一种高灵敏度测试游离生物素的方法
【专利摘要】一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：利用植物乳杆菌对游离生物素的特异性和灵敏性，通过游离生物素的浓度与菌体的生长量和生长速度成正比的关系，根据吸光值与工作曲线进行比较，即可算出试样中待测物的浓度；其中，所述吸光值为采用酶标仪测量培养后的液体获得的吸光度。本发明提供了一种简便、高效的游离生物素的检测方法。
【专利说明】一种高灵敏度测试游离生物素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物食品检测领域，具体地，涉及一种高灵敏度测试游离生物素的 方法，特别是针对婴幼儿食品和乳品中游离生物素的检测。 技术背景
[0002] 生物素又称为维生素H，是水溶性维生素，属于B族维生素，是含硫的一种维生素， 也是生物体内羧基转化酶作用的一种辅酶，故又称为辅酶R。
[0003] 生物素是生物题生长发育必需的一种营养素，它参与有机体多种主要的新陈代谢 活动。特别是对婴幼儿及孕产妇有着特殊的重要性，因此在婴幼儿乳制品、孕产妇乳制品 及食品营养强化剂中添加生物素是十分必要的。其主要的性能与用途有：构成视沉细胞内 感光物质；维持上皮组织结构的完整和健全；增强机体免疫反应和抵抗力和维持正常生长 发育。
[0004] 生物素主要来源于牛奶、牛肝、蛋黄、动物肾脏、草莓、柚子、葡萄等水果中，此外， 瘦肉、糙米、啤酒、小麦中也含有生物素。
[0005] 近些年生物素的发展越来越受到关注，检测的方法也比较多，但每种检测方法的 原理，时效，以及针对的产品都各不相同，故在实际应用上，能针对样品的不同而选择合适 的生物素检测方法也是至关重要的。
[0006] 常用的生物素检测方法有很多，主要包括微生物法、高效液相色谱法、酶联免疫 法、突光法等。
[0007] 其中微生物的方法是目前应用比较广泛的方法，也是婴幼儿食品和乳品中游离生 物素国标检测方法中唯一的检测方法，这个方法主要用于检测样品中生物素含量较少的情 况，原理是利用生物素营养缺陷型菌株对生物素的特异性和灵敏性，定量测定出试验中待 测物质的含量。在含有除待测物质以外的所有营养成分的培养基中，微生物的生长与待测 物质含量呈线性关系，根据透光率与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中待测物质 的含量。
[0008] 选用上述传统的检测方式，此方法虽然灵敏度高，但该方法工作量大，在用分光光 度计读数时要求漩涡混合后立即移入比色皿内进行读数，并且要求每支试管的稳定时间相 同，对操作者的熟练程度有较高的要求，一次最多能检测1到3个培养管，检测效率低，也会 增加误差，费时费力，因此需要开发一种更简便和实用的检测方法。
【发明内容】
[0009] 本发明旨在克服现有技术中的不足之处，提供一种简便、高效的游离生物素的检 测方法。
[0010] 本发明提供的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：利用植物乳杆 菌对游离生物素的特异性和灵敏性，通过游离生物素的浓度与菌体的生长量和生长速度成 正比的关系，根据吸光值与工作曲线进行比较，即可算出试样中待测物的浓度；其中，吸光 值为采用酶标仪测量培养后的液体获得的吸光度。
[0011] 其中，本发明提供的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其植物乳杆菌为 ATCC8014。
[0012] 另外，本发明提供的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，还具备这样的特点， 艮P、具体分析步骤如下所示：步骤一、接种菌悬液的制备；步骤二、样品的处理；步骤三、标 准曲线的制作；步骤四、待测液的制作；步骤五、灭菌；步骤六、接种；步骤七、培养；步骤八、 分析测试；其中，在步骤七中将试管放入培养箱内，36°c±1°C培养19h?20h。
[0013] 此外，在上述步骤八中具体地，包括如下测试程序：
[0014] (1)、对每支试管进行视觉检查，接种空白试管S1内培养液应是澄清的，若出现浑 浊，则结果无效；
[0015] (2)、以接种空白孔S1做对照，测定最高浓度标准曲线试管的吸光度，两小时后重 新测定，两次结果透光率差值若小于2%，则取出全部检验管测其吸光度A;
[0016] (3)、以接种空白试管S2为空白，调节吸光度为0, 一次读出其他每支试管的吸光 度A，样品空白的吸光度A-并读出；
[0017] (4)、充分混合每一支试管后，立即将培养液移入96孔板中，每孔200uL，每个试管 读数前摇匀样液，于660nm波长下读吸光值；
[0018] 上述混合过程，优选用漩涡混合器充分混合每一支试管，之后还可根据需要加入 一滴消泡剂。
[0019] (5)、对每个编号的待测液孔，用每个孔的吸光度值计算每毫升该编号待测液生物 素的含量，并计算该编号待测液的生物素含量平均值。每支试管测得的该浓度不得超过该 平均值的±15%，超过者要舍去，如果符合该要求的孔少于所有四个编号待测液总孔数的 2/3,需要重新检验；如果符合该要求的孔数大于等于原来孔数的2/3,重新计算每一编号 的有效试样孔中每毫升测定液生物素含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样孔的总 平均值，用于计算试样中的生物素含量。
[0020] 上述方法主要应用于测定婴幼儿食品和乳品中的游离生物素。
[0021]本发明的作用和效果
[0022] 本发明提供了一种检测生物素含量的方法。主要是对"GB5413. 19-2010婴幼儿食 品和乳品中游离生物素的测定"方法进行了改进发明，用96孔板代替传统的比色皿进行读 数，在读数时可以省去单支试管逐一读数所用的时间，减少误差，使该方法操作更简便和准 确，节省人力和物力。
[0023]另外，本发明无须特别的培养方式即可施行，操作简单，限定条件少。
[0024] 此外，还限定了具体的分析条件等参数，能够更为准确、快捷的测定婴幼儿食品中 的游离生物素。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 附图1为分光光度计法测定读数曲线；
[0026] 附图2为酶标仪测定读数。
【具体实施方式】
[0027] 1、范围
[0028] 本方法适用于婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定。
[0029] 2、原理
[0030] 利用植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)对游离生物素的特异性和灵敏性， 定量测定出试样中待测物质的含量。在含有除待测物质以外所有营养成分的培养基中，微 生物的生长与待测物质含量呈线性关系，根据透光率与标准工作曲线进行比较，即可计算 出试样中待测物质的含量。
[0031] 3试剂和材料
[0032] 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。
[0033]3. 1 菌株：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)，ATCC8014。
[0034] 3. 2 生物素（d-Biotin或VitaminH)标准品（C1QH16N203S):纯度彡 99%。
[0035] 3. 3培养基
[0036] 3. 3. 1乳酸杆菌琼脂培养基。
[0037] 3. 3. 2乳酸杆菌肉汤培养基。
[0038] 3.3.3生物素测定用培养基。
[0039] 注：一些商品化合成培养基效果良好，商品化合成培养基按标签说明进行配制。
[0040] 3. 4 乙醇溶液（50% )。
[0041] 3. 5硫酸溶液（3% ):量取3mL硫酸加入到水中，定容至100mL。
[0042] 3. 6氢氧化钠溶液（2. 0mol/L):称取80g氢氧化钠溶于1000mL水中。
[0043] 3. 7氯化钠溶液（9g/L):称取9. 0g氯化钠溶解于1000mL水中，分装试管，每管 lOmLo121。。灭菌 15min。
[0044] 3.8标准溶液的制备
[0045] 3. 8. 1生物素标准贮备液（100yg/mL):称取生物素标准品（3. 2)用乙醇溶液 (3.4)定容至生物素浓度为100iig/mL，贮于冰箱中。
[0046] 3. 8. 2生物素标准中间液（1yg/mL):吸取lmL生物素标准贮备液（3. 8. 1)，用乙 醇溶液（3. 4)定容至100mL。
[0047] 3. 8. 3生物素标准工作液（10ng/mL):吸取lmL生物素标准中间液（3. 8. 2)，用乙 醇溶液（3. 4)定容至100mL。
[0048] 3. 8. 4标准曲线工作液分两个浓度，高浓度溶液的浓度为0. 2ng/mL;低浓度溶液 的浓度为〇.Ing/mL。从工作液中（3. 8. 3)吸取两次各5mL，用水分别定容到250mL和500mL。
[0049] 注：所有标准溶液要储存于冰箱内。3. 8. 1、3. 8. 2、和3. 8. 3保存期三个月，3. 8. 4 临用前配制。
[0050] 4、仪器和设备
[0051] 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
[0052] 4. 1 天平：感量为0?lmg。
[0053] 4. 2pH计：精度彡 0? 02。
[0054] 4.3分光光度计。
[0055] 4.4涡旋混合器。
[0056] 4. 5离心机：转速彡2000转/分钟。
[0057] 4. 6 恒温培养箱：36°C± 1 °C。
[0058] 4. 7 冰箱：2°C?5°C。
[0059] 4. 8无菌吸管：10mL(具0?lmL刻度）或微量移液器或吸头。
[0060] 4. 9 瓶口分液器：0mL?10mL。
[0061] 4. 10 锥形瓶：200mL。
[0062] 4. 11 容量瓶（A类）：100mL，250mL，500mL。
[0063] 4. 12单刻度移液管（A类）：容量5mL。
[0064] 4. 13 漏斗：直径 90mm。
[0065] 4. 14定量滤纸：直径90_。
[0066] 4. 15 试管：18mmX180mm。
[0067] 4. 16 96 孔板。
[0068] 4. 17 酶标仪。
[0069]注：玻璃仪器使用前，用活性剂（月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即 可）对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后在200°C干热2h。
[0070] 5、分析步骤
[0071] 5. 1接种菌悬液的制备
[0072] 5. 1. 1将冻干菌株（3. 1)活化后，转接到乳酸杆菌琼脂培养基（3.3. 1)中， 36°C±1°C培养过夜。再转接2?3代来增强活力。然后再将其从固体培养上转接到乳酸 杆菌肉汤培养基（3. 3. 2)中培养。
[0073] 5. 1. 2将乳酸杆菌肉汤中的培养液以2000转/分钟离心2min?3min，倾出上清 液，加入10mL氯化钠溶液（3. 7)，混勻，再离心2min?3min，如此清洗3次?4次，吸适量 该菌悬液于10mL盐水（4. 7)中，待测。
[0074] 5. 1.3用分光光度计以氯化钠溶液（3.7)做空白，于550nm波长下测菌悬液 (5. 1. 2)的透光率，使其透光率在60%?80%之间。
[0075] 5.2样品的处理
[0076] 5. 2. 1干粉样品
[0077] 称取一定量样品（精确至O.OOOlg)于250mL三角瓶中，该样品应含0.2iig? 0. 5iig生物素。继续5. 2. 3步骤。
[0078] 5.2.2液体样品
[0079] 吸一定量的液体样品于250mL三角瓶中，该样品应含0.g?0.g生物素。继 续6. 2. 3步骤。
[0080] 5.2.3样品的提取
[0081] 加入硫酸溶液（3. 5) 100mL，121°C水解30min，冷却后用氢氧化钠溶液（3. 6)调节 pH至4. 5 ±0. 2，定量转到250mL容量瓶中，用水定容，充分混合。用滤纸过滤，弃去最初的 几毫升。吸取滤液5mL，加入约20mL水，用氢氧化钠溶液（3. 6)调pH为6. 8 ±0. 2,定量转 至lj100mL容量瓶中，用水定容。
[0082] 5.3标准曲线的制作
[0083] 按表1顺序加入已灭菌的水、标准曲线工作液（3. 8. 4)和生物素测定用培养基 (3.3.3)于培养管中，一式三份。
[0084]表1标准曲线的制作
【权利要求】
1. 一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：利用植物乳杆菌对游离生物素 的特异性和灵敏性，通过游离生物素的浓度与菌体的生长量和生长速度成正比的关系，根 据吸光值与工作曲线进行比较，即可算出试样中待测物的浓度； 其中，所述吸光值为采用酶标仪测量培养后的液体获得的吸光度。
2. 如权利要求1所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：所述植物 乳杆菌为ATCC8014。
3. 如权利要求1所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于，具体分析 步骤如下所示： 步骤一、接种菌悬液的制备； 步骤二、样品的处理； 步骤三、标准曲线的制作； 步骤四、待测液的制作； 步骤五、灭菌； 步骤六、接种； 步骤七、培养； 步骤八、分析测试。
4. 如权利要求3所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：所述步骤 八中包括如下测试程序：步骤七中所述的培养步骤为将试管放入培养箱内，36°C ±1°C培 养 19h ?20h。
5. 如权利要求3所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：所述步骤 八中包括如下测试程序： (1) 、对每支试管进行视觉检查，接种空白试管S1内培养液应是澄清的，若出现浑浊， 则结果无效； (2) 、以接种空白孔S1做对照，测定最高浓度标准曲线试管的吸光度，两小时后重新测 定，两次结果透光率差值若小于2%，则取出全部检验管测其吸光度A ; (3) 、以接种空白试管S2为空白，调节吸光度为0, 一次读出其他每支试管的吸光度A， 样品空白的吸光度A-并读出； (4) 、充分混合每一支试管后，立即将培养液移入96孔板中，每孔200uL，每个试管读数 前摇匀样液，于660nm波长下读吸光值； (5) 、对每个编号的待测液孔，用每个孔的吸光度值计算每毫升该编号待测液生物素的 含量，并计算该编号待测液的生物素含量平均值。
6. 如权利要求5所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：每支试 管测得的该浓度不得超过该平均值的± 15 %，超过者要舍去，如果符合该要求的孔少于所 有编号待测液总孔数的2/3,需要重新检验；如果符合该要求的孔数大于等于原来孔数的 2/3,重新计算每一编号的有效试样孔中每毫升测定液生物素含量的平均值，以此平均值计 算全部编号试样孔的总平均值，用于计算试样中的生物素含量。
7. 如权利要求5所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：用漩涡混 合器充分混合每一支试管。
8. 如权利要求7所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：充分混合 后还可加入一滴消泡剂。
9.如权利要求1-8任一所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法，其特征在于：用 于测定婴幼儿食品和乳品中的游离生物素。
【文档编号】G01N21/31GK104330288SQ201410331877
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】胡国华, 严婷 申请人:普研（上海）标准技术服务有限公司