多孔基质蛋白递送与功能强化的制作方法

文档序号:9602010阅读:382来源:国知局
多孔基质蛋白递送与功能强化的制作方法
【专利说明】多孔基质蛋白递送与功能强化 相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求于2013年7月25日提交的61/858, 488号美国临时专利申请的优先 权,该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。
【背景技术】
[0002] 在保存期间,生物分子应当抗聚集、变性和降解以保持稳定。根据生物分子的相对 纯度、任何污染性生物分子的性质、本身生物分子的一级、二级和三级结构以及进行保存的 环境,生物分子的稳定性呈现高度差异。
[0003] 保存方法包括将生物分子沉淀和/或结晶。例如,生物分子(如蛋白质)可用沉 淀剂如硫酸铵来沉淀和/或结晶并保存供后续重溶(reconstitution)。或者,生物分子可 冻干并以固体形式保存。又或者,生物分子可保存于溶液中,例如缓冲溶液中。已经以合适 方式保存使其(或其大部分)稳定的生物分子此后可以自保存介质递送或者提取,并后续 用于各种目的。

【发明内容】

[0004] 在一些实施方式中,本发明提供递送蛋白质的方法,所述方法包括:提供多孔基 质,其包含可逆固定有蛋白质和蛋白质聚集改性剂;以及用洗脱剂从多孔基质洗脱所述可 逆固定的蛋白质,由此递送所述蛋白质。
[0005] -些情况中,洗脱剂含有pH高于所述可逆固定蛋白质的等电点的缓冲溶液。一些 情况中,洗脱剂含有蛋白聚集改性剂,其选自:环糊精、非离子表面活性剂、离子型表面活性 剂、两性离子表面活性剂、非去污剂磺基甜菜碱、简单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集改性 蛋白、无序肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、冷冻保护剂和离液剂。一些情况中,洗 脱剂含有蛋白质印迹转移缓冲剂。蛋白质印迹转移缓冲剂可含有三(羟基甲基)氨基甲烷 (Tris)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、甘氨酸、甲醇、乙醇或丙醇。蛋白质印迹转移缓 冲剂可含有选自三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、甘氨 酸、甲醇、乙醇和丙醇的两种或更多种化合物。
[0006] -些情况中,所述洗脱包括使基质经历扩散、毛细管作用、真空、压力或电泳,或者 使多孔基质接触对被可逆固定的蛋白质有亲和性的磁性颗粒。一些情况中,所述洗脱包括 把部分蛋白质洗脱到膜上。一些情况中,所述方法包括用洗脱剂从多孔基质洗脱至少50% 可逆固定的蛋白质。一些情况中,所述方法包括用洗脱剂从多孔基质洗脱基本全部可逆固 定的蛋白质。一些情况中,与从多孔基质上洗脱的不含蛋白质聚集改性剂的蛋白质相比,洗 脱下的可逆固定的蛋白质较少聚集。
[0007] -些情况中,所述膜的表面上固定有蛋白质。一些情况中,膜上的非特异性结合位 点被封闭。一些情况中,所述洗脱包括使基质接触膜并将基质上可逆固定的蛋白质通过扩 散、毛细管作用、真空、压力或电磁力的作用转移至膜。一些情况中,所述方法还包括从膜上 洗去非特异性结合以及未结合的洗脱蛋白质。一些情况中,所述方法还包括检测膜上洗脱 蛋白质的存在。
[0008] -些情况中,所述方法还包括使从基质洗脱的蛋白质结合膜表面上的固定化蛋白 质;并且检测膜上洗脱蛋白质的存在,由此检测膜表面上固定化蛋白质的存在。一些情况 中,有1、2、3、4或更多种不同的蛋白质可逆固定在多孔基质上。一些情况中,有1、2、3、4或 更多种不同的蛋白质可逆固定在多孔基质的1、2、3、4或更多区域例如横向分隔区域上。
[0009] -些情况中,所述多孔基质含有选自下组的成分:沃特曼纸(whatmanpaper)、纸、 纤维素滤器、玻璃微纤维滤器、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、烧结玻璃、烧结聚合物、 烧结金属、纺粘聚酯、人造丝、尼龙、多孔聚合物整料、多孔聚合物珠、毛细管芯吸床、天然或 合成海绵以及纤维玻璃。一些情况中,所述毛细管芯吸床是薄膜色谱板。
[0010] -些情况中,所述多孔基质包括掩蔽区和可逆固定化区,其中所述可逆固定的蛋 白质是固定在可逆固定化区。一些情况中,所述可逆固定的蛋白质被可逆固定覆盖至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、全部或基本全部的所述可逆固定化 区。一些情况中,所述多孔基质还包含2、3、4或更多个可逆固定化区。一些情况中,所述多 孔基质还包含边界区。一些情况中,掩蔽区含有疏水聚合物。一些情况中,掩蔽区含有脂 肪酸或蜡。一些情况中,所述可逆固定的蛋白质均匀分布在所述基质至少一个表面的至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、全部或基本全部。
[0011] -些情况中,可逆固定的蛋白质被可逆固定在多孔基质上持续不到约12小时、24 小时、48小时、或不到约1周。一些情况中,蛋白质被可逆固定在多孔基质上持续至少约1 周、1月、3月、6月、9月或1年。
[0012] -些情况中,可逆固定化的蛋白质是抗体。一些情况中,所述抗体被可逆固定在 多孔基质上且所述多孔基质上没有固定化其它抗体。一些情况中,不到50%、40%、30%、 20 %、10%、5%、2%、1%、基本没有或者没有蛋白质被不可逆固定在所述多孔基质上。一些 情况中,至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、基本全部或者全部的可逆固定的蛋 白质是非聚集且未变性的。一些情况中,可逆固定的蛋白质是未标记的。一些情况中,可逆 固定的蛋白质是带标记的。
[0013] -些情况中,蛋白聚集改性剂选自下组:环糊精、非离子表面活性剂、离子型表面 活性剂、两性离子表面活性剂、非去污剂磺基甜菜碱、简单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集 改性蛋白、无序肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、冷冻保护剂和离液剂。
[0014]环糊精可选自下组:α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、(2, 3,6_三-0-甲 基)-β-环糊精、(2, 3, 6-二-〇-甲基)-β-环糊精、(2-羟基)丙基-β-环糊精、(2-轻 基)丙基-γ-环糊精、无规甲基-β-环糊精、无规甲基-γ-环糊精、羧甲基-β-环糊 精、羧甲基-γ-环糊精、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精、磺基丁基-β-环糊精、6-氨 基-6-脱氧-β-环糊精、乙酰β-环糊精、琥珀酰α-环糊精、琥珀酰β-环糊精、琥珀酰 γ-环糊精、(2, 3, 6-三-0-苯甲酰)-β-环糊精、琥珀酰-(2-羟丙基)-β-环糊精和琥珀 酰-(2-羟丙基)-γ-环糊精。
[0015] 离子型表面活性剂可以是十二烷基硫酸钠或辛基硫酸钠。非离子表面活性剂可选 自下组:聚山梨酯80、聚山梨酯20、Brij-35和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。非去污剂 磺基甜菜碱可选自下组:灿38 256、灿38 221、灿38 211、灿38 201、灿38 195、3-(4-叔丁 基-1-P比啶内鐵)_1_丙横酸盐、3-(1-P比啶内鐵)_1_丙横酸盐、3_(苯基二甲基钱)丙横 酸盐、和二甲基乙基铵丙磺酸盐。简单糖可选自:蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、赤 藓糖醇、葡萄糖、半乳糖、棉籽糖和海藻糖。聚糖可选自下组:右旋糖酐、淀粉和羟乙基淀粉。 多元醇可选自下组:甘油、乙二醇、聚乙二醇、季戊四醇丙氧基化物和季戊四醇丙氧基化物。 有机溶剂可选自下组:乙醇、丁醇、丙醇、二甲基甲酰胺、2-甲基-2, 4-戊二醇、2, 3-丁二醇、 1,2_丙二醇、1,6_己二醇和二甲亚砜。聚集改性蛋白可选自下组:白蛋白、酪蛋白、明胶、泛 素、溶菌酶和胚胎发生晚期丰富(LEA)蛋白。所述氨基酸可选自下组:甘氨酸、脯氨酸、牛磺 酸、精氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。氧化还原剂可选自下组:巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓 糖醇、三(2-羧基乙基)膦、谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物以及Cu2+。冻干保护剂、冷冻保护 剂或离液剂可选自下组:脲、硫脲、胍、钙、溴、碘、氯、钾、硫氰酸盐/酯、高氯酸盐/酯、氯酸 盐/酯、三甲胺N-氧化物和苯酚。
[0016] 在一些实施方式中,本发明提供保存蛋白质的方法,所述方法包括:提供多孔基质 和蛋白质聚集改性剂;在蛋白质聚集改性剂的存在下使多孔基质接触含有蛋白质的溶液; 使蛋白质可逆固定在多孔基质上,由此将可逆固定的蛋白质保存在多孔基质上。
[0017] -些情况中,至少50%的可逆固定的蛋白质是基本非聚集且基本未变性的。一些 情况中,有1、2、3、4或更多种不同的蛋白质可逆固定在多孔基质上。一些情况中,所述多孔 基质含有选自下组的成分:沃特曼纸(whatmanpaper)、纸、纤维素滤器、玻璃微纤维滤器、 硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、烧结玻璃、烧结聚合物、烧结金属、纺粘聚酯、人造丝、尼 龙、多孔聚合物整料、多孔聚合物珠、毛细管芯吸床、天然或合成海绵以及纤维玻璃。一些情 况中,所述毛细管芯吸床是薄膜色谱板。
[0018] -些情况中,所述多孔基质包括掩蔽区和可逆固定化区,其中所述方法包括将蛋 白质可逆固定在可逆固定化区。一些情况中,所述可逆固定的蛋白质被可逆固定覆盖所述 可逆固定化区的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或基本全部。一些 情况中,掩蔽区含有疏水聚合物。一些情况中,掩蔽区含有脂肪酸或蜡。一些情况中,所述 多孔基质还包含边界区。一些情况中,所述可逆固定的蛋白质均匀分布在所述基质至少一 个表面的至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或全部。
[0019] -些情况中,可逆固定包括在多孔基质于蛋白质聚集改性剂存在下接触含蛋白质 的溶液之后干燥所述多孔基质。一些情况中,所述干燥包括空气干燥、真空干燥、在烘箱中 于30、40、50、60或65°C干燥或者冷冻干燥。一些情况中,所述蛋白质聚集改性剂在干燥过 程中基本上保护可逆固定的蛋白质免于聚集和变性。一些情况中,被可逆固定的蛋白质在 多孔基质上保存至少约1周、1月或6月。一些情况中,可逆固定的蛋白质被保存在多孔基 质上持续不到约12小时、24小时、48小时或1周。
[0020] -些情况中,所述蛋白质是抗体。一些情况中,所述抗体被可逆固定在多孔基质上 且所述多孔基质上没有固定其它抗体。一些情况中,有2、3、4或更多种抗体被可逆固定在 多孔基质上。一些情况中,基本没有蛋白质被不可逆固定在多孔基质上。一些情况中,所述 蛋白质是未标记的。一些情况中,所述蛋白质是带标记的。
[0021] -些情况中,多孔基质构造成在接触洗脱剂时洗脱可逆固定的蛋白质。一些情况 中,多孔基质于蛋白聚集改性剂存在下与含蛋白质的溶液的接触包括:使含有蛋白质的溶 液接触含有蛋白聚集改性剂的多孔基质。一些情况中,多孔基质于蛋白聚集改性剂存在下 与含蛋白质的溶液的接触包括:使多孔基质接触含有蛋白质与蛋白聚集改性剂的溶液。
[0022] -些情况中,蛋白聚集改性剂选自下组:环糊精、非离子表面活性剂、离子型表面 活性剂、两性离子表面活性剂、非去污剂磺基甜菜碱、单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集改 性蛋白、无序肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、冷冻保护剂和离液剂。
[0023] 环糊精可选自下组:α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、(2, 3,6_三-0-甲 基)-β-环糊精、(2, 3, 6-二-〇-甲基)-β-环糊精、(2-羟基)丙基-β-环糊精、(2-轻 基)丙基-γ-环糊精、无规甲基-β-环糊精、无规甲基-γ-环糊精、羧甲基-β-环糊 精、羧甲基-γ-环糊精、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精、磺基丁基-β-环糊精、6-氨 基-6-脱氧-β-环糊精、乙酰β-环糊精、琥珀酰α-环糊精、琥珀酰β-环糊精、琥珀酰 γ-环糊精、(2, 3, 6-三-0-苯甲酰)-β-环糊精、琥珀酰-(2-羟丙基)-β-环糊精和琥珀 酰-(2-羟丙基)-γ-环糊精。
[0024] 离子型表面活性剂可以是十二烷基硫酸钠或辛基硫酸钠。非离子表面活性剂可选 自下组:聚山梨酯80、聚山梨酯20、Brij-35和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。非去污 剂磺基甜菜碱可选自下组:灿38 256、灿38 221、灿38 211、灿38201、灿38 195、3-(4-叔丁 基-1-P比啶内鐵)_1_丙横酸盐、3-(1-P比啶内鐵)_1_丙横酸盐、3_(苯基二甲基钱)丙横 酸盐和二甲基乙基铵丙磺酸盐。简单糖可选自:蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、赤藓 糖醇、葡萄糖、半乳糖、棉籽糖和海藻糖。多糖可选自下组:右旋糖酐、淀粉和羟乙基淀粉。 多元醇可选自下组:甘油、乙二醇、聚乙二醇、季戊四醇丙氧基化物和季戊四醇丙氧基化物。 有机溶剂可选自下组:乙醇、丁醇、丙醇、二甲基甲酰胺、2-甲基-2, 4-戊二醇、2, 3-丁二醇、 1,2_丙二醇、1,6_己二醇和二甲亚砜。聚集改性蛋白可选自下组:白蛋白、酪蛋白、明胶、泛 素、溶菌酶和胚胎发生晚期丰富(LEA)蛋白。所述氨基酸可选自下组:甘氨酸、脯氨酸、牛磺 酸、精氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。氧化还原剂可选自下组:巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓 糖醇、三(2-羧基乙基)膦、谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物以及Cu2+。冻干保护剂、冷冻保护 剂或离液剂可选自下组:脲、硫脲、胍、钙、溴、碘、氯、钾、硫氰酸盐/酯、高氯酸盐/酯、氯酸 盐/酯、三甲胺N-氧化物和苯酚。
[0025] 在一些实施方式中,本发明提供一种制品,其含有:多孔基质,可逆固定于基质表 面的蛋白质,以及蛋白聚集改性剂,其中所述制品是由任意上述方法制得。一些情况中, 可逆固定于基质表面上的蛋白质是干的。一些情况中,基质至少宽约5-15cm且至少长约 5_15cm〇
[0026] 在一些实施方式中,本发明提供含有任意上述制品以及洗脱缓冲液的试剂盒。一 些情况中,洗脱缓冲液含有蛋白聚集改性剂,其选自:环糊精、非离子表面活性剂、离子型表 面活性剂、两性离子表面活性剂、非去污剂磺基甜菜碱、单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集 改性蛋白、无序肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、冷冻保护剂和离液剂。一些情况 中,洗脱缓冲液含有蛋白质印迹转移缓冲剂。
[0027] 在一些实施方式中,本发明提供试剂盒含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个 任意上述制品的包装件。
[0028] 在一些实施方式中,本发明提供递送蛋白质的系统,其包括:任意上述制品;表面 上固定有第二种蛋白质的膜;转移缓冲剂;和适用于将基质上可逆固定的蛋白质通过扩 散、毛细管作用、真空、压力或电磁力转移至膜的装置。 附图简要说明
[0029] 图1 :通过用含抗体溶液润湿多孔基质,应用蛋白聚集改性剂环糊精来抑制抗体 聚集物形成。如图所述,该应用导致非聚集抗体的增强递送且更完全地从基质上卸除抗体。
[0030] 图2 :显示从多孔基质递送抗体至胶或膜。如灰线显示,胶或膜可含有固定化的靶 蛋
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