一种组装型、多条件平行培养微流控装置及其使用方法
【专利摘要】本发明提供一种组装型、多条件平行培养微流控装置，由微流控芯片及盖片构成；两部分可灵活组合，方便拆卸；所述微流控芯片包括细胞培养室阵列、进液池和废液池、微流通道；所述细胞培养室阵列、进液池和废液池通过微流通道相互贯通；所述盖片可拆卸地覆盖于细胞培养室阵列上方。本发明的微流控装置通用性强、操作方便，在干细胞治疗及肿瘤药物评价等领域，具有广泛的应用前景。
【专利说明】
一种组装型、多条件平行培养微流控装置及其使用方法
技术领域
[0001]本发明属于组织工程-细胞微环境研究领域，具体涉及一种组装型、多条件平行培养微流控装置。
【背景技术】
[0002]细胞对体内微环境中各种物理、化学因素的刺激非常敏感，并可受后者影响发生细胞命运的转变。因此，细胞微环境的研究越发被重视。对于大多数体内细胞而言，微环境因素包括:细胞异质性、细胞分区性、三维构型、细胞外基质蛋白、可溶性因子、血管和构成微环境的其它种类细胞。现阶段，用于构建仿生微环境的体外模型，有助于理解体内微环境因素对于细胞的影响，在药物筛选、疾病防控等多个生物医学领域，显示出较传统细胞模型及动物模型的巨大优势。现有方法包括:采用修饰以多价配体或多肽的生物活性聚合物(Conway A,et al.Multivalent ligands control stem cell behav1ur in vitro andin viv0.Nature nanotechnology.2013;8:831—8.Dai X,et al.Peptide modifiedpolymer poly(glycerol-dodecaned1ate co_fumarate)for efficient control ofmotor neuron differentiat1n.B1med Mater.2015; 10:065013.)，利用合成或生物来源的水凝胶(Hsieh FY，et al.3D b1printing of neural stem cell-ladenthermoresponsive b1degradable polyurethane hydrogel and potential in centralnervous system repair.B1materials.2015；71:48-57.Wang Y,et al.Combinat1n ofhyaluronic acid hydrogel scaffold and PLGA microspheres for supportingsurvival of neural stem cells.Pharmaceutical research.2011 ;28:1406-14.)，使用具有不同硬度或拓扑结构的微米、纳米三维基质(Li N, et al.Three-dimens1nalgraphene foam as a b1compatible and conductive scaffold for neural stemcells.Scientific reports.2013；3:1604.Leipzig ND,et al.The effect of substratestiffness on adult neural stem cell behav1r.B1materials.2009；30:6867-78.)等。然而，现存技术存在以下缺陷:引入了外源性的生物材料或生物因子，可能导致免疫排斥、低生物相容性和低生物可降解性;更为重要的是，由于缺少更加贴近真实生理微环境的精准时空控制及有效的生物学评价，细胞微环境体外仿生构建及其对细胞影响的研究仍受限。
[0003]上世纪90年代发展起来的微流控技术，亦称之为芯片实验室或者微全分析系统，被认为是本世纪最重要的科学技术之一，具有将常规化学和生物学等基本操作单元集成在一块芯片上的能力，有样品耗量小、集成度高和可实现高通量等特点，具有很强的技术先进性。借助该技术，可以可控构建具有时空分辨特征的细胞微环境，因此被广泛运用于细胞生物学和转化医学的研究中。其中，在细胞微环境研究中，利用微流控芯片技术，可以对异型细胞相互作用、细胞外三维基质、细胞动力学过程、血管形成、生化因子梯度、生物机械力刺激等微环境因素进行体外模拟与机制研究，对于加深对细胞和微环境之间相互作用的研究，及疾病的预防、诊断、治疗和预后都有着重要意义。
[0004]微流控系统在细胞微环境研究中的特征优势，如流体精确操控、样本低消耗、高通量筛选、单细胞操控、实时分析及高度集成，为细胞微环境的体外仿生构建和研究，提供了新型、有效的方式。首先，基于微流控技术时空分辨的特性，可以构建更加贴近生理环境的仿生结构，真实地模拟三维细胞微环境，构建微尺度结构下的体外模型；其次，微流控芯片具有灵活可控的微通道结构和实现流体精确操控等特点，提供可控的生物化学条件和生物物理条件刺激，模拟微环境中特异性流体力学性质并对相关细胞的功能进行评价;最后，芯片上能进行全面的实时监测，实现多种细胞行为的实时追踪，可以更好地观察分析细胞行为，实现对细胞的实时观测及定量化分析。然而，现有基于微流控构建的细胞微环境工作，大多集中于单因素研究、或者在芯片内部微通道构建二维细胞模型，尚未充分体现出芯片的本质优势，缺少针对特定微环境对细胞命运决定的综合性研究和高通量的最优培养条件筛选。同时，高度集成化、便于操作的微流控芯片需要提供给生物学家或者临床医生，增强其实用性及临床转化率，尽快解决生物学或医学领域的实际问题。
【发明内容】
[0005]为解决上述技术问题，本发明设计一种组装型、多条件平行培养微流控装置，其通过灵活组装、拆卸由微流通道及细胞培养室阵列组成的微流控芯片，及刚性玻璃盖片，同时进行多条件下的细胞平行培养。本发明能够实现在组织工程-细胞微环境构建及研究领域的应用，其所采用的技术方案是:
[0006]本发明包括两部分部件，整个微流控装置由微流控芯片及盖片构成;所述微流控芯片包括细胞培养室阵列、进液池和废液池、微流通道;所述细胞培养室阵列、进液池和废液池均为敞口池;所述微流通道封闭于微流控芯片内部;所述细胞培养室阵列、进液池和废液池通过微流通道相互贯通;所述盖片可拆卸地覆盖于细胞培养室阵列上方。
[0007]上述技术方案中，所述细胞培养室阵列的排布方式不限于实施例提供的形式，可以根据实验条件，实验目的等因素，设计其排布方式，满足同时进行多条件下的细胞平行培养需求。例如，所述细胞培养室阵列的每个培养室直径5mm、高度2_、间隔4mm，可实现与商业化多道移液枪联用，提高实验精准性、简化实验操作过程。
[0008]上述技术方案中，所述微流通道用于细胞的培养液输送，满足同时进行多条件下的细胞平行培养功能，例如:包括二维单层细胞培养、基质胶中的分散细胞培养、三维细胞球培养及基质胶中的三维细胞球培养，并可同时引入静态培养及灌流培养方式。多条件培养的细胞种类可为神经干细胞，亦可为恶性胶质瘤细胞；基质胶可为内源性胶原或者Matrigel ο
[0009]上述技术方案中，所述盖片能够同时满足下述条件即可:①完全覆盖住细胞培养室阵列；②能够与所述微流控芯片紧密贴合，并可根据具体要求随时拆卸，便于样品的收集，从而实现灵活组合;③可根据培养条件的不同而灵活选择盖片的尺寸、数量。
[0010]优选的情况下，所述盖片为刚性玻璃片、或刚性塑料片、刚性金属片;所述盖片上标记有能够与细胞培养室阵列相对应的位置标记。
[0011]最优选情况下，本发明实施例所述微流控芯片采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质，盖片采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂层，通过PDMS之间的表面张力作用实现两部分的可逆性封接;将微流控芯片的培养室阵列半封闭，实现装置的组装。也可根据具体要求随时拆卸，便于样品的收集。实施例使用旋涂有聚二甲基硅氧烷(PDMS)的刚性玻璃片，与装置微流控芯片中培养室阵列配套使用，起到半封闭后者的作用。
[0012]同时，本发明实施例还提供了实现所述盖片和微流控芯片紧密贴合的另外一种方式，即辅以施加外界压力，例如夹子(不锈钢弹簧夹)压紧的形式，增强闭合效果，防止漏液；实现装置的组装。
[0013]所述盖片用于承载细胞，而微流控芯片中设置的细胞培养室仅用于承载细胞培养液等，因此微流控芯片未接触细胞样本，可反复使用，有效降低经济成本。
[0014]所述组装型、多条件平行培养微流控装置的使用方法，其包括如下操作步骤:
[0015]1.在盖片PDMS涂层面接种待培养细胞，所述细胞的接种位置及排列方式与细胞培养室阵列相对应；
[0016]2.将接种了待培养细胞的盖片与细胞培养室阵列相对，紧密贴合；
[0017]3.向进液池加入细胞的培养液，所述细胞的培养液沿微流通道输送至各个细胞培养室阵列，通过浸满或灌流细胞培养液对细胞进行培养，并最终通过废液池排放细胞培养液；
[0018]4.培养结束后，自微流控芯片及盖片封合面的一角逐渐开启，直至这两部分完全分离，取出其中细胞样品进行后续分析。
[0019]本发明的有益效果:
[0020]I)本发明的微流控装置由具有微流通道及细胞培养室阵列组成的微流控芯片，及刚性玻璃盖片构成，该两部分可灵活组合、方便拆卸，并可实现反复使用，有效改进传统微流控装置样品回收困难、培养条件单一、重复利用率低等缺陷。
[0021]2)本发明的组装型、多条件平行培养微流控装置，可提供一种可靠、通用性强、操作方便的模型用于体外多种细胞微环境的同时构建与功效比较，用于研究细胞微环境在细胞命运中的决定作用，以高通量形式平行筛选利于细胞某种命运转向的最优培养条件。
[0022]3)本发明在构建细胞微环境过程中，未引入外源性的生物材料、生化因子或基因修饰，更加贴近体内真实微环境，避免免疫排斥和致瘤性，具有更高的生物相容性和安全性。
[0023]4)经本装置特定培养实现定向转化的细胞，可为临床需求提供特殊的细胞产品，并可实现进一步的商品化;尤其是，对临床患者的细胞，经体外培养处理后，可实现自体回输，避免了患者的免疫排斥，杜绝因为异体输入造成的疾病感染。
[0024]5)本发明可广泛用于干细胞分化、肿瘤药物评价等应用体系。
【附图说明】
[0025]图1用于神经干细胞自我更新及分化研究的装置示意图；
[0026]其中:I为具有PDMS膜的刚性玻璃片，2为微流控芯片；11为神经干细胞贴壁培养组对应的玻璃片培养单元，12为神经干细胞单细胞包胶培养组对应的玻璃片培养单元，13为神经干细胞单细胞包胶培养组对应的微流控芯片培养单元，14为神经干细胞贴壁培养组对应的微流控芯片培养单元，15为神经干细胞球包胶培养组对应的微流控芯片培养单元，16为神经干细胞球培养组对应的微流控芯片培养单元，17为神经干细胞球培养组对应的玻璃片培养单元，18为神经干细胞球包胶培养组对应的玻璃片培养单元;21为细胞培养室阵列，22为进液池，23为废液池，24为微流通道；
[0027]图2不同培养条件下，神经干细胞的自我更新能力免疫荧光表征，蛋白标记物为Nestin;
[0028]图3不同培养条件下，神经干细胞的自我更新能力定量表征，以Nestin阳性表达细胞百分比计；
[0029]图4不同培养条件下，神经干细胞的神经元向分化能力免疫荧光表征，蛋白标记物为β-tubulin III ；
[0030]图5不同培养条件下，神经干细胞的自我更新能力定量表征，以β-tubulinIII阳性表达细胞百分比计。
【具体实施方式】
[0031]以下通过具体实施例对本发明加以详细说明，借以阐述本装置的工作原理及工作方式，但并不因此而限制本发明。
[0032]实施例1
[0033]利用一种组装型、多条件平行培养微流控装置，进行神经干细胞自我更新及分化研究。
[0034]I微流控芯片的设计与制作
[0035]I)用于神经干细胞自我更新及分化研究的装置示意图如图1所示。整个装置是由微流控芯片2，及两片涂覆有TOMS膜的刚性玻璃片I构成。微流控芯片2包括结构单元:细胞培养室阵列21 (4 X 4阵列)、进液池22、废液池23、微流通道24。四个阵列的细胞培养室共用一个废液池23。两片涂覆有PDMS膜的刚性玻璃片I，用于不同培养条件的细胞接种和对细胞培养室阵列21的封合。
[0036]2)应用负性光刻胶SU-8，按照标准的软光刻技术制备阳膜模具，并以此阳模反转出PDMS阴模。在该PDMS阴模相应位置按细胞培养室阵列21 (4 X 4阵列，每个培养室直径5mm、高度2mm、间隔4mm)、进液池22、废液池23进行打孔，打孔位置形成贯通阴模的通孔结构。用一块洁净的玻璃片，与PDMS阴模含通道的一面不可逆键合，将阴模所有的通道及孔洞的底面封合，形成微流控芯片2。该微流控芯片2经过高压灭菌，使整体亲水性提高，便于液体流通，并完成消毒过程。
[0037]2神经干细胞原代提取和培养
[0038]I)神经干细胞原代提取自孕13-14天的SD SPF大鼠，断颈处死，腹部剃毛，酒精消毒。取出胎鼠，置于盛有PBS和青霉素、链霉素的培养皿中清洗，剥离胎膜，剪断脐带，将胎鼠移到另一个培养皿中，颈部断头，取出胎鼠脑部，剥离脑膜及血管，取前脑皮质部位，置于提前预冷的DMEM/F12中。剪刀剪碎脑组织。将DMEM/F12与组织混合液移至离心管中，玻璃管轻柔吹打，静置，取上清液体移至另一个离心管中离心，弃上清，将细胞沉淀与Accutase?细胞分离液混合，移至新培养皿中，放入培养箱孵育。取出培养皿，轻柔吹打，加入DMEM/F12终止消化，细胞混合液移至离心管中离心。弃上清，加入神经干细胞培养基，细胞计数，将细胞密度调至2 XlO5ceIVml，种于培养瓶。放入培养箱培养。每2天半定量加入神经干细胞培养基，观察神经干细胞成球大小。
[0039]2)当神经干细胞细胞球直径为150μπι-200μπι时，可传代。将细胞悬液移至离心管中离心。弃上清，将细胞沉淀与Accutase?细胞分离液混合，移至新培养皿中，放入培养箱孵育后，轻柔吹打，加入DMEM/F12终止消化，细胞混合液移至离心管中离心。弃上清，加入神经干细胞培养基，细胞计数，将细胞密度调至2 X 15Cel Ι/ml，种于培养瓶，放入培养箱培养。
[0040] 3神经干细胞的接种及与微流控芯片的结合
[0041 ] I)设置四组不同的神经干细胞培养条件:神经干细胞贴壁培养组、神经干细胞球培养组、神经干细胞单细胞包胶培养组和神经干细胞球包胶培养组。细胞接种均采用第三代神经干细胞，将神经球用Accutase?分离成单细胞悬液，接种密度为I X 16ceIΙ/ml。四组不同条件的神经干细胞培养的接种过程共需要三天。
[0042]2)第一天，两片涂覆有PDMS膜的刚性玻璃片I经紫外线照射消毒lh。神经干细胞单细胞悬液滴于其中一片的上表面，滴落位置如图1所示的16、15，与微流控芯片其中两个竖列的细胞培养室17、18对齐，共两列。由于涂覆有I3DMS膜的刚性玻璃片的表面疏水性，在其表面形成了两列液滴阵列。用胶布将玻璃片粘于培养皿盖，培养皿盖小心地倒转，扣于含有PBS的培养皿底，放于培养箱，神经干细胞经沉淀、聚集，形成细胞球。同时，多聚鸟氨酸(PO)滴于另一张涂覆有PDMS膜的刚性玻璃片位置11，滴加位置与微流控芯片其中I个竖列的细胞培养室14对齐，置于室温，包被过夜。
[0043]3)第二天，用层粘连蛋白(LN)替换PO，放入培养箱孵育。PBS清洗后将单细胞悬液滴于LN包被过的位置，放于培养箱过夜，作为神经干细胞贴壁培养组。
[0044]4)第三天，神经干细胞贴壁培养组和神经干细胞球培养组的准备工作已经完成。采用胶原水凝胶作为神经干细胞细胞外基质(ECM)培养介质，用PBS和蒸馏水稀释胶原原液，氢氧化钠调节PH值。神经干细胞单细胞包胶培养组中:将单细胞用胶原稀释液重悬，滴加于涂覆有PDMS膜的刚性玻璃片位置12，与微流控芯片2其中另一竖列的细胞培养室13对齐。对于神经干细胞球包胶培养组:于位置18吸去神经球周围培养基，将胶原滴于神经球上。包含有散细胞和细胞球的胶原体系经培养箱37°C环境，发生交联反应，形成神经干细胞的胞外基质环境。
[0045]5)含4X4阵列(11、12、17、18)的两片PDMS刚性玻璃片I，含细胞面朝下，分别与微流控芯片2的四个竖列的细胞培养室阵列(14、13、16、15)对齐，盖于微流控芯片2上，在PDMS-PDMS表面张力作用下，三部分组装在一起，成为一个半密闭的微流控芯片细胞培养体系，将封合的两部分用不锈钢弹簧夹夹紧，增强闭合效果，防止漏液。仅留进液池22和废液池23为敞开孔，用于液体的引入和外排。
[0046]4微流控装置中神经干细胞的灌流培养和静态培养
[0047]I)静态培养:使用移液枪将培养基从进液池22加入，排空芯片中的气泡，使液体充满通道及细胞培养室，浸没4 X 4阵列所有神经干细胞样品。将芯片部分放入培养箱，每日更换培养基。
[0048]2)灌流培养:芯片内的液体灌注步骤同静态培养;采用无菌连接管连接芯片的进液池22与装有培养基的微量注射器，该注射器由注射栗控制培养基灌流速度。将芯片部分放入培养箱。
[0049]5免疫荧光染色鉴定神经干细胞自我更新及分化能力
[0050]在静态或灌流培养结束后，将弹簧夹取下，自微流控芯片2及刚性玻璃片I封合面的一角逐渐开启，直至这两部分完全分离，回收刚性玻璃片I上不同培养条件下的细胞样品。多聚甲醛固定，PBS清洗后加入Triton-100，PBS清洗后加入BSA封闭。分别加入Nestin、β-tubulin III一抗过夜。吸弃抗体稀释液，PBS清洗后加入二抗稀释液，避光孵育。吸弃二抗稀释液，PBS清洗后加入核染料Hoechst避光孵育。吸弃核染料，PBS清洗后共聚焦荧光显微镜下观察。每个样本扫描30个层面，取其中5个层面等间隔的扫描图片，统计阳性表达细胞数及细胞总数，计算阳性表达细胞所占比重。神经干细胞的自我更新能力免疫荧光及定量表征如图2及图3所示;神经干细胞的神经元向分化能力免疫荧光及定量表征如图4及图5所示。
[0051]通过本微流控装置的使用，成功构建了一种将三维培养、因子干预和生物力学刺激高度集成的一体化体系，能够同时评估多种培养条件对神经干细胞自我更新、增殖和分化等细胞学命运的影响，更精准地模拟体内的物理、化学和生理信号。相比于现有研究技术，本发明提供了一种微环境对细胞命运导向研究的高通量有效筛选平台，其对比优势体现在:未引入可能导致免疫排斥的外源性的生物材料或生物因子，从而提高了体系生物相容性;培养模式由单一局限扩展为多条件平行培养、集成化程度高、操作简易方便;更为重要的是，由于构建了更加贴近真实生理微环境的精准时空控制及有效的生物学评价，更有利于细胞微环境体外仿生构建及其对细胞影响的研究。
【主权项】
1.一种组装型、多条件平行培养微流控装置;其特征在于:所述装置由微流控芯片及盖片构成;所述微流控芯片包括细胞培养室阵列、进液池和废液池、微流通道;所述细胞培养室阵列、进液池和废液池均为敞口池;所述微流通道封闭于微流控芯片内部;所述细胞培养室阵列、进液池和废液池通过微流通道相互贯通;所述盖片可拆卸地覆盖于细胞培养室阵列上方。2.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于:所述微流控芯片材质为聚二甲基硅氧烧。3.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于:所述盖片为刚性玻璃片、刚性塑料片或刚性金属片。4.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于:所述盖片上标记有与细胞培养室阵列相对应的位置标记。5.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于:所述盖片采用聚二甲基硅氧烷涂层。6.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于:所述细胞培养室阵列的培养室直径5mm、高度2mm ；培养室间隔4mm。7.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于:还包括将所述盖片和微流控芯片压紧的夹子。8.如权利要求1所述的组装型、多条件平行培养微流控装置的使用方法，其特征在于，包括如下操作步骤: ①在盖片PDMS涂层面接种待培养细胞，所述细胞的接种位置及排列方式与细胞培养室阵列相对应； ②将接种了待培养细胞的盖片与细胞培养室阵列相对，紧密贴合； ③向进液池加入细胞的培养液，所述细胞的培养液沿微流通道输送至各个细胞培养室阵列，通过浸满或灌流细胞培养液对细胞进行培养，并最终通过废液池排放细胞培养液； ④培养结束后，自微流控芯片及盖片封合面的一角逐渐开启，直至这两部分完全分离，取出其中细胞样品进行后续分析。
【文档编号】C12M3/00GK105907641SQ201610340852
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】刘晶, 马静云, 王亚辰, 李娜
【申请人】大连医科大学附属第医院, 大连医科大学附属第一医院