白。
[0031 ] 图3 :说明甲基-β-环糊精（MB⑶）对将抗体移出Whatman?层析纸的转移效率 的影响。
[0032] 图4 :显示抗体至膜空间受控递送的方法。
[0033] 图5 :显示应用蜡屏障来以空间受控方式递送多种抗体至膜。 发明详述 I.定义
[0034] 本文所用术语"可逆固定"指生物分子（例如，蛋白质）被固定在基质（例如，多 孔基质）上使其可从所述基质上洗脱。可逆固定的生物分子可以固定成使其能被洗脱而无 活性损失（例如，结合或酶促活性），或基本无活性损失（例如，保留可逆固定前其结合或酶 促活性的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、全部或基本全部）。例 如，可逆固定的生物分子可被固定使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、 99%、全部或基本全部的所述生物分子可以非聚集且未变性的形式从基质洗脱。
[0035] 术语"氨基酸"指天然产生的氨基酸和合成的氨基酸，以及以功能类似于天然产生 的氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基 酸，以及此后修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和〇-磷酸丝氨酸。氨基酸类似 物指基本化学结构与天然产生的氨基酸相同的化合物，即α碳结合氢、羧基、氨基和R基， 如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物可具有修饰的R基（如 正亮氨酸）或修饰的肽主链，但基本化学结构保持与天然产生的氨基酸相同。氨基酸模拟 物指如下化合物：其结构不同于氨基酸的普通化学结构，但功能类似于天然产生氨基酸。
[0036] 本文中氨基酸可按IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的俗称三字母符号或单 字母符号表述。
[0037] 术语"蛋白质印迹（westernblot) "不仅包括标准的蛋白质印迹，还包括各种变 形，例如Far-Western印迹、Northwestern印迹和Southwestern印迹。通常，蛋白质印迹包 括将蛋白质转移至膜，并后续检测膜上的蛋白质。本领域已知有多种膜适合用作蛋白质印 迹膜，包括但不限于：聚偏二氟乙烯（PVDF)膜，硝酸纤维素膜、聚酰胺膜、聚酯膜和尼龙膜。 蛋白质印迹通常用到转移缓冲剂。本领域已知多种蛋白质印迹转移缓冲剂。通常，蛋白质 印迹转移缓冲剂的pH高于待转移蛋白质的等电点。因此，在施加电压电势时，蛋白质会向 正极电极迀移。或者，转移缓冲剂的pH可低于待转移蛋白质的等电点。此类情况中，蛋白 质会向负极电极迀移。
[0038] 本文所用"抗体"指如下蛋白：其功能上定义为结合蛋白并且结构上定义所含氨基 酸序列被本领域技术人员识别为衍生自产抗体动物的免疫球蛋白编码基因的框架区。抗体 可由一条或多条多肽组成，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段来 编码。公认的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免 疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们进而分 别定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
[0039] 已知典型的免疫球蛋白（抗体）的结构单位包含四聚体。各四聚体由相同的两对 多肽链组成，各对有一条"轻链"（约25kD)和一条"重链"（约50-70kD)。每条链的N末端 确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语 轻链可变区（\)和重链可变区（VH)分别指这些轻链和重链。
[0040] 本文使用的术语"抗体"还包含保留结合特异性的抗体片段。例如，有许多充分鉴 定的抗体片段。因此，例如胃蛋白酶消化抗体C末端至铰链区中的二硫连接，产生F(ab'）2， Fab的二聚体，其本身是由二硫键与VH_CH1连接的轻链。可在温和条件下还原F(ab'）2以 打断铰链区中的二硫连接，从而将F(ab'）2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体实质上是 具有部分铰链区的Fab(对其它抗体片段的更详细描述参见，《基础免疫学》（Fundermental Immunology)，W.E.Paul编，雷文出版社（RavenPress)，Ν·Υ· (1993))。虽然根据完整抗体 的消化来定义了不同的抗体片段，但是本领域技术人员应理解，也能通过利用重组DNA方 法或用化学方法从头合成片段。因此，本文中所用术语"抗体"包括通过全抗体修饰产生或 用重组DNA方法合成的抗体片段。
[0041] 本文所用抗体包括各种％_\结对形式，包括单链抗体（以一条多肽链形式存在的 抗体），例如其中重链可变区和轻链可变区连接在一起（直接连接或通过肽接头连接）以 形成连续多肽的单链Fv抗体（sFv或scFv)。所述单链Fv抗体是共价连接的νΗ-νρ其可 由包括VH编码序列和VJI码序列（直接连接或通过肽编码接头连接）的核酸表达（例如， Huston等·Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85:5879-5883,1988)。虽然VH和VL彼此连接成单条 多肽链，但VH和Vj吉构域是非共价结合的。抗体还可以是另一片段形式，例如二硫键稳定 化的Fv(dsFv)。例如，使用重组技术也能够产生其他片段，作为可溶蛋白或作为从展示方法 得到的片段。抗体还可包括双抗体（diantibody)和微型抗体（miniantibody)。
[0042] 本发明的抗体还包括重链二聚体，例如来自驼科或鲨鱼的抗体。由于驼科动物或 鲨鱼中重链二聚体IgG的VH区不必与轻链发生疏水性相互作用，通常与轻链接触的重链 区域转变为亲水性氨基酸残基。重链二聚体IgG的VH结构域被称为VHH(驼科动物）或 VNAR(鲨鱼）结构域。本发明中使用的抗体还包括单结构域抗体（dAb)和纳米抗体（参见 例如Cortez-Retamozo等，CancerRes.64:2853-2857, 2004) 〇 II.引目
[0043] 蛋白质可用不同方式保存和递送。例如，蛋白质可保存在溶液中，保存为冻干固体 或固定在基质上。无论如何，都需要应用能保护蛋白质稳定性的保存和递送条件。例如，蛋 白质通常以降低蛋白质变性和聚集的方式来保存。蛋白质变性或聚集可由多种现象引发， 包括：热、冷、离子强度、pH、变性剂的存在以及接触疏水界面。最为疏水的一种界面是气水 界面。因此，通常需要通过尽可能减少与气水界面的接触来降低保存和递送期间的蛋白质 聚集。
[0044] 在蛋白质保存和递送期间，蛋白质在很多时刻可能遭遇气水界面。例如，可能由于 在蛋白质的混合或移液过程中接触气水界面而引发蛋白质聚集。类似地，单单作为蛋白质 溶液处于容器中就可能由于接触气水界面而引发蛋白质聚集。尤其，蛋白质会接触固体表 面基质的保存机理会引入很大的气水界面。例如，接触基质的溶液中的蛋白质所经受的气 水界面对体积之比会不断增大，随着蛋白质所溶入其中的液体体积随着干燥步骤而减少。
[0045] 类似地，干燥在基质上的蛋白质会在后续再润湿步骤（例如，在递送所保存的蛋 白质之前或之后）中发生聚集。例如，当基质接触润湿溶液（例如，洗脱剂），会有很大的气 水界面。如上文解释的，蛋白质与气水界面之间的接触会导致蛋白质变性和/或聚集。多 孔基质尤为加剧这一气水界面问题，因为该基质的间隙空间产生很大的气水界面
[0046] 发明人发现，基质（例如，多孔基质）上蛋白质的聚集能出乎意料地被蛋白聚集改 性剂的存在而减少或消除。不希望受限于理论，据信蛋白聚集改性剂起到从气水界面置换 蛋白质的作用，由此保护蛋白质免于变性和聚集，这些蛋白聚集改性剂在减少多孔基质上 所固定蛋白质的聚集中尤为有效。
[0047]因此，本文记载了在多孔基质之上或其内保存蛋白质和在减少或消除聚集或变性 的条件下递送这些蛋白质的方法和组合物。前述条件包括应用一种或多种本文所述的蛋白 聚集改性剂。本文还提供如下组合物：其含有保存于多孔基质上的蛋白质，使得所述蛋白质 由于存在蛋白聚集改性剂而得到保护免于聚集或变性。本文还记载了含有多种组合物的试 剂盒，所述组合物含有保存于多孔基质上的蛋白质。例如，此类组合物和试剂盒可用来将蛋 白质递送至膜、容器或其它试验平台供后续分析。说明书还记载用于在蛋白聚集改性剂的 存在下将蛋白质保存于多孔基质上的试剂盒。 III.组合物
[0048] 本文记载了含有多孔基质、蛋白质和蛋白聚集改性剂的组合物，用于蛋白质的保 存或递送。 A.蛋白质
[0049] 待保存或递送的蛋白质可以是任意蛋白质。例如，蛋白质可以是抗体，粘合素 (affimer)，脂质运载蛋白（如抗运载蛋白），硫氧还蛋白A，胆汁三烯结合蛋白或含有锚蛋 白重复、葡萄球菌蛋白A的Z结构域或纤连蛋白III型结构域的蛋白。蛋白质还可以是酶、 报道蛋白、激素、毒素、细胞因子或检测试剂。如本文所述，蛋白质可以是带标记或未标记 的。蛋白质可纯化自生物来源或合成得到。例如，蛋白质可产生于细胞内，例如，外源表达 于细胞内并由此纯化得到。一些情况中，所述蛋白质是重组蛋白。
[0050] 在一些实施方式中，蛋白质可以是含有至少10-15个氨基酸的多肽。这样的多肽 可纯化自生物来源或由合成方法产生。或者，所述蛋白质可以是更长的多肽，例如至少15、 20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100个氨基酸。例如，所述多肽的长度可以在15-20、 20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、80-90或90-100个氨基酸之间。在一些实施方式中，蛋 白质长度可以是至少 100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、 2000、2500、3000、5000个氨基酸或更长。
[0051] 在一些实施方式中，蛋白质可以是蛋白片段。例如，蛋白质可由较大蛋白质的一个 或多个结构域组成。一些情况中，蛋白质可由含有所需活性的片段组成。例如，蛋白质可由 含有结合或酶促活性的片段组成。 标记（label)
[0052] 可通过检测连接至蛋白质的标记来检测本文所述的蛋白质。标记可直接连接至蛋 白质（例如通过共价键）或可以间接连接（例如使用螯合剂或接头分子）。术语"标记"和 "可检测标记"在本文中同义使用。在一些实施方式中，各蛋白质标记（如连接至第一蛋白 质的第一标记、连接至第二蛋白质的第二标记等）生成可检测信号且这些信号（例如第一 标记生成的第一信号、第二标记生成的第二信号等）是可区分的。在一些实施方式中，两种 或更多种蛋白质标记包含相同类型的试剂（例如第一标记为第一荧光剂和第二标记为第 二荧光剂）。在一些实施方式中，两个或更多蛋白质标记（如第一标记、第二标记等）联合 生成可检测信号，该可检测信号在所述多个标记缺失其一或其中多个时并不生成。
[0053] 可检测标记的示例包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记、核酸（例如寡核苷 酸）标记、化学反应性标记、焚光标记、酶标记、放射性标记、量子点、聚合物点、质量标记及 其组合。在一些实施方式中，标记可包括光学试剂，如生色团、焚光剂、磷光剂、化学发光剂 等。多种试剂（如染料、探针或指示剂）是本领域已知的并可用于本发明。（参见例如英 杰公司(Invitrogen),TheHandbook-AGuidetoFluorescentProbesandLabeling Technologies^《手册一一荧光探针和标记技术指导》），第10版（2005))。生色团包括具 有可测吸光的辅酶和辅因子。一些情况中，可通过检测肽键在220或280nm的固有吸光来 检测蛋白质。
[0054] 荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧 光剂可包括但不限于：花青、酞菁、扑啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基咕吨、吩噻嗪、吩硒 嗪、荧光素（例如FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素）、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶 酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、叮啶酮、菲啶、若丹明（例如TAMRA、TMR和若丹明红）、 吖啶、蒽醌、硫族啦喃鐵（cha1cogenopyry1ium)类似物、氯、萘菁、次甲基染料、方菁染料、 偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、剛噪、苯并Π引哚、剛噪羰花青、苯并吲 哚羰花青、B0DIPY?和B0DIPY?衍生物，及其类似物。在一些实施方式中，荧光剂是Alexa Fluor染料。在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂 包括可购自英杰/分子探针公司（Invitrogen/MolecularProbes)(俄勒冈州尤金市）和 皮尔斯生物技术公司（PierceBiotechnology,Inc.)(伊利诺斯州洛克福德）的那些。在 一些实施方式中，该光学试剂是插入染料。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种蛋白质各 自标记有光学试剂如焚光剂（例如第一蛋白质标记有第一焚光标记，第二蛋白质标记有第 二荧光标记等），且通过检测该光学试剂生成的信号（例如荧光标记生成的荧光信号）来检 测标记有光学试剂的各蛋白质。在一些实施方式中，所有蛋白质都标记有光学试剂，且带有 光学试剂标记的各蛋白质都通过检测该光学试剂生成的信号来测得。
[0055] 在一些实施方式中，该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素，其 发射γ射线、正电子、β和α粒子和X射线。合适的放射性核素包括但不限于：225Ac、72AS、 211At,nB,128Ba,212Bi,75Br,77Br,14C,109Cd,62Cu,64Cu,67Cu,18F,67Ga,68Ga,3H,166Ho,123I,124I,125I, 13°I、1311、111In、177Lu、13N、150、32P、33P、212Pb、103Pd、1S6Re、18%e、47Sc、153Sm、S9Sr、99mTc^ ^ 一些实施方式中，2、3、4、5或更多种蛋白质各自标记有放射性同位素（例如第一蛋白质标 记有第一放射性同位素标记，第二蛋白质标记有第二放射性同位素标记等），且标记有放射 性同位素的各蛋白质通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。例如，一种蛋白质可 标记有γ发射子，而一种蛋白质可标记有β发射子。或者，蛋白质可标记有以可辨识性不 同能级发射同一粒子（例如，α、β或γ)的放射性核素。在一些实施方式中，所有蛋白质 都标记有放射性同位素，且各带标记蛋白质可通过检测该放射性同位素生成的放射性来测 得。
[0056] 在一些实施方式中，标记是酶，并通过检测该酶生成的产物来检测蛋白质。合适 的酶的示例包括但不限于：脲酶、碱性磷酸酶、（辣根）过氧化氢酶（HRP)、葡萄糖氧化酶、 β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如，辣根过氧化物酶 检测系统可与生色底物四甲基联苯胺（ΤΜΒ)联用，其在过氧化氢