专利名称：仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法
技术领域：
本发明属复合纳米纤维的制备领域，特别是涉及一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚 糖复合纳米纤维的制备方法。
背景技术：
组织工程与再生医学的发展为重建或修复人类病损组织与器官提供了有效的治疗手 段。可降解支架为细胞生长和组织再生提供必要的空间与支撑，为信号传导提供有效渠道， 是决定组织工程成败的关键因素之一。
丝素蛋白是山蚕脱胶而来，是一种天然的蛋白质，具有良好的生物相容性、生物可降 解性、良好的透气、透湿性、无免疫原性等优异的性能。被广泛应用于皮肤、骨、软骨、 肌腱、神经导管、血管等组织的修复和再生。Park等[l]以甲酸为溶剂静电纺制备的丝素 蛋白纳米纤维膜能促进老鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)粘附、增殖、分化，能诱导骨钙素的 产生，促进骨组织修复和再生，中国专利CN1844509A公丌了 "一种丝素蛋白多孔材料的制 备方法"，是以水为溶剂静电纺制备了生物相容性好、孔隙高的纳米纤维，但是单一的丝 素蛋白纳米纤维质脆、柔韧性差，降低了其实用价值，并且作为组织工程支架材料，最佳 的设计应该是从结构、组成上仿生细胞外基质。天然细胞外基质是由纳米纤维网络结构的 蛋白质和多糖组成[2],添加单一的天然成分不能在组成上完全模拟细胞外基质的成分， 因而不能实现功能仿生。
壳聚糖是世界上继纤维素之后的第二大天然多糖，具有良好的生物相容性、生物降解 性，并具有良好的抗菌性、抗血栓性和无免疫原性。壳聚糖及其衍生物、与其它聚合物的 共混物制备的海绵状多孔支架、可注射性水凝胶和微球支架和纤维支架，已经被作为多种 不同的组织，包括骨、肝脏、神经组织、血管、软骨组织和皮肤等组织工程领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤 维的制备方法，本发明的丝素蛋白/壳聚糖复合纤维的力学性能和降解行为优良，尤其是 柔韧性得到了很大的提高；该复合纤维能够很好的模拟人体细胞外基质的组成和结构，为 细胞生长和组织再生提供最佳的仿生生理环境，是理想的组织工程支架；该制备方法简单 易行，原材料资源丰富，易实现工业化生产。
本发明的一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法，包括 (1)丝素蛋白的提取将去蛹蚕茧在IO(TC的质量百分比为0. 5%1%20):1水溶液中煮三次，每次30min，用蒸馏水充分洗净，于45t:烘干，将烘千后的蚕丝纤维以浴比]:10溶 解于三元溶剂，于7(TC恒温水解Lh，然后用蒸馏水透析72h，再放入一80。C预冻12h，然 后在-58'C冷冻干燥，得到疏松的多孔状固体丝素蛋白；
(2) 制备丝素蛋白溶液将上述丝素蛋白溶于六氟异丙醇，常温下搅拌至完全溶解， 得到浓度为4-10% (克/毫升)的丝素蛋白溶液；
(3) 制备壳聚糖溶液将壳聚糖溶于六氟异丙醇(HFIP)和三氟乙酸(TFA)的混合溶剂 中，搅拌至透明，得到浓度为4-8% (克/毫升)的壳聚糖溶液；
(4) 制备丝素蛋白和壳聚糖的混合溶液将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液按体积I;匕 0. 15-2.4:1混合，搅拌均匀，得到共混静电纺丝液；
(5) 将丝素蛋白和壳聚糖混合溶液进行静电纺丝，调整静电纺丝工艺参数，控制电
压为12-30千伏，电场距离为60-200毫米，纺丝速率为0.5-1.5毫升/小时，得到丝素蛋 白/壳聚糖复合纳米纤维。
所述歩骤(1)中的三元溶剂为CaCl" C2貼H和H力的混合液，其中CaCL、 C晶OH和 &0的摩尔比为1:2:8;
所述歩骤(3)中的六氟异丙醇HFIP和三氟乙酸TFA的混合溶剂，其中六氟异丙醇HFIP 和三氟乙酸TFA的体积比为9:1;
所述歩骤(4)中的丝素蛋白占溶质总质量分数的10%-80%,壳聚糖占溶质总质量分数 的20%-90%;
所述的溶质为丝素蛋白和壳聚糖；
所述的丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的直径随纺丝溶液浓度增大逐渐增大，随壳聚 糖含量的增加逐渐减小。
本发明的丝素蛋白/壳聚糖复合纤维可应用于生物医学领域组织工程的研究。 有益效果
(1) 本发明的丝素蛋白/壳聚糖复合纤维的力学性能和降解行为优良，尤其是柔韧性 得到了很大的提高；
(2) 该复合纤维能够很好的模拟人体细胞外基质的组成和结构，为细胞生长和组织 再生提供最佳的仿生生理环境，是理想的组织工程支架；
(3) 该制备方法简单易行，原材料资源丰富，易实现工业化生产。
图1为丝素蛋白/壳聚糖共混静电纺纳米纤维的扫描电镜照片；图2为丝素蛋白/壳聚糖共混静电纺纳米纤维膜照片。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一歩阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
实施例1
先将100克蚕茧加入到1升0. 5%^20),水溶液中，煮沸30min，重复处理三次，用蒸 馏水充分洗净，洗净后放入45。C的干燥箱中烘干，得到脱胶后的蚕丝纤维。以 CaCl2:C2H50H:H20=l:2:8的摩尔比配制三元溶剂，将蚕丝纤维以1:10的浴比，置于70。C的 水浴锅内恒温水解lh，得到完全溶解的棕黄色的蚕丝纤维水解溶液。水解液装入透析袋中， 用蒸馏水透析72h，将透析好的蚕丝纤维水解溶液放入一8(TC预冻12h，然后在-58。C冷冻 千燥至干，得到白色，无味，疏松的多孔状固体丝素蛋白。
实施例2
将1.0克丝素蛋白溶于IO毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为10%(克 /毫升)的丝素蛋白溶液；将0.6克壳聚糖溶于10毫升以体积比90: 10混合的六氟异丙 醇和三氟乙酸混合溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为6% (克/毫升)的壳聚糖溶液；将 两种溶液以体积比12:5，溶质的质量比4:1混合，将混合溶液进行静电纺丝，纺丝条件 电压，20千伏；电场距离，130毫米；纺丝速率，80毫升/小时，得到平均纤维直径为305 纳米的复合纳米纤维膜。
实施例3
称取按照实施例1中制备的丝素蛋白1.0克，溶于10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完 全溶解，得到浓度为10% (克/毫升)的丝素蛋白溶液；将0.6克壳聚糖溶于IO毫升以体 积比90: 10混合的六氟异丙醇和三氟乙酸混合溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为6% (克/毫升)的壳聚糖溶液；将两种溶液以体积比3: 5,溶质的质量比l:l混合，将混合溶 液进行静电纺丝，纺丝条件电压，20千伏；电场距离，130毫米；纺丝速率，80毫升/ 小时，得到平均纤维直径为202纳米的复合纳米纤维膜。
实施例4
称取按照实施例1中制备的丝素蛋白1.0克，溶于IO毫升六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为10% (克/毫升)的丝素蛋白溶液；将0. 6克壳聚糖溶于10毫升以体 积比90: 10混合的六氟异丙醇和三氟乙酸混合溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为6% (克/毫升)的壳聚糖溶液；将两种溶液以体积比3: 20，溶质的质量比1:4混合，将混合 溶液进行静电纺丝，纺丝条件电压，20千伏；电场距离，130毫米；纺丝速率，80毫升 /小时，得到平均纤维直径为148纳米的复合纳米纤维膜。
实施例5
称取按照实施例一中制备的丝素蛋白0.8克，溶于10毫升六氟异丙醇中，搅拌至完 全溶解，得到浓度为8% (克/毫升)的丝素蛋白溶液；将0. 8克壳聚糖溶于10毫升以体积 比90: IO混合的六氟异丙醇和三氟乙酸混合溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为8%(克 /毫升)的壳聚糖溶液；将两种溶液以体积比l: 1，溶质的质量比l:l混合，将混合溶液进 行静电纺丝，纺丝条件电压，20千伏；电场距离，130毫米；纺丝速率，80毫升/小时， 得到平均纤维直径为102纳米的复合纳米纤维膜。
权利要求
1. 一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法，包括(1)丝素蛋白的提取将去蛹蚕茧在100℃的质量百分比为0.5％Na2CO3水溶液中煮三次，每次30min，用蒸馏水充分洗净，于45℃烘干，将烘干后的蚕丝纤维以浴比1∶10溶解于三元溶剂，于70℃恒温水解1h，然后用蒸馏水透析72h，再放入—80℃预冻12h，然后在-58℃冷冻干燥，得到疏松的多孔状固体丝素蛋白；(2)制备丝素蛋白溶液将上述丝素蛋白溶于六氟异丙醇，常温下搅拌至完全溶解，得到浓度为4-10％g/ml的丝素蛋白溶液；(3)制备壳聚糖溶液将壳聚糖溶于六氟异丙醇HFIP和三氟乙酸TFA的混合溶剂中，搅拌至透明，得到浓度为4-8％g/ml的壳聚糖溶液；(4)制备丝素蛋白和壳聚糖的混合溶液将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液按体积比0.15-2.4∶1混合，搅拌均匀，得到共混静电纺丝液；(5)将丝素蛋白和壳聚糖混合溶液进行静电纺丝，调整静电纺丝工艺参数，控制电压为12-30千伏，电场距离为60-200毫米，纺丝速率为0.5-1.5毫升/小时，得到丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维。
2. 根据权利要求1所述的一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法， 其特征在于所述步骤(1)中的三元溶剂为CaCl2、 C2H5OH和H20的混合液，其中CaCl2、 C2H5OH和H20的摩尔比为1:2:8。
3. 根据权利要求1所述的一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法， 其特征在于所述步骤(3)中的六氟异丙醇HFIP和三氟乙酸TFA的混合溶剂，其中六 氟异丙醇HFIP和三氟乙酸TFA的体积比为9:1。
4. 根据权利要求1所述的一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法， 其特征在于所述歩骤(4)中的丝素蛋白占溶质总质量分数的10%-80%，壳聚糖占溶质 总质量分数的20%-90%。
5. 根据权利要求4所述的一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法， 其特征在于所述的溶质为丝素蛋白和壳聚糖。
6. 根据权利要求1所述的一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法， 其特征在于所述的丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的直径随纺丝溶液浓度增大逐渐增大， 随壳聚糖含量的增加逐渐减小。
7. 根据权利要求1所述的一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法，其特征在于所述的丝素蛋白/壳聚糖复合纤维可应用于生物医学领域组织工程的研究。
全文摘要
本发明涉及一种仿生细胞外基质丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维的制备方法，包括(1)将去蛹蚕茧在Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>溶液中煮三次，洗净，于45℃烘干，将其溶解于三元溶剂，经水解，透析，冷冻干燥，得到疏松的多孔状固体丝素蛋白；(2)将上述丝素蛋白溶于六氟异丙醇，得到丝素蛋白溶液；(3)将壳聚糖溶于HFIP和TFA的混合溶剂中，得到壳聚糖溶液；(4)将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合，搅拌均匀，得到共混静电纺丝液；(5)将混合液进行静电纺丝，得到丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维。本发明的丝素蛋白/壳聚糖复合纤维的力学性能和降解行为优良，为细胞生长和组织再生提供最佳的仿生生理环境；该制备方法简单易行，易实现工业化生产。
文档编号D01F8/00GK101445971SQ20081020740
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者张葵花, 王红声, 莫秀梅 申请人:东华大学