基质金属蛋白酶-3（mmp3）检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种基质金属蛋白酶?3(MMP3)测定试剂盒及其测定方法，属于医学生物检测技术领域。该试剂盒包括试剂1、试剂2、校准品及质控品，试剂1包含Tris?HCl、叠氮钠、PEG?6000，试剂2包含Tris?HCl、包被了抗人基质金属蛋白酶?3抗体胶乳颗粒、叠氮钠和尼泊金甲酯，校准品包含基质金属蛋白酶?3抗原、叠氮钠，质控品包含基质金属蛋白酶?3抗原、叠氮钠。本发明提供的一种基质金属蛋白酶?3(MMP3)测定试剂盒及其测定方法，采用胶乳免疫比浊技术，具有分析灵敏度高、结果准确、操作简单、成本适合等优点，便于推广。
【专利说明】
基质金属蛋白酶-3(MMP3)检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属医学生物检测技术领域，具体涉及一种基质金属蛋白酶-3(MMP3)检测试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而 得名。其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成：（1)疏水信号肽序 列；（2)前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激 活；（3)催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；（4)富含脯氨酸的 铰链区；（5)羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保 守性。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性，但不是绝 对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成份，而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP降 解，但不同酶的降解效率可不同。
[0003] MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤 侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程 中主要的蛋白水解酶。MMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1~26。根据作用底 物以及片断同源性，将MMPs分为6类，为胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、furin活 化的MMP和其他分泌型MMP。
[0004] IV型胶原酶为其中重要的一类，它主要有两种形式，一种被糖化，分子量为92kD， 命名为MMP-9;另一种非糖化，分子量为72kD，被称为MMP-2。当前对MMP-2，MMP-9的研究较深 入。
[0005] MMP-2基因位于人类染色体16q21，由13个外显子和12个内含子所组成，结构基因 总长度为27kb，与其他金属蛋白酶不同，MMP-2基因5'旁侧序列促进子区域含有2个GC盒而 不是TATA盒。活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，估计其在酶解细胞间基质成分 及基底膜的主要成分IV型胶原中有"钻头"的作用。
[0006] 此外，已证实MMP-3和MMP-?ο能作用于?6、1^^1111型和1￥型胶原及明胶。且]\^ 3-3 能够激活MMP-1和其他家族成员。MMP-7能作用于明胶和FN。MMP-1的产生范围较广，可由基 质纤维母细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞产生。正常情况下MMP-1阳性率很低，但在各 种刺激下可高表达。有研究显示恶性肿瘤中MMP-1高表达与预后相关。
[0007] MMPs的活性受到三个水平的调节，即基因转录水平，无活性酶前体经蛋白水解作 用而激活以及特异性抑制因子(TIMP)的作用。
[0008]目前已知检测基质金属蛋白酶-3的试剂盒较少，方法也存在较大的缺陷，如测定 灵敏度不足，操作繁琐，成本昂贵等，均不利于临床推广使用。
【发明内容】
[0009]本发明提供一种基质金属蛋白酶_3(MMP3)检测试剂盒。
[0010] 本发明还提供上述试剂盒的检测方法。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0012] -种基质金属蛋白酶-3(MMP3)检测试剂盒，它包括:试剂1、试剂2、校准品及质控 品。
[0013]上述基质金属蛋白酶-3(MMP3)测定试剂盒，具体包括如下组分：
[0014] (1)试剂l:Tris 100mM，叠氮钠 5g/L，PEG-6000 4g/L，PH值为8.1;
[0015] (2)试剂2:Tris lOOmM，叠氮钠 2g/L，尼泊金甲酯lg/L，抗人基质金属蛋白酶-3抗 体胶乳颗粒lg/L，PH值为6.0;
[0016] (3)校准品：水平1含基质金属蛋白酶-3抗原37 · 5ng/ml，叠氮钠5g/L;水平2含基质 金属蛋白酶-3抗原75ng/ml，叠氮钠5g/L;水平3含基质金属蛋白酶-3抗原150ng/ml，叠氮钠 5g/L;水平4含基质金属蛋白酶-3抗原300ng/ml，叠氮钠5g/L;
[0017] (4)质控品：基质金属蛋白酶-3抗原50ng/ml，叠氮钠5g/L。
[0018] 所述的试剂1、试剂2、校准品及质控品的溶剂为电导率(25°C)不大于0.1mS/m的纯 净水。
[0019 ]所述的抗人基质金属蛋白酶-3抗体为兔抗人多克隆抗体。
[0020] 所述的胶乳颗粒为粒径为80-100nm。
[0021 ]所述的PH值调节试剂为ImM的盐酸溶液。
[0022] 所述检测试剂盒用于定量测定血清中基质金属蛋白酶-3的含量。
[0023] 本发明第二方面提供所述测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
[0024] 1)准备编号为1、2、3、4的4支反应管；
[0025] 2)同时在第1反应管内加入试剂1 150yL，水平1校准品3yL混合均匀，在第2反应管 内加入试剂1 150yL，水平2校准品3yL混合均匀，在第3反应管内加入试剂1 150yL，水平3校 准品3yL混合均匀，在第4反应管内加入试剂1 150yL，水平4校准品3yL混合均匀，4支反应管 均孵育5分钟；
[0026] 3)5分钟孵育结束后，同时在第1反应管内加入试剂2 50yL混合均匀，在第2反应管 内加入试剂2 50yL混合均匀，在第3反应管内加入试剂2 50yL混合均匀，在第4反应管内加 入试剂2 50yL混合均匀，均孵育半分钟；
[0027] 4)半分钟孵育结束后，分别读取1、2、3、4反应管吸光度心"12，心 3，心4;
[0028] 5)继续孵育5分钟后，再次分别读取1、2、3、4反应管吸光度A21，A22，A23，A 24;
[0029] 6)分别以4个不同浓度水平校准品浓度为横坐标，以（A2i-An)、（A22-A12)、（A23-A13)、(A24-A14)为纵坐标作一标准曲线图；
[0030] 7)再次准备1支反应管，在反应管内加入试剂1 150yL，检测样本3yL混合均匀并孵 育5分钟；
[0031] 8)5分钟孵育结束后，在反应管内加入试剂2 50yL混合均匀并孵育半分钟，读取吸 光度A1;
[0032] 9)继续孵育5分钟，读取吸光度A2;
[0033] 10)计算A2-A1，然后在标准曲线上找出对应的浓度值，即为样本中基质金属蛋白 酶-3的含量。
[0034]所述的反应孵育温度为37°C。
[0035] 本发明的有益效果为：
[0036] 本发明所提供的一种基质金属蛋白酶-3(MMP3)测定试剂盒，采用胶乳免疫比浊技 术，并提供配套的校准品及质控品，具有测定结果准确、检测灵敏度高、方便快捷、稳定性 好、特异性高、成本低廉等优点，利于临床推广使用。
【具体实施方式】
[0037]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0038] 实施例1:抗基质金属蛋白酶-3抗体胶乳颗粒制备。
[0039] 1)配制50mM的MES缓冲液，PH值为6 · 0;
[0040] 2)用上述MES缓冲液稀释胶乳微球，浓度为1%(v/v);
[0041 ] 3)在胶乳微球悬浮液中加入EDAC，加入浓度为40mg/ml，在室温孵育40分钟；
[0042] 4)用相同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球，然后13000g/min离心30分钟，再次用相 同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球，然后13000g/min离心30分钟，然后再将胶乳微球溶于 MES缓冲液中；
[0043] 5)将兔抗人基质金属蛋白酶-3抗体溶于上述MES缓冲液中，浓度为lmg/mL;
[0044] 6)将抗体溶液和胶乳微球悬浮液混合，37 °C搅拌反应3小时；
[0045] 7)在混合液中加入乙醇胺，加入量为2.5yL/mL，搅拌反应10分钟；
[0046] 8)除去未结合的抗体，将包被好的抗体胶乳颗粒贮存在MES缓冲液中。
[0047]实施例2:试剂盒的制备方法。
[0048] (1)试剂1:
[0049] Tris 100mM，叠氮钠5g/L，PEG-6000 4g/L，PH值为8.1;
[0050] (2)试剂2:
[0051] Tris 100mM，叠氮钠2g/L，尼泊金甲酯lg/L，抗人基质金属蛋白酶-3抗体胶乳颗粒 lg/L，PH 值为6.0;
[0052] (3)校准品：
[0053]水平1含基质金属蛋白酶-3抗原37.5ng/ml，叠氮钠5g/L;水平2含基质金属蛋白 酶-3抗原75ng/ml，叠氮钠5g/L;水平3含基质金属蛋白酶-3抗原150ng/ml，叠氮钠5g/L;水 平4含基质金属蛋白酶-3抗原300ng/ml，叠氮钠5g/L;
[0054] (4)质控品：
[0055] 基质金属蛋白酶-3抗原50ng/ml，叠氮钠5g/L。
[0056] 实施例3:检测方法。
[0057] 本实施例描述的基质金属蛋白酶-3测定试剂盒，在使用时采用具有双试剂功能的 全自动生化分析仪，如日立7180全自动生化分析仪等，利用两点终点法进行测定。将试剂1 和试剂2按3:1放于仪器试剂位上，在样本盘相应位置上放置好纯净水、校准品和样本，操作 如下表：
[0058]表1实施例2试剂检测方法
[0059]
[0060]
[0061 ]计算:MMP3含量(ng/mL) = Δ A驗/ Δ A|酸X (?稚 [0062]实施例4:分析灵敏度验证实验。
[0063]用实施例2试剂盒测定已知浓度的样本，记录吸光度差值。检测结果如表2所示。
[0064]表2分析灵敏度实验结果
[0065]
'[0066] 全自动生化分析仪在吸光度大于0.0〇i时均可准确的获得检测结果，且仪器噪音1 对检测结果影响较少.上述结果表明本发明试剂盒的灵敏度可达5ng/ml。
[0067]实施例5:稳定性考察
[0068] 在2-8 °C储存条件下，分别在0个月、12个月和24个月对同一标准品样本(MMP3浓度 为5ng/ml)进行测定，每个样本测定10次，取均值。结果表明（见表3)，测值差异非常小，说明 实施例2制备的检测试剂盒在2-8度储存条件下至少可以稳定24个月以上。
[0069]
[0070]对比例1:试剂2中不添加尼泊金甲酯，其他组分同实施例2 [0071 ]对比例2:试剂2中尼泊金甲酯浓度3g/L，其他组分同实施例2
[0072] 对比例3:试剂1的pH值为7.5，其他同实施例2
[0073] 对比例4:试剂1的pH值为8.7，其他同实施例2
[0074] 对比例5:试剂2的pH值为5.5，其他同实施例2
[0075]对比例6:试剂1的pH值为6.5，其他同实施例2 [0076]实施例6:特异性考察
[0077]在同一份人血清样本(丽P3含量为27.8ng/ml)中分别加入不同含量的干扰物质 MMP10至浓度为30ng/ml，然后进行测定。结果表明，本发明实施例2试剂盒检测结果为 27.6ng/ml;MMP10对本发明试剂盒无干扰。另外，对血红蛋白以及乳糜微粒也进行了类似测 试，结果表明，其对本发明试剂盒也不存在干扰。
【主权项】
1. 一种基质金属蛋白酶-3 (MMP3)检测试剂盒，它包括:试剂1、试剂2、校准品及质控品。2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂1的组成为:Tris lOOmM，叠氮 钠5g/L，PEG-6000 4g/L，PH值为8 · 1;余量为水。3. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂2的组成为:Tris 100mM，叠氮 钠2g/L，尼泊金甲酯lg/L，抗人基质金属蛋白酶-3抗体胶乳颗粒lg/L，PH值为6.0;余量为 水。4. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，校准品为：水平1含基质金属蛋白 酶-3抗原37.5ng/ml，叠氮钠5g/L;水平2含基质金属蛋白酶-3抗原75ng/ml，叠氮钠5g/L;水 平3含基质金属蛋白酶-3抗原150ng/ml，叠氮钠5g/L;水平4含基质金属蛋白酶-3抗原 300ng/ml，叠氮钠5g/L。5. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，质控品为:基质金属蛋白酶-3抗原 50ng/ml，叠氮钠5g/L。
【文档编号】G01N33/531GK105974105SQ201610321019
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】张伟林, 黄龙梅, 王鑫
【申请人】河北艾驰生物科技有限公司