20倍稀释。
[0095] (12)反应终止液
[0096] 配制2mmol/L的硫酸作为反应终止液；
[0097] (13)对照品
[0098] 梅毒螺旋体抗体阴性对照品：由非梅毒感染的健康人群血清配制而成，使用本试 剂盒进行检测其〇D450nm吸光值小于0. 1 ;
[0099] 梅毒螺旋体抗体阳性对照品：梅毒患者的阳性血清配制而成，用本试剂盒进行检 测其0D450nm吸光值大于0· 5 ;
[0100] 所述0D450nm为主波长，450nm是测定的样本显色吸光值；
[0101] (14)制备梅毒螺旋体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒
[0102] 包被有重组抗原微孔板、生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体、辣根 过氧化物酶标记亲和素显色液Α、显色液Β、浓缩洗涤液、反应终止液、阴性对照品、阳性对 照品和外包装盒共同组成的梅毒螺旋体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒。
[0103] 步骤（14)所述生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体、辣根过氧化物 酶标记亲和素显色液Α、显色液Β、浓缩洗涤液、反应终止液、阴性对照品、阳性对照品均装 在相应的聚乙烯瓶中。
[0104] 实施例二
[0105] 以下给出采用梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒检测患者 的临床标本中的梅毒螺旋体抗体：
[0106] (1)标本处理：血清：静脉血5mL,置37°C水浴30min，3000g离心lOmin，上清为检 测样品备用。
[0107] (2)加样：加 lOOuL的标本和50uL生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆 抗体于反应孔中，同时作空白、阴性和阳性对照孔。37°C孵育lh。
[0108] (3)洗涤：用洗涤缓冲液洗五次后扣干。
[0109] (4)加酶：在每孔中加辣根过氧化物酶标记亲和素各100μ L，置37°C孵育30min。
[0110] (5)洗涤：用洗涤缓冲液洗五次后扣干。
[0111] (6)显色：于每反应孔中依次加入显色液A和显色液B各50μ L,置37°C孵育 15min〇
[0112] (7)测定：每孔中加入反应终止液50 μ L，然后在450nm处读取各孔的吸光度值。
[0113] (8)结果判断：反应孔0D值/阴性对照孔0D值< 2. 1，则该标本应视为阴性，如果 反应孔0D值/阴性对照孔0D值均> 2. 1，可判断为阳性，确诊为梅毒。
[0114] 实施例三
[0115] 以下给出梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的性能检定
[0116] ⑴阳性标本符合率
[0117] 用梅毒特异性抗体阳性参比血清50份检定，计算阳性符合率。
[0118] ⑵阴性标本符合率
[0119] 用梅毒特异性抗体阴性参比血清50份检定，计算阴性符合率。
[0120] (3)批内差异
[0121] 同一批次试剂盒，用特征性血清检测，要求CV < 10%。
[0122] (4)批间差异
[0123] 不同批次试剂盒，用特征性血清检测，要求CV < 12%。
[0124] (5)干扰试验
[0125] 用溶血、脂血和黄疸标本各50例进行的干扰实验检测。
[0126] (6)交叉反应
[0127] 采用本试剂盒，进行系统性红斑狼疮（η = 50)、类风湿病（η = 50)、免疫性肝炎（η =50)等自身免疫系统疾病的检测，观察交叉反应。
[0128] (7)稳定性检测
[0129] 应用Arrhenius法则，将试剂盒放置37°C 20天后检测，以上各项指标无显著变化， 确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。
[0130] 以下给出梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的交叉反应测 定：
[0131] 采用本发明的试剂盒检测梅毒螺旋体Nichol株的兔感染实验血清标本，结果为 强阳性，而Reiter株的兔感染实验血清标本结果为阴性。
【权利要求】
1. 梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于设有外包装 盒、浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单 克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、ΤΜΒ显色液Α瓶、显色液Β瓶、反应终止液瓶、 包被有重组抗原微孔板； 浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单 克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、ΤΜΒ显色液Α瓶、显色液Β瓶、反应终止液瓶和 包被有重组抗原微孔板装在外包装盒内； 浓缩洗涤液瓶内装有浓缩洗涤液，阴性对照品瓶内装有阴性对照品，阳性对照品瓶内 装有阳性对照品，生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体瓶内装有生物素标记抗 人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素瓶内装有辣根过氧化物酶 标记亲和素，ΤΜΒ显色液Α瓶内装有ΤΜΒ显色液Α，显色液Β瓶内装有显色液Β，反应终止液 瓶内装有反应终止液； 所述TMB显色液A为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺显色液； 所述显色液B为3%的过氧化氢溶液。
2. 如权利要求1所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特 征在于所述浓缩洗涤液采用溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为 0· 05%。
3. 如权利要求1所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征 在于所述阴性对照品为梅毒螺旋体总抗体阴性对照品，由非梅毒感染的健康人群血清配制 而成。
4. 如权利要求1所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征 在于所述阳性对照品为梅毒螺旋体总抗体阳性对照品，由梅毒患者的阳性血清配制而成。
5. 如权利要求1所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征 在于所述反应终止液为摩尔浓度2mmol/L的硫酸。
6. 如权利要求1所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备方 法，其特征在于包括以下步骤： 1) 提取梅毒螺旋体Nichol株和Reiter株外膜蛋白进行双向电泳后，转移至硝酸纤维 素膜上，用梅毒血清进行免疫印迹实验，获得特征性的免疫印迹斑点，取对应的蛋白点进行 质谱分析，分别找出Nichol株和Reiter株具有较高免疫原性的外膜蛋白，并找出Nichol 株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白； 2) 在梅毒螺旋体的全基因组序列中找出对应基因，设计引物并构建相应的表达载体， 研究不同诱导条件对重组目标蛋白在大肠杆菌中表达量的影响，获得最佳诱导条件，大量 扩增目标蛋白，收集过表达的目标蛋白进行纯化，纯度高于90 %后，进行后续研究； 3) 将步骤2)候选抗原，通过免疫大鼠获得其相应多克隆抗体。采用酶联免疫方法测定 抗体滴度，并使用免疫印迹方法验证这些重组抗原的免疫原性； 4) 采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表 达，得梅毒螺旋体重组抗原； 5) 将步骤4)中的梅毒螺旋体重组抗原用包被缓冲液稀释至20ug/mL，以每孔0. lmL加 入微孔板中，4°C包被24h ;取出抗原板，风干；用0. 01mmol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液配制的 1. 0%脱脂奶粉，每孔0. 2mL，4°C封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、消毒、 密封，得重组抗原包被微孔板； 6) 以人IgM特异性片段μ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定 分泌抗人IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞株； 7) 将抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未 结合的生物素，制备生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体； 8) 采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记，得辣根过氧化物酶标记亲和素； 9) ΤΜΒ显色液Α采用市售品； 10) 显色液B采用市售品； 11) 配制溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0· 05%，得浓缩洗 涤液； 12) 配制2mmol/L的硫酸作为反应终止液； 13) 由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋体抗体阴性对照品； 14) 由梅毒患者的阳性血清配制梅毒螺旋体抗体阳性对照品； 15) 将生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、 ΤΜΒ显色液Α、显色液Β、浓缩洗涤液、反应终止液、阴性对照品、阳性对照品分别装在瓶中， 再将生物素标记抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、 ΤΜΒ显色液Α瓶、显色液Β瓶、浓缩洗涤液瓶、反应终止液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶以 及包被有重组抗原微孔板装入外包装盒中，得到梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免 疫检测试剂盒。
7. 如权利要求1所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备方 法，其特征在于在步骤4)中，所述重组抗原为梅毒螺旋体致病株Nichol株高表达，而梅毒 非致病株Reiter株无表达。
8. 如权利要求7所述梅毒螺旋体IgM抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备 方法，其特征在于所述梅毒螺旋体致病株Nichol株为Treponema pallidum ssp. pallidum strain Nichol ;所述梅毒非致病株 Reiter 株为 Treponema pallidum ssp. pallidum strain Reiter。
【文档编号】G01N33/577GK104155451SQ201410410697
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】童曼莉, 林丽蓉, 刘莉莉, 张惠林, 杨天赐, 张长弓 申请人:厦门大学附属中山医院