一种miRNA标记物、其方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于预测、诊断和/或评价食管磯状细胞癌 患者对放化疗是否存在响应的标记物及其应用，尤其涉及使用两种在人血清中稳定存在且 可检测的微小核糖核酸成熟体作为预测、诊断和/或评价食管磯状细胞癌患者对放化疗是 否存在响应的标记物。进一步地，本发明还提供了用于检测所述标记物的探针组合、试剂盒 和生物芯片W及所述标记物的应用，具体地，通过检测受试者血清中所述标记物的表达水 平和变化，来判断食管磯状细胞癌患者是对放化疗是否存在响应。
【背景技术】
[0002] 食管癌是一种具有不良预后的致命恶性肿瘤，其中食管鱗状细胞癌巧SCC)是一 种具有鱗状细胞分化的恶性上皮性肿瘤，其显微镜下特点表现为角质细胞样细胞之间存在 细胞间桥，或伴有角化。
[0003] 食管鱗状细胞癌在发生率、死亡率和性别比率上均显示了极大的地域差异。在西 方国家的大部分地区，鱗状细胞癌每年的标准年龄发病率，男性为< 5人/10亿，女性< 1 人/10万。在一些高危地区，比如法国西北部的诺曼底和卡己度思W及意大利北部，发病率 高达30人/10万，女性为2人/10万。送种癌在东方国家及许多发展中国家发病率更高。 目前已经确认的高发区有伊朗、中国中部、南非W及己西南部。在中国河南省省会郑州市， 男性死亡率> 100人/10万，女性> 50人/10万。无论在高危还是低危地区，送种癌极少 发生在30岁W下患者，男性及女性发病的平均年龄为65岁。在中国，食管鱗状细胞癌是最 常见的食管癌类型。
[0004] 手术仍然是送种癌症的主要治疗手段，然而，ESCC的预后不良。根据文献记录。 长期预后率较低，五年生存率约为30%。早期发现的浅表性癌可W治愈。生存率依赖于W 下几个方面，包括肿瘤诊断时的分期、所接受的治疗、患者的一般身体状况、肿瘤的形态学 特点W及分子学特点。过去对于预后指标的研究大部分都集中在郝些接受过外科手术的患 者，极少研究接受过放化疗或多方式治疗的患者。
[0005]为了改善送种癌症的治疗效果，当前已经将术前放化疗并入治疗计划。送种术前 放化疗确实导致更好的结果，增加了治愈的机会。不幸的是，对于不存在响应的患者可能不 得不经受长时间、不必要的和有潜在毒性的治疗，而不能获得益处。然而，对于患者是否对 放化疗存在响应，当前还没有开发出可靠的预测方法。因此，迫切需要一种方法，用来区分 对放化疗有响应的患者和对放化疗没有响应的患者。
[0006] 微小核糖核酸（microRNA，简写作miRNA)是一类长约19至23个核巧酸的非编码 单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中。近五年来在人 类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸分子。
[0007] 微小核糖核酸通过识别祀mRNA的3'端非翻译序列，与之不完全互补，从而抑制祀 mRNA的翻译，是mRNA强有力的调节因子，并在基因表达调控领域中起重要作用。
[0008] 微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，与许多疾病的发生及发展存 在密切联系。微小核糖核酸完全可w作为一类新的疾病标志物，相比于传统的病理切片或 单一使用的生化指标等手段，能更加准确地辅助诊断疾病，判断疾病的发展阶段，预测并发 症发生和恶性疾病复发的几率，W及疾病的预后，并评价药效和疗效。
[0009] 微小核糖核酸在作为疾病标志物方面的优势，使其成为近年研究的热点，相关技 术及产品也相继涌现。
【发明内容】
[0010] 为了满足上述需求，本申请发明人在寻找用于预测、诊断和/或评价食管磯状细 胞癌患者对放化疗是否存在响应的标记物时，将研究目光投向较易获得，甚至常规体检中 就可W收集到的血液中的微小核糖核酸。由于血液会循环至全身所有组织，并向细胞输送 营养并清除废物，因此血液更能够反映出整个机体的生理、病理状况。在此基础上，发明人 继续研究，并对标记物的种类进行了筛选和优化，最终获得的可解决所述的技术问题的标 记物的种类大大减少，相应的探针库也得到极大简化，同时还能实现高诊断准确率。
[0011] 因此，本发明的目的是一种miRNA标记物，该标记物可W用于预测、诊断和/或评 价食管磯状细胞癌患者对放化疗是否存在响应。
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种用于预测、诊断和/或评价食管磯状细胞癌患者 对放化疗是否存在响应的探针组合。
[0013] 本发明的又一个目的是提供一种检测miRNA标记物的方法。
[0014] 本发明的另一个目的是提供上述标记物的用途，包括制备相应的试剂盒和生物芯 片。
[0015] 本发明的再一个目的是提供使用上述标记物预测、诊断和/或评价受试者对放化 疗是否存在响应的方法。
[0016] 本发明的目的是采用W下技术方案来实现的。
[0017] 一方面，本发明提供一种用于预测、诊断和/或评价食管磯状细胞癌患者对放化 疗是否存在响应的标记物，所述标记物为miRNA-16和/或miRNA-193b。
[0018] 另一方面，本发明提供了一种检测上述标记物的方法，所述方法选自反转录聚合 酶链式反应方法（RT-PCR)、实时英光定量聚合酶链式反应方法巧ea^time PCR)、微滴式数 字PCR方法值roplet Digital PCR)、No;rthe;rn印迹杂交方法（No;rthe;rn blotting)、核糖 核酸酶保护分析方法（RNase protection assay)、Solexa测序技术（Solexa sequencing technology)、生物芯片方法和新一代测序方法（Next Generation Sequencing)中的一种 或几种。
[0019] 优选地，所述方法为RT-PCR方法，例如包括W下步骤的RT-PCR方法：
[0020] 1)提取受试者的血清总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试 者的血清样本，W血清作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
[002。 2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；
[002引 3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
[0023] 4化B染色后在紫外灯下观察结果；
[0024] 或者优选地，所述方法为Real-time PCR方法，例如包括W下步骤的Real-time PCR方法：
[00巧]1)提取受试者的血清总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试 者的血清样本，W血清作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
[0026] 2)用微小核糖核酸设计引物；
[0027] 3)加入英光探针进行PCR反应；
[0028] 4)检测并比较血清样本相对于正常血清中微小核糖核酸的量的变化。
[0029] 或者优选地，所述方法为化opletDigitalPCR方法，例如包括如下步骤的 DropletDigitalPCR方法：
[0030] 1)提取受试者的血清总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试 者的血清样本，W血清作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
[0031] 2)对样品进行微滴化处理；
[0032] 3)用微小核糖核酸设计引物；
[003引4)加入英光探针进行PCR反应；
[0034] 5)检测并比较血清样本相对于正常血清中微小核糖核酸的量的变化。
[0035] 或者优选地，所述方法为RT-qPCR方法，例如包括如下步骤的RT-qPCR方法：
[0036] 1)提取受试者的血清总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试 者的血清样本，W血清作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
[0037] 2)对样品进行预扩增；
[0038] 优选地，所述预扩增包括W下步骤：
[0039]a)配制含除cDNA和引物W外试剂的预扩增PCR体系母液，份数依逆转录得到的 cDNA的份数来定；
[0040]b)取母液混合物放入PCR反应管中，加入对应的引物（包含正向引物、反向引物） 及逆转的cDNA，组成20μ1的反应体系，混合均匀。
[0041]C)将20μ1的混合物进行PCR预扩增；
[0042] 优选地，所述扩增条件为95°ClOmin，一个循环；95°C15s，60°CImin，12个循环；
[004引3)qRT-PCR反应，并对待测的miRNA进行定量；
[0044] 优选地，所述RT-qPCR方法中，使用ΔCT法处理数据，其中每个miRNA相对于标准 内参的表达量用方程2AET表示，ACT=CT样品-CT内参。
[0045] 具体来说，本发明提供的检测受试者血清中的上述标记物的方法，可W进一步评 价患者对放化疗是否存在响应。所述检测人体血清中稳定存在且可检测的上述标记物 的方法包括：反转录聚合酶链式反应方法（RT-PCR)、实时英光定量聚合酶链式反应方法 (Real-timePCR)、微滴式数字PCR方法值ropletDigitalPCR)、No;rthe;rn印迹杂交方 法（No;rthe;rnblotting)、核糖核酸酶保护分析方