专利名称：链亲和素-白细胞介素2融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及来源于动物的多肽，特别是白细胞介素-2。
技术背景白细胞介素-2 (Interleukin-2， IL-2)是一种T细胞生长因子和信号调节分子，有很重要 的免疫调节作用。有如下功能促进T细胞增殖，提高细胞毒T细胞、NK细胞和单核细胞 活性；诱导B细胞生长和抗体产生；诱导周围血中淋巴细胞衍生为LAK细胞；诱导继发的 细胞因子分泌，如TNFa、 GM-CSF、 IFN等；增强T细胞表面的IL-2受体的表达。因此，IL-2 具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。IL-2基因常用来修饰肿瘤细胞，制备肿瘤 细胞疫苗，以增强肿瘤抗原的免疫原性。通过原位基因转染(或转导)在肿瘤病灶局部实现 IL-2持续有效表达的治疗策略，已在表浅膀胱癌的临床前研究中显示出诱人的前景。但是， 用基因修饰法制备肿瘤细胞疫苗存在如下固有缺陷修饰效率一般都较低(尤其是原位基因 转染或转导)，并取决于肿瘤细胞类型；因影响因素较多，致使治疗基因的蛋白质表达产物的 有效浓度在周部难于达到并较长时间地维持，从而实际抗肿瘤的临床效果非常有限；因个体 差异和获得肿瘤标本时肿瘤细胞的成活状态不一致，往往有些病人因无法提供成活状态较好 的肿瘤细胞，最终不能制成自体肿瘤细胞疫苗；往往有潜在的病毒载体安全性问题(所谓"遗 传毒性")和免疫原性问题(反复使用同一病毒载体会影响导入基因的表达效率)；很难同时 高效表达多个具有协同作用的免疫刺激因子，并对它们的表达量进行精确控制。此外，基因 修饰的自体肿瘤细胞疫苗制备比较费时，不易大规模开展和广泛使用。 发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种可以对肿瘤细胞进行快速表面修饰并能够永久地锚 定在肿瘤细胞表面的新型白细胞介素-2。本发明解决上述技术问题的技术方案是一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-2构成，其中所述的接 头肽的氨基酸序列为Ser Ser GIy Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。本发明融合蛋白中的链亲和素位于接头肽的N端或C端；其中链亲和素位于接头肽的N 端的融合蛋白(如SEQN0.2)的活性比链亲和素位于接头肽的C端的融合蛋白(如SEQN0.1) 高两倍以上。本发明融合蛋白可通过将链亲和素基因、白细胞介素-2基因以及连接所述的链亲和素和
白细胞介素-2的接头多核苷酸通过基因重组、转化构建工程菌表达获得，其中基因重组和转 化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还可以连 接有纯化标签，如本发明融合蛋白SEQN0.3的链亲和素的C端连有组氨酸标签、本发明融 合蛋白SEQN0.4的链亲和素的N端连有组氨酸标签。本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的多核苷酸，该多核苷酸由成熟链亲和素cDNA、 成熟白细胞介素-2 cDNA通过TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGATCC连接而成；该多核苷酸中成熟链亲和素cDNA的末端还可以连接有CAT CAT CAC CAT CAC CAT。将所述的编码本发明融合蛋白的多核苷酸通过基因重组插入到原核表达载体中，然后转 化大肠杆菌可获得高效表达本发明融合蛋白的工程菌；所述的原核表达载体可以是pET24a 或pET24d，大肠杆菌为BL21 (DE3)。本发明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体的形式存在，从包涵体中分离纯化蛋白并 复性处理后，即可获得本发明融合蛋白。本发明融合蛋白采用富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽连接白细胞介素-2和链亲和素，此15 肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性， 使融合蛋白具有链亲和素和白细胞介素-2的双重活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合 将白细胞介素-2锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在Y射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在， 并仍保持白细胞介素-2的活性。经本发明融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，可用于制备预防性 和治疗性肿瘤的疫苗。本发明所述的肿瘤疫苗是将本发明融合蛋白锚定在生物素化的肿瘤细 胞表面获得的。本发明所述的肿瘤疫苗的制备充分利用了蛋白质的氨基(即-NH2)易生物素化以尿生物 素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性，先用生物素化试剂将生物素化学 交联到欲修饰的肿瘤细胞表面，然后本发明融合蛋白借助链亲和素与生物素的特异结合将白 细胞介素-2迅速永久地锚定在肿瘤细胞表面，从而使白细胞介素-2在局部达到持续有效的治 疗浓度；再者，由于一个链亲和素蛋白可结合四个生物素，因此本发明融合蛋白锚定到肿瘤 细胞的量是可以精确控制的。
图1是IL2 -L-SA-6His-pET24重组质粒的结构图。 图2是6His-SA-L-IL2-pET24重组质粒的结构图
图3是融合蛋白IL2-L-SA-6His的SDS-PAGE电泳图，其中1是分子量标准，2是工程 菌诱导前，3是工程菌诱导后；4是包涵体，5是Ni-NTA柱层析后；6是2-Iminobiotin亲和柱层析后。图4是用抗IL-2单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的 816110表面上本发明融合蛋白进行检测的结果，左峰为未修饰的细胞(阴性对照)，而右峰 为本发明融合蛋白锚定修饰的细胞。图5是用PHA刺激人外周血淋巴细胞MTT法对锚定在生物素化的B16.F10表面上本发 明融合蛋白的IL-2进行生物活性测定的结果，以锚定在生物素化的B16.F10表面上GFP-L-SA为阴性对照；其中，表示本发明融合蛋白，+表示融合蛋白0 丄-8八。图6是接种本发明肿瘤疫苗后的预防肿瘤小鼠模型的肿瘤生长情况曲线图，以GFP-L-SA 修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中实线表示本发明融合蛋白组，虚线表示 GFP-L-SA对照组。图7是接种本发明肿瘤疫苗后的预防肿瘤小鼠模型的小鼠存活情况曲线图，以GFP-L-SA 修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中实线表示本发明融合蛋白组，虚线表示 GFP-L-SA对照组。图8是接种本发明肿瘤疫苗后的治疗肿瘤小鼠模型的小鼠存活情况曲线图，以GFP-L-SA 修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中实线表示本发明融合蛋白组，虚线表示 GFP-L-SA对照组。下面将通过实施例进一步说明本发明以及本发明具有的技术效果。
具体实施方式
下述实施例和实验所用的材料及设备如下细胞株、菌株与质粒B16.F10 (鼠黑色素瘤细胞株)；菌株S"印tomyces oWcftm'!'(亲和素 链霉菌，ATCC)， DH5a和BL21 (DE3);原核表达质粒pET24a (Kana、 Novagen)。主要生化试剂及材料DNeasy组织试剂盒和质粒DNA的制备试剂盒(Qiagen)，寡核苷 酸的合成(Sigma), Trizol, Superscript II逆转录酶，Platinum尸;5c DNA聚合酶和T4 DNA连接 酶(Invitrogen); IL-2标准品(R&D Systems),琼脂糖和SDS-PAGE (Biorad); 2-Iminobiotin (Sigma)和Ni-NTA(Qiagen)填料；Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce)和抗IL-2单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)。DNA片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶点泳
等常规方法均参照文献(Sambrook J， et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2nd edition, 1989)或厂家提供的产品说明书；DNA 序列分析在大连宝生物工程公司的DNA测序服务中心完成。 例1融合蛋白IL2 -L-SA-6His的制备1、 用DNeasy组织试剂盒从亲和素链霉菌抽提出细菌的基因组DNA，然后用其作为模板， 通过Platinum/ 々DNA聚合酶进行PCR制备成熟链亲和素cDNA 。弓I物5'GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCG GATCCG CCGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCC 3' (78nt)和 5'GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3， (39nt)。反应条件变性94。C， 2min，循环(94°C， 15s—60°C， 15s—68°C， 30s) 25轮，最后 68°C， 5min。2、 用Trizol抽提起PHA-活化的外周血淋巴细胞的总RNA，并以其作为模板，进行 RT-PCR制备成熟IL-2 cDNA。引物5， CATGCCATGGCTCCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3， (33nt)禾口 5， GGAATTCAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTG 3， (31nt)反应条件变性94。C， 2rain，循环(94°C， 15s—60°C， 15s—68°C， 30s) 25轮，最后 68。C， 5min。3、 构建IL2-L-SA-6His-pET24重组质粒制备的IL-2 cDNA (不含终止码，两端分别含NcoI和EcoRI限制性内切酶位点)和SA cDNA (不含终止码，两端分别含EcoRI和Xhol限制性内切酶位点)，将上述IL-2和SA基因片段 克隆于pET-24d载体中，获得IL2-L-SA-6His-pET24重组表达质粒(结构图如图1所示)。其 中L为富含甘氨酸、丝氨酸的连接肽(17肽)。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定，验证其 正确无误。4、 构建IL2-L-SA-6His-pET24/BL21 (DE3)工程菌IL2-L-SA-6His-pET24重组表达质粒转化后BL21 (DE3)感受态细胞后，用含卡那霉素 的LB平皿筛选。挑取转化平皿上的单菌落接种于加有卡那霉素(20ng/ml)的LB培养基中。 经37。C摇床培养扩增至吸光度A600为0. 4 0. 5时，加入终浓度为0. lmmol/L的IPTG， 37 。C诱导表达4h，离心(8000gX 10min)收获菌体，将细胞破碎后用12%的SDS-PAGE检测分析融 合蛋白的表达情况。5、 融合蛋白IL2 -L-SA-6His的表达融合蛋白6His-SA-L-IL2在菌体中主要以包涵体的形式存在，其表达量达20 30%。 6、 从包涵体中获得融合蛋白IL2-L-SA-6Hisa. 制备包涵体5克菌体悬于100ml lxPBS中，冰浴中超声(电流270mA), 30秒X10 次(每次间隔30秒);接着于4'C离心10分钟(8000g)，将沉淀悬浮于100ml lxPBS (内含4mol/L 尿素，0.5%Triton X-100, 20mmol/L EDTA)中进行漂洗，随后离心(1000gX10分钟)收集沉 淀；漂洗两次后，溶于10Ommol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素(pH 8.0)中，15000gX 15分钟，取上清液。b. Ni-NTA柱层析将步骤a得到的上清液上样于Ni-NTA柱(2.6X5cm)，用平衡液 (100讓ol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，pH8.0)进行冲洗至样品八28()恢复至基线；然后用洗 脱液(100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，pH4.5)进行洗脱，洗脱液经SDS-PAGE鉴定， 收集融合蛋白质峰(融合蛋白IL2 -L-SA-6His的分子量为34KD)。c. 透析复性将Ni-NTA柱层析纯化获得的IL2-L-SA-6His融合蛋白调至OD28()=0.2， 在大于20倍体积的透析液(100mmol/L NaHC03, 1.0mol/L尿素，lmmol/L还原型谷胱苷肽, 0.2mmol/L氧化型谷胱苷肽，pH 9.0)中4'C透析复性12小时；然后在50mmol/L NaHC03， 500mmol/LNaCl， pH 11中继续透析6小时；离心除去不溶物，收集上清。d. 2-Iminobiotin亲和柱层析用平衡液(50mmol/LNaHCO3， 500mmol/LNaCl， pHll) 洗脱5个柱体积后(柱体积0.5X2cm)，将收集的已复性融合蛋白质液上亲和层析柱，并用平 衡液洗脱至样品A加恢复至基线；然后，用50mmol/LNaAc，pH4.0洗脱，分管收集各洗脱峰， 并用10x平衡液(500mmol/LNaHCO3， 5mol/LNaCl， pH 11)将收集的融合蛋白质液调至 pH8.0，并过滤除菌分装，储存于—20°C。所得融合蛋白IL2 -L-SA-6His用SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。7、 利用PHA剌激人外周血淋巴细胞对IL-2的活性进行测定，测得的IL-2活性为 lxl06U/mg。例2融合蛋白6His-SA-L-IL2的制备1、 制备成熟链亲和素cDNA:方法与例1同。 引物5， GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG 3'(55nt)和5'GGAATTCGGCGGATCCGCCCCCGCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCCGCTCGT CTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3， (82nt)。2、 制备成熟IL-2 cDNA:方法与例1同。 引物 ， GGAATTCATGGCTCCTACTTCAAGTTCTAC 3， (30nt)和5， CCCAAGCTTTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTG 3, (36nt)。3、 构建6His-SA-L-IL2-pET24重组质粒制备的SA cDNA (不含终止码，两端分别含Ndel和EcoRI限制性内切酶位点)和IL-2 cDNA (两端分别含EcoRI和HindIII限制性内切酶位点)，将上述SA和IL-2基因片段克隆于 pET-24a载体中，获得6His-SA-L-IL2-pET24重组表达质粒(结构图如图2所示)。其中L为 富含甘氨酸、丝氨酸的连接肽。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。4、 构建6His-SA-L-IL2-pET24/BL21 (DE3)工程菌方法与例1同。5、 融合蛋白6His-SA-L-IL2的表达融合蛋白6His-SA-L-IL2在菌体中主要以包涵体的形式存在，6His-SA-L-IL2融合蛋白的 分子量为33KD，其表达量达20 30%。6、 从包涵体中获得融合蛋白6His-SA-L-IL2:方法与例1同。7、 利用PHA刺激人外周血淋巴细胞对IL-2的活性进行测定，测得的IL-2活性为 2xl06U/mg，是IL2-L-SA-6His融合蛋白相应比活的2倍。例3 IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白修饰的肿瘤疫苗的制备 将107个B16.F10细胞悬浮在lml 1 XPBS中，加入0.5mg Sulfo-NHS-LC-Biotin并混匀 后，室温下作用30分钟；用1XPBS洗涤细胞3次后，每106个B16.F10细胞加入200ng IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白，冰上作用30分钟；1XPBS洗涤细胞1次后，然 后用Y射线灭活(20000md)即可。例4本发明融合蛋白对肿瘤细胞的修饰效果及其稳定性检测用抗IL-2单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的B16.F10表面 上的IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白进行检测，结果见图4，几乎100%的肿瘤细 胞被修饰，且肿瘤细胞表面有大量的IL-2。对锚定在肿瘤细胞表面的IL2-L-SA-6His融合蛋 白的稳定性经流式细胞仪进行分析表明，在一周内这些锚定的融合蛋白在细胞表面的数量无 显著下降。例5对锚定在生物素化的B16.F10表面上的本发明融合蛋白进行IL-2生物活性的测定首先将表面己锚定了 IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白的106个B16.F10经超声破碎，离心收集其不溶的膜性成分；然后将其悬浮于100nl完全培养基中，用PHA剌激人外周血淋巴细胞MTT法对其中的IL-2进行生物活性测定，结果如图5所示，活化的淋巴细胞的生长增殖依赖于已锚定修饰细胞的不溶膜性成分的剂量，表明IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白锚定在细胞表面后仍然能保持IL-2的生物活性。
例6本发明融合蛋白修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗预防肿瘤的效果(1) 材料本发明肿瘤疫苗制备方法见实施例3; GFP-L-SA-6His (即绿色荧光蛋白和链亲和素的 融合蛋白)修饰的、y射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞作为实验的阴性对照。(2) 方法分别将106个GFP-L-SA-6His修饰的、y射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞以及 本发明肿瘤疫苗接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮内，14天后加强一次；7天后，将105未 经任何处理的B6.F10肿瘤细胞接种于小鼠右肋腹部的皮下，然后观察肿瘤的生长情况和小鼠 在40天内的成活情况(3) 结果有20%的免疫小鼠获得100%的保护(即无肿瘤生长)，阴性对照组全部有肿瘤生长(图 6)。同时，本发明肿瘤疫苗的预防接种组的生存数及生存期显著高于GFP修饰的阴性对照组 (图7)。例7本发明融合蛋白修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗治疗肿瘤的效果。(1) 材料见实施例6。(2) 方法将1()S个未经任何处理的B6.F10肿瘤细胞接种于小鼠右肋腹部的皮下；4， 11和18天后， 分别将106 GFP-L-SA-6His或IL2-L-SA-6His修饰的、y射线灭活(20000rad)的B6.F10肿 瘤细胞接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮内，然后观察肿瘤的生长情况和小鼠在40天内的 成活情况。(3) 结果如图8所示,本发明肿瘤疫苗治疗组的生存数及生存期显著高于GFP修饰的阴性对照组。SEQUENCE LISTING〈110〉南方医科大学<120〉链亲和素/白细胞介素2融合蛋白<160〉 4<170> Patentln version 3.3<210> 1<211〉 3i0<212> PRT <213〉人工序列<220〉<221〉 CHAIN〈222〉 (1)..(136) <223〉人成熟IL-2<220><221〉 DOMAIN<222〉 (137)..(151)
<223〉甘氨酸和丝氨酸的链接肽(L),此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元 蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，最终提高融合蛋白的双 重活性。 .<220〉〈221〉 CHAIN〈222〉 (152)..(310)<223〉链霉菌成熟的全长链亲和素(SA)<400〉 1Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu GIu 15 10 15His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr 20 25 30Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn He Asn Val lie Val Leu Glu 85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110
Ala Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr Phe Cys Gin Ser 115 120 125
He lie Ser Thr Leu Thr Glu Phe Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gin 145 150 155 160
Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu 165 170 175
Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly 180 185 190<formula>formula see original document page 13</formula>
〈210〉 2
<211〉 299
<212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
<221> CHAIN
<222> (1)..(147)
<223〉链亲和素；与成熟的全长相比，在N-端缺失了 13个氨基酸。 <220〉
<221〉 DOMAIN
<222> (148)..(165)
<223>连接肽，并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位点。 <220>
<221> CHAIN
<222〉 (166)..(299) <223〉人成熟IL2。
<400> 2
Met Glu Ala Gly lie Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr 15 10 15
Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 20 25 30
Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60
Val Ala T卬Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80
Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg He Asn Thr Gin Trp 85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser He 115 120 125
Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala 130 135 140
Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160
Gly Ser Ala Glu Phe Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr 165 170 175
Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp' Leu Gin Met lie Leu Asn 180 185 190
Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 195 200 205
Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys 210 215 220
Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin 225 230 235 240
Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn lie Asn 245 250 255
Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu 260 265 270
Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg T卬lie 275 280 285
Thr Phe Cys Gin Ser lie lie Ser Thr Leu Thr 290 295
<210〉 3
<211> 316
<212> PRT <213>人工序列
<220>
<221〉 CHAIN
<222> (1)..(136)
<223>人成熟IL-2的cDNA
<220〉
〈221> DOMAIN <222> (137)..(151)
<223〉富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽(L),此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各 单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，最终提高融合蛋白 的双重活性。
<220>
<221> CHAIN
<222> (152)..(310)
<223>链霉菌成熟的全长链亲和素。
<220〉
<221〉 PEPTIDE
<222〉 (311)..(318) <223〉组氨酸标签
〈400> 3
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu 15 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr 20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu 85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110
Ala Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr Phe Cys Gin Ser 115 120 125
lie lie Ser Thr Leu Thr Glu Phe Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gin 145 150 155 160
Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly lie Thr Gly Thr T卬Tyr Asn Gin Leu 165 170 175
Gly Ser Thr Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly 180 185 190
Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr
195
200
205
Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu
210
215
220
Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala
225
230
235
240
Thr Thr T卬Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg lie Asn
245
250
255
Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys
260
265
270
Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala
275
280
285
Pro
290
295
300
Leu Asp Ala Val Gin Gin Leu Glu His His His His His His
305
310
315
<210〉 4
<211〉 305
〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220>
〈221> PEPTIDE
<222> (2)..(7)
〈223〉 组氨酸标签
<220〉
<221〉 CHAIN
<222〉 (8)..(153)
<223〉链亲和素；与成熟的全长相比，在N-端缺失了 13个氨基酸。 <220〉
<221〉 DOMAIN
<222> (154),.(171)
<223〉连接肽，并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位点。 <220>
<221> CHAIN
<222〉 (173)..(305)<223> 人成熟IL2<400〉 4Met His His His His His His Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr51015Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala202530Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr354045505560Thr Ala Leu Gly T卬Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala65707580His Ser Ala Thr Thr T卬Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala859095Arg He Asn Thr Gin T卬Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn 100 105 110Ala T卬Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys 115 120 125Pro Ser Ala Ala Ser He Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn 130 135 140Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Phe Met Ala Pro Thr Ser 165 170 175Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp 180 185 190Leu Gin Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu 195 200 205Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 210 215 220Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu 225 230 235 240Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp 245 250 255Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu 260 265 270Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu 275 280 285Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Cys Gin Ser lie lie Ser Thr Leu 290 295 300Thr 30权利要求
1、一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-2构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala。
2、 根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于所述的链亲和素位于接头肽的N端。
3、 根据权利要求2所述的一种融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ.N0 2。
4、 根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于所述的链亲和素位于接头肽的C端。
5、 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的的链亲和素部分的末端连接有纯 化标签。
6、 一种基因，该基因编码权利要求l、 2、 3或4融合蛋白。
7、 一种表达载体，该表达载体含有权利要求5所述的基因。
8、 一种工程菌，该工程菌转化了权利要求6所述的表达载体。
9、 权利要求l、 2、 3或4所述的融合蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用。
10、 一种肿瘤疫苗，该肿瘤疫苗是将权利要求l、 2、 3或4所述的融合蛋白锚定到经过 生物素化的肿瘤细胞的表面获得的。
全文摘要
本发明提供一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-2构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为SerSerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。本发明融合蛋白同时具有链亲和素和白细胞介素-2的活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将白细胞介素-2锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持白细胞介素-2的活性。经本发明融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，可用于制备预防和治疗肿瘤的疫苗。
文档编号C07K19/00GK101148477SQ200710030119
公开日2008年3月26日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者周明乾, 林来新妹, 胡志明, 高基民 申请人:南方医科大学