专利名称：药剂、牙科材料及筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的药剂及其使用，特别涉 及利用基质金属蛋白酶-3对牙髓及其附近组织损伤及缺损时的修复。
背景技术：
以往，在龋齿等治疗方法中，当发生龋齿并深入牙髓时，通常通过拔除全部牙髓， 然后在空隙处填充根管充填材料进行封闭处置。然而，近年来，由于拔髓产生的弊端(如象 牙质脆化、丧失咬合感觉而引起再度龋齿)，期望尽可能保留牙髓组织。保留牙髓的方法有 直接盖髓术和活髓切断术(vital pulpotomy)，其中，直接盖髓术用覆髓剂覆盖露出的牙髓 表面，活髓切断术只去除一部分牙髓并用覆髓剂覆盖根部牙髓组织。在考虑到牙髓的保存时，在牙髓外侧形成象牙质很重要。为此，如文献1、2、3所 述，尝试以提高象牙质促进作用为目的的覆髓剂。另外，在考虑到牙髓的保存时，抑制牙髓炎症及疼痛，且促进血管新生及牙髓再生 很重要。为此，如非文献1所述，尝试以抗炎症作用为目的的覆髓剂。文献1 特开2002-363084号公报文献2 特开平6-256132号公报文献3 特开2005-263681号公报非文献 1 Kawanishi HN, Kawashima N, et al. , Effects of an iNOS inhibitor onexperimentalIy induced rat pulpitis, J.Oral. Sci. ,112,332-337,2004.
发明内容
但，这些现有覆髓剂的促进象牙质形成的作用还不十分令人满意。文献1所记载 的覆髓剂是以血液抽提物为有效成分的，然而，文献1所记载的覆髓剂其促进象牙质形成 的功效还不足，而且还存在安全方面的问题。另外，文献2所记载的覆髓剂是以N-乙酰葡 萄糖胺(Ο-GlcNAc)为有效成分的。然而，如文献2所记载的覆髓剂不包含成齿质细胞分化 诱导所必须的形态形成因子、细胞增殖分化因子、细胞迁移因子，所以只不过是间接吸附游 离在局部的因子而已。因此，文献2所记载的覆髓剂在促进象牙质形成以及象牙质-牙髓 复合体再生方面的功效不足。文献3所记载的覆髓剂是以聚磷酸为有效成分的，然而使促 进象牙质形成的功效发挥不足。非文献1中记载的覆髓剂是以一氧化氮诱导酶抑制剂为有 效成分的，非文献1所记载的覆髓剂通过阻断一氧化氮诱导酶、破坏炎症介质网络的一端 来发挥消炎作用的。然而，促进新生血管及牙髓再生的作用不足。因此，本发明以提供一种用于治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的药剂为目的。 另外，本发明还以提供一种用于治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的牙科材料为目的。另 外，本发明还以提供一种治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的药剂的有效成分的筛选方法 为目的。本发明人从含有丰富牙髓干细胞的SP细胞(CD31_ ；CD146_SP细胞)中采集具有高血管再生能力的细胞，同时对牙髓SP细胞进行基因表达谱分析。其结果为本发明人发现， 涉及细胞外基质及基底膜分解的细胞外基质分解酶的基质金属蛋白酶-3(MMP-:3)为高表 达。进一步，本发明人还发现这些蛋白质可促进牙髓创伤的愈合，同时有利于牙髓、象牙质 的形成 再生以及牙髓炎的治愈，本发明人基于上述发现完成了此项发明。S卩，本发明具有 如下步骤。根据本申请发明的第一实施方式的药剂，其含有有效成分，其中，该有效成分至少 包括具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一 个。本发明的药剂可以作为牙髓损伤或部分缺失时的药剂使用。尤其，本发明的药剂可以 作为牙髓炎及/或根尖性牙周炎等牙髓相关疾病的预防或治疗剂使用。优选地，有效成分的含量比例为12ng/ml-1000ng/ml之间，其中，该有效成分为至 少含有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一 种。根据本申请发明的第二实施方式的牙科材料，其含有有效成分，其中，该有效成分 至少含有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一种。优选地，所述牙科材料含有机体亲和性载体。该载体为符合药理学的载体。优选地，所述载体具有的一侧纵向排列多个同一指向的凹形结构，由氧透过性及/ 或物质透过性的材料制成的膜状载体。优选地，所述载体至少含有胶原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖 (glycosaminoglycan)、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱(phosphocholine)、透明质酸、几丁 质、氨基葡萄糖、纤连蛋白、海藻酸、硫酸乙酰肝素(h印aransulfate)、肝素、层粘连蛋白、 磷酸钙、羟基磷灰石、β-TCP、多聚乳酸、聚乙醇酸、DL-聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚 乙二醇、多晶硅、聚已酸内酯(poIycapro 1 actone)、碳酸钙、钛、金、陶瓷、硅树脂、硅水凝胶 (silicone hydrogel)中的任意一禾中。优选地，本发明的牙科材料中至少还含有牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、 能分化为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞(odontoblast)以及能分化为成齿质细胞的细胞中 的任意一种。优选地，所述牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、可分化为牙髓细胞的细胞、成 齿质细胞(odontoblast)以及可分化为成齿质细胞的细胞含量在1 X IO3个/ μ 1 1 X IO6 个/μ 1之间。优选地，本发明的牙科材料含有血管内皮细胞或血管内皮前体细胞。优选地，本发明的牙科材料含有上皮细胞。优选地，本发明的牙科材料含有象牙质基质即牙本质基质(dentin matrix) 0另外，优选地，在本发明的牙科材料中，所述基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质 以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一种所构成的有效成分的含量比例在12ng/ ml-1000ng/ml 之间。优选地，所述牙髓干细胞至少包含牙髓SP细胞、⑶3Γ ；⑶146—SP细胞、⑶M+细胞、 ⑶105+细胞、⑶150+细胞中的任意一种。根据本申请发明的第三实施方式的筛选方法，一种用于治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的药剂有效成分的筛选方法；在牙髓干细胞或血管内皮细胞中添加被检验化合 物，然后测定牙髓干细胞或血管内皮细胞基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量；在牙髓干 细胞或血管内皮细胞中没有添加被检验化合物时，测定基质金属蛋白酶-3编码基因的表 达量；将两者基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量进行比较，以将基质金属蛋白酶-3编码 基因表现量所增加的被检验化合物作为所述药剂的有效成分进行选择。根据本发明的药剂，能够达到减轻牙髓炎的炎症状态，促进血管内皮细胞的迁移， 防止血管内皮细胞凋亡的效果，并促进牙髓干细胞以及血管内皮细胞在创面的增殖，同时 促进新生血管，从而促进象牙质的形成，因此在牙髓炎的治疗效果方面优秀。另外，通过将 根据本发明的牙科材料填充至活体牙窝洞处，可减轻牙髓炎的炎症状态，并促进牙髓干细 胞以及血管内皮细胞在创面的增殖，促进新生血管，从而促进象牙质的形成。并且，根据本 发明提供的筛选方法，通过比较基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量，从被检验化合物中 可筛选出能够促进牙髓炎以及/或象牙质形成的药剂的有效成分。
图IA为具有凹状部的膜状载体的平面图。图IB为具有凹状部的膜状载体的侧面图。图IC为将凹状部扩大的说明图。图2A为严重龋齿引起牙髓裸露的牙齿的说明图。图2B为表示牙齿模具的说明图。图2C为对将带有间叶干细胞(mesenchymal stem cell)的凹状部载体置入牙形 模具中的牙窝洞内的情况进行说明的说明图。图2D为对将带有MMP3活性蛋白的载体以及凹面载体置入牙形模具中的牙窝洞的 情况进行说明的说明图。图2E为对在培养装置中培养干细胞的情况进行说明的说明图。图2F为对垂直加压后，干细胞分化为成齿质细胞以及成釉细胞(enameloblast) 的情况进行说明的说明图。图2G为对将带有凹状部的载体移植至牙窝洞后的情况进行说明的说明图。图3A为对大鼠上颚切齿情况进行说明的说明图。图:3B为对使用钻石牙钻(diamond point bur)去除大鼠上颚切齿牙冠上部的情 况进行说明的说明图。图3C为使用球钻(round bur)切断大鼠上颚切齿牙髓的情况进行说明的说明图。图3D为对清洗、止血处理断面的情况进行说明的说明图。图3E为对在断面开口处填充明胶、树脂的情况进行说明的说明图。图4为对牙髓创伤处进行说明的低倍图片。图5A为创伤出现1小时后的情况的显微照片。图5B为图5A中方框区域的显微照片。图5C为创伤出现M小时后的情况的显微照片。图5D为图5C中方框区域的显微照片。图5E为创伤出现72小时后的情况的显微照片。
图5F为图5E中方框区域的显微照片。图5G为创伤出现7天后的情况的显微照片。图5H为图5G中方框区域的显微照片。图6A为创伤下部牙髓处的mRNA表达的经时变化示意图；MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、 MMP14的表达示意图。图6B为创伤下部牙髓处的mRNA表达的揭示变化示意图；VEGF、SDFl以及CXCR4 的表达示意图。图7A为活髓切断M小时后，经MMP3及BSl-血凝素(BSl-Iectin)双重免疫荧光 染色后的MMP3显微照片。图7B为活髓切断M小时后，经MMP3以及BSl-Iectin双重免疫荧光染色后 BSl-Iectin的显微照片。图7C为活髓切断M小时后，经MMP3以及BSl-Iectin双重免疫荧光染色后Merge 处理的显微照片。图7D为活髓切断M小时后，经MMP3以及CXCR4双重免疫荧光染色后MMP3的显 微照片。图7E为活髓切断M小时后，经MMP3以及CXCR4双重免疫荧光染色后CXCR4的显 微照片。图7F为活髓切断M小时后，经MMP3以及CXCR4双重免疫荧光染色后经Merge处 理的显微照片。图7G为经MMP3及CXCR4双重免疫荧光染色后，MMP3的放大显微照片。图7H为经MMP3及CXCR4双重免疫荧光染色后，CXCR4的放大显微照片。图71为经MMP3及CXCR4双重免疫荧光染色后，Merge处理的放大显微照片。图7J为活髓切断M小时后，牙髓创面经HE染色后的显微照片。图7K为活髓切断M小时后，牙髓断面新生毛细血管以及新生大血管经HE染色后 的显微照片。图7L为活髓切断72小时后，新生毛细血管以及新生大血管经HE染色后的显微照 片。图7M为活髓切断M小时后，经原位杂交，MMP3 mRNA在血管内皮细胞以及血管内 皮前体细胞中表达情况的显微照片。图7N为活髓切断72小时后，经原位杂交，MMP3 mRNA在血管内皮细胞以及血管内 皮前体细胞中表达情况的显微照片。图8A为在体外，MMP3促进血管内皮细胞增殖的示意图。图8B为在体外，MMP3促进血管内皮细胞迁移的示意图。图8C为在体外，MMP3促进血管内皮细胞抗凋亡的示意图。图9A为大鼠活髓切断M小时后，添加MMP3后经BSl-Iectin染色的显微照片。图9B为大鼠活髓切断M小时后，未添加MMP3 JSBSl-Iectin染色的显微照片。图9C为大鼠活髓断面处的上部牙髓组织，在添加MMP3后，新生血管密度定量增加 的示意图。图9D为大鼠活髓切断M小时后，添加MMP3 JSPCNA免疫染色时的显微照片。
图9E为大鼠活髓切断M小时后，未添加MMP3，经PCNA免疫染色后的显微照片。图9F为大鼠活髓切断72小时后，添加MMP3，经HE染色的显微照片。图9G为大鼠活髓切断72小时后，未添加MMP3，经HE染色时的显微照片。图9H为大鼠活髓切断72小时后，添加MMP3，经马松染色(Masson' sTrichrome Stain)的显微照片。图91为大鼠活髓齿切断72小时后，添加MMP3，原位杂交的显微照片。图9J为大鼠活髓齿切断72小时后，未添加MMP3，经马松染色的显微照片。图9K为大鼠活髓切断72小时后，添加MMP3及NNGH，经马松染色的显微照片。图9L为大鼠活髓切断7天后，未添加MMP3，经马松染色的显微照片。图9M为大鼠活髓切断7天后，添加MMP3及NNGH，经马松染色的显微照片。图9N为大鼠活髓切断72小时后，添加MMP3，胶原蛋白基质增加情况示意图。图90为大鼠活髓齿切断7天后，添加MMP3，胶原蛋白基质增加情况示意图。图IOA为狗活髓切断14天后，添加MMP3，狗上颚臼齿象牙质的形成情况的显微照 片。图IOB为狗活髓切断14天后，添加MMP3，狗上颚臼齿象牙质的形成情况的高倍显 微照片。图IOC为狗活髓切断14天后，添加MMP3，狗上颚臼齿象牙质的形成情况的超高倍 显微照片。图IOD为狗上颚臼齿活髓切断14天后，PBS控制时的显微照片。图IOE为狗上颚臼齿活髓切断14天后，PBS控制时的高倍显微照片。图IlA为发生牙髓炎的狗上颚臼齿添加MMP3 14天后，炎症治疗情况的显微照片。图IlB为发生牙髓炎的狗上颚臼齿添加MMP3 14天后，炎症治疗情况的高倍显微 照片。图IlC为发生牙髓炎的狗上颚臼齿的PBS控制时的14天后的显微照片。图IlD为发生牙髓炎的狗上颚臼齿的PBS控制时的14天后的高倍显微照片。图12A为将源于猪牙髓的CD31_ ；CD146_SP细胞附着于带有凹状部的硅氧树脂 (silicone)膜载体上，培养12小时后的相差显微照片。图12B为垂直加压6小时，培养48小时后，β -肌动蛋白(β -actin)、Dspp以及 釉质溶解素(Enamelysin)的mRNA表达的示意图。附图标记说明100带有凹状部的载体；110凹状部；200牙齿；210牙髓;290模具;300吸附有MMP3蛋白的载体；400培养设备；500大鼠上颚切齿；510钻石牙钻(diamond point bur)
520 球钻(round bur)；540 断面；550:明胶;560 树脂。
具体实施例方式以下将参照添加的图片来具体说明本发明的实施方式。本发明涉及一种可促进牙髓炎治愈及/或象牙质的形成的药剂、牙科材料及有效 成分的筛选方法，其中，至少含有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白 酶-3前体蛋白中的任意一种。本发明的各种实施方式均是利用基质金属蛋白酶-3对牙髓炎的进行治疗以及/ 或促进象牙质的形成。基质金属蛋白酶-3属于基质金属蛋白酶(MMP)族，相关细胞外基质 的分解。但是，每种MMP的特性还不完全知晓。本发明人根据从牙髓细胞中采集的特定SP细胞的表达图谱，在SP细胞内大量表 达的蛋白质中，发现了 MMP3具有特异地促进象牙质形成的作用。关于MMP3已进行了多方 面的研究，示出了 MMP3对相关各种软骨基质成分的分解作用，从而MMP3作为破坏软骨的蛋 白，已被认为是作为风湿症(rheumatism)的参与因子或标志使用。另外，在相关牙周病引 起的牙周组织，现在已尝试使用MMP3编码基因的表达抑制剂作为预防或治疗牙周病(特开 2006-298913号公报)。但，有关对MMP3的牙髓炎的治愈参与还完全不清楚。同时，对MMP3 的牙髓及/或象牙质的形成、再生也完全不清楚。本发明的药剂和牙科材料将具有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质直接应用 于创伤部位及/或炎症部位，根据本发明的药剂及牙科材料，可以促进牙髓炎治疗。另外， 根据本发明的药剂和牙科材料，可以促进牙髓及/或象牙质的形成并再生。本发明的效果 并不限于发明，推测MMP3作用于血管内皮细胞或血管内皮前体细胞迁移、增殖、抗凋亡，通 过新生血管，在促进牙髓的再生以及象牙质形成、再生方面具有独特的功效。下面，将说明本发明的各种实施方式。(牙髓炎治疗及/或促进象牙质形成的药剂)本药剂含有具有MMP3活性的蛋白质(以下称MMP3活性蛋白)、MMP3前体蛋白 或这些蛋白的混合物为其有效成分。以下将MMP3活性蛋白、MMP3前体蛋白或它们的混 合物定义为MMP 3蛋白。MMP 3属于MMP族中的一种蛋白质成分，也被称为基质降解因子 (stromelysin) 1。MMP3可来源于各种生物，例如，人类MMP3的氨基酸序列以及碱基序列可 在 GenBank 中，通过 Accession 号码 NP_002413. 1 获得。MMP3活性蛋白可采用重组MMP3，即可来源于大肠杆菌、昆虫或人纤维组织母细 胞(fibroblast)。MMP3活性蛋白是指天然MMP3的氨基酸序列中，具有任何1个或多个 氨基酸发生替换、缺失、插入以及增加的任何一种或2种以上的氨基酸序列，具有MMP3 活性的尤佳。也就是说，可以是一种天然MMP3的突变体。这些突变体的获得，除了本领 域技术人员中公知的方法以夕卜，还可参照Molecular Cloning :A laboratory Mannual, 3nd Ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY. ,2001(以下简 禾尔为 Molecular Cloning 第三版)或 Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1-38, John Wiley &Sons (1987-1997)(以下简称为 Current Protocols in Molecular Biology)获得。MMP3的活性可通过MMP3活性测定系统(Nagase et al.， J. Biol. Chem. 1994269 =20952-20957)等进行测定，其中，MMP3活性测定系统使用明胶酶谱 (Gelatin-zymography) > Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)或焚光月太。另夕卜， 对于突变体中MMP3的活性程度无特殊限制。MMP3前体蛋白是由结缔组织细胞分泌的一种 无活性前体(pro MMP3)，是前体肽(Pro-p印tide)被有限分解前的前体，还包含天然MMP3 前体的突变体。MMP3活性蛋白是将MMP3前体蛋白利用人工胰朊酶、纤溶酶(plasmin)、丝氨酸蛋 白酶(serine proteinase)等切断得到。也就是说，MMP3前体蛋白通过其他或自身的蛋白 酶酶解活性，前体肽经有限分解，从而具有了酶活性。因此，使药剂中含有MMP3前体蛋白质 可防止药物在用于活体前药效发生劣化，MMP3前体蛋白进入机体后，会自然地或因其他作 用而被激活。若使用MMP3活性蛋白和MMP3前体蛋白的混合物，二者混合的比例无特别限 制，可适当配比。本发明的药剂中的MMP3蛋白，在允许药理学以及药剂学原理的情况下，可与其他 添加物混合，制作成适用于患处的各种制剂。本发明中的覆髓剂可采用多种剂型如注射剂、 外用液剂(注入剂、搽剂)、固体制剂(颗粒剂、细粒剂、散剂、软膏剂、锭剂)、软膏剂等。药理学以及药剂学范围内容许的添加物包括如赋形剂、崩解剂或崩解助剂、等张 化剂(isotonization)、酸度调节剂、稳定剂、防腐剂、保护剂、分散剂、乳化剂、胶化剂、增稠 剂、粘合剂、增味剂等。关于胶化剂，如吸收牙齿的浸出液，能使之胶化即可。粉剂以及液剂 等剂型，使用时可混合或搅拌。本发明药物中可含有杀菌剂、抗生素、消炎药物等其他有效成分。本发明药物除可用于治疗龋齿时的牙科修复以及修补处置外，还可用于外伤引起 的牙髓裸露以及拔髓后用于露髓面或其附近。例如，可将本发明药物涂抹或填充于髓腔扩 大、拔髓后的牙窝洞处、象牙质、活髓齿的断面处。另外，在拔髓或根管清创扩创后的牙髓再 生治疗时，也可将本药物用于再生牙髓表面或根管内及其附近处。本发明药物可单独使用，也可与直接覆髓剂或间接覆髓剂配伍使用。在使用直 接覆髓剂或间接覆髓剂前后均可使用本发明药物，也可将本药物与直接覆髓剂或间接覆 髓剂混合使用。在本发明中，「直接覆髓剂」是指部分牙髓暴露时，用于保护牙髓的药剂， 如氢氧化钙等制剂。「间接覆髓剂」是指象牙质变薄而牙髓未裸露时，用于阻断外来刺激、 杀菌等目的的药剂，如氧化锌丁香油酚(zinc oxide eugenol)、锌化杂酚油(zinc oxide Creosote)。本发明药物中MMP3蛋白的含量可在12ng/ml lOOOng/ml之间，适宜含量为 50ng/ml 500ng/ml，最佳含量为 80ng/ml 200ng/ml。若其含量低于 10ng/ml，则 MMP3 对HUVEC迁移的促进作用不明显。若MMP3的含量高于lOOOng/ml，则本发明药物用于人体 时可能会产生不可预期的副作用。本发明药物的用量无特别限制，可根据患者的症状(龋 齿的程度、牙髓损伤·缺损程度)、年龄、剂型酌情处置。本发明药物中有效成分MMP3活性 蛋白的每次用量可在Ing IOOyg之间，适宜用量为IOng 10 μ g，最佳用量为IOng 1 μ g，所述用量均指干重。本发明药物可促进牙髓及/或象牙质形成，在其损伤或缺损时还会促进其再生。因此，将药物用于裸露的牙髓表面或其附近可较好的发挥保存牙髓的功效。另外，在发生牙髓炎时，本发明药物还有利于牙髓或其附近炎症的治愈或改善其 症状。因此，本药物可用于包括牙髓炎或根尖性牙周炎等牙髓及其附近炎症疾病在内的牙 髓相关疾病的预防或治疗。(牙科材料)本发明提供的牙科材料中，除含有MMP3蛋白外，也可含有机体亲和性、MMP3蛋白 的支撑载体。将本材料用于牙髓缺损部位及其附近处，可促进牙髓及/或象牙质的形成，能 较好地保留牙髓或促进其再生。(载体)在本牙科材料中，由于载体的作用可使本牙科材料中的MMP3蛋白更易于到达患 处。另外，在牙髓及象牙质再生或形成时载体还可将MMP3蛋白长期地保留于患处。同时， 载体还可成为富集各种细胞，促进组织再生的支架或充填材料而发挥作用。载体既可事先 与MMP3蛋白组成复合物，也可与MMP3蛋白分别独立制成试剂盒使用。MMP3蛋白与载体可通过某种相互作用而被保留在载体表面。载体最好由具有机体亲和性材料制成。机体亲和性材料如I型及III型胶 原蛋白、缺端胶原(atelocollagen)等各种胶原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖 (glycosaminoglycan)、明胶、/K凝胶(hydrogel)、纤维素、磷酸胆碱(phosphocholine)、透 明质酸、几丁质、氨基葡萄糖、纤连蛋白、海藻酸、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、 层粘连蛋白、三磷酸钙、羟磷灰石(hydroxyapatite)、β-TCP等天然材料及其衍生物，除所 述物质外还可使用PLA (聚乳酸)、PGA (多聚葡萄糖酸)、PDLLA (DL-聚乳酸)、PLGA (乳酸 葡萄糖共聚物)、PEG(聚乙二醇)、聚硅氧烷(poly silicone) ,PCL(caprolactone)等高分 子材料。机体亲和性载体材料可采用如碳酸钙、钛、金及陶瓷等无机材料。另外，蛋白聚糖 是蛋白质与糖苷键共价结合的一种复合糖蛋白。考虑到细胞的粘附性及细胞的增殖性，可 在聚硅氧烷等高分子材料载体表面使用等离子涂层材料(Plasma-Coating)、胶原蛋白溶液 或纤连蛋白等天然材料及其衍生物制成载体材料层。为了提高细胞的粘附性，可对载体表 面采取等离子(plasma)处理、制作胶原蛋白涂层(Collagen Coat)等措施。I和III型胶原蛋白系将I型胶原蛋白和III型胶原蛋白混合组成的混合胶原蛋 白。I型胶原蛋白是一种基础性胶原，属于纤维性胶原蛋白。III型胶原蛋白与胶原纤维不 同，会形成细网状的构型即网状纤维，可成为细胞的支架。III型胶原蛋白在混合胶原蛋白 中的比例最好在30% 50% (重量比)，III型胶原蛋白的重量比若大于50%，混合胶原 蛋白可能不发生凝固。若III型胶原蛋白的重量比低于30%，多量的I型胶原蛋白有可能 引起象牙质的再生而影响新生血管的形成。I型和III型胶原蛋白的重量比最好为1 1。 机体亲和性载体可使用平均直径在Inm lOOOnm、海绵状的具有三维立体结构的纳米纤维 (一种热塑性高分子)制成。三维立体结构纳米纤维的孔隙率最好在80% 99. 99%之 间。另外，纳米纤维的平均直径可通过下列方法求得使用扫描电镜观察海绵状三维立体结 构的横断面或纵断面，用图像处理软件分析在同一断面内随机选取的150根单纤维的断面 积，计算圆周换算直径，从而求得平均直径。载体的三维立体结构无特别限制，长纤维状(filament)、薄膜状、纤维集合体状、 网状、海绵状、微粒状等各种形状均可。另外，载体既可涂于牙髓表面，也可制成牙窝洞的形状(拔髓或牙髓切断后所产生的三维立体空隙的形状)。载体的表面最好既能成为MMP3蛋白的支架，又有利于细胞的粘附，最理想的载体 是具有一定表面积与空隙的多孔材质或网状骨架材质。也可将具有不同三维立体结构的载体组合使用，如将多孔材质的载体(适合用于 覆盖在裸露牙髓表面和填充于裸露牙髓上侧的空隙处)与用于象牙质再生支架的载体组 合使用。这样使用时，两种载体上都可吸附有MMP3蛋白，若牙髓侧的载体中也有MMP3蛋白 的话，促进组织再生的效果会更好。牙科材料含有载体时，可将MMP3蛋白事先吸附于载体上。将MMP3蛋白吸附于载 体上时，若二者依靠相互作用较易粘附的话，只要将二者混合、浸泡等相互接触即可。用于象牙质再生的支架载体，如图IA所示，可使用表面具有微小凹陷结构110的 载体100。这种微小凹陷结构110可模拟象牙质的象牙细管(或齿细管)的形态来制作。 凹陷结构110不需完全模仿象牙质的象牙细管形态，最好参照象牙细管的尺寸(直径与深 度)、方向及空隙(即节距(pitch))来制作。载体上之所以准备凹陷结构110是为了促进 象牙质的再生。如图IB所示，凹陷结构110在载体100的一侧需设有开口。凹陷结构110的深 度d可制成Iym至几十μπι，深度d的较好范围值在Iym 15 μ m之间，最好在1 μ m 13 μ m之间，最理想在2 μ m 10 μ m之间。如图IC所示，凹陷结构110的直径t及倾斜度ρ 可在数μπι至数十μ m之间，其中直径t可在Iym 12μπι之间，较好的范围值为Iym 10 μ m,更好的范围值为2 μ m 8 μ m。凹陷结构110的倾斜度ρ值可在2μπι 30μπι之 间，较好的范围值为3 μ m 30 μ m，最好在4 μ m 26 μ m之间。牙髓的断面积大约为1mm2。 对于牙髓(露髓面)来说，凹陷结构110最好在5000个 50000个左右。另外，凹陷结构 110既可制成非贯通型的(未贯穿至开口面的对侧)，也可制成贯通型的。不过，凹陷结构 110制成非贯通型的较好。具有凹陷结构110的载体100的厚度无特别限制，可在200 μ m 1000 μ m 之间。具有凹陷结构的载体100最好由氧透过性或物质透过性的材料制成，这样可促 进成齿质细胞及象牙质的形成。这种载体最常用硅树脂材料制成。硅树脂载体不需采用 激光及一些后加工工艺形成凹陷结构，在参照牙窝洞形态加工成立体三维结构时即可形 成凹陷结构。例如，参照牙窝洞形态的母模(cavity)模具在加工成形的同时，凹陷结构 也随之形成了。硅树脂材料制成的载体在用于病灶部位后，在规定的时间内比较容易清 除。硅水凝胶(siliconehydrogel)也可制成的凹面载体100。硅水凝胶是由含有聚碳 酸酯(Polycarbonate)骨架的共聚物(copolymer)和由亲水性单体聚合而成的亲水性高 聚物(Polymer)构成的，是共聚物与高聚物相互形成的网状结构组成的一种透明胶状物。 除硅水凝胶外，硅橡胶(PDMS)、Poly(dimethylacrylamide-co-glycidyl methacrylate) (PDMA-co-GMA)、甲基丙烯酸羟乙酯(hydroxyethyl methacrylate)也可制成凹面载体 100。将细胞接种至凹面载体100进行培养时，培养基通常采用动物细胞培养中常用 的血清培养基或无血清培养基，培养条件一般选择动物细胞的培养条件(例如，37°C、5% C02)。具体培养方法如下准备凹陷结构载体100，从牙髓等组织中采集牙髓细胞，然后使 之附着于载体凹陷结构开口的一面，再将载体置于适当的支撑物上，在适当的培养基中进行培养。进行细胞培养时，将凹面载体100的开口面朝下浸泡在液体培养基中，从液体培养 基的表面沿载体凹陷结构的纵深方向实施反复加压操作，通过所述培养后，附着于载体上 的细胞会排列生长、分化为成齿质细胞。加压操作可以使用机械装置进行，机械压力的大小 无特别限制，不过，压力过大的话，对干细胞或成齿质细胞可能会产生损伤，所以，压力可选 在0. 75N/cm2 1. 5N/cm2之间，压力较好的范围值为0. 85N/cm2 1. 25N/cm2，最好在0. 95N/ cm2 1. ON/cm2之间。另外，加压操作的频率为每分钟1次-10次左右，最好在3次-8次/ 每分钟，每次持续数秒至数十秒，压力应施加于置于容器中的液体培养基。加压的原则应以 不影响细胞的增殖为原则。经过所述的加压操作后，成齿质细胞就会形成象牙质。将上皮细胞粘附于载体100凹陷结构110开口方向的对侧面时，通过加压操作，上 皮细胞会分化为成齿质细胞，同时也能分化为成釉细胞(enameloblast)。当凹面载体100的凹状部开口面一侧接种并培养齿髓干细胞时，也可以在该开口 面处以与吸附有MMP活性3蛋白质的其他载体(吸附有MMP3蛋白的载体)相接触的状态 下进行培养。这样，该其他载体变成重新产生的成齿质细胞的支架的同时，MMP3活性蛋白 质速进成齿质细胞的生长。凹面载体100可直接覆盖在拔髓或牙髓切断后裸露的牙髓表面。将凹面载体100 直接覆盖在拔髓或牙髓切断后裸露的牙髓表面时，可根据拔髓后所留空隙的形状，特别是 对于象牙质处空隙的三维立体形状，将载体制成合适的形状使用。另外，可以将吸附有MMP3 蛋白的载体置于进行拔髓或牙髓切断处置后产生空隙的牙髓侧面(通常在里面)，而将凹 面载体100置于该空隙的表面。同时，还需尽可能将载体100的象牙细管状的凹陷结构100 的开口面朝向牙髓侧放置。凹面载体100和MMP3蛋白载体可分别制作，然后移植在处置后 的部位。凹面载体100和MMP3蛋白载体也可做成预定的形状成为一体后，再移植至处置后 的部位。下面将参照图2A-图2G说明凹面载体100与MMP3载体的使用。图2A-图2G为 使用凹面载体(膜)100，形成象牙细管及牙釉质的模式图。首先，如图2A所示，以牙齿200 为治疗对象，因严重龋齿牙髓210已裸露，进行活髓切断处置。如图2B所示，用物理法取牙 形，制作模型四0，也可以不使用物理法取牙形，而通过计算机测量后制作模型。如图2C所 示，将源于牙髓的干细胞或前体细胞等间叶干细胞附着于凹面载体100的凹面结构110的 表面，然后再放入牙形模具290的牙窝洞内。在所述操作过程中，也可事先将口腔粘膜上皮 等上皮细胞吸附于凹面载体100的凹面结构110表面。如图2D所示，也可将MMP3蛋白载 体300放入牙形窝洞的牙髓侧(内侧)。另外，有时也将源于牙髓的干细胞 前体细胞注入 MMP3蛋白载体300内。如图2E所示，在培养装置400内，沿凹面结构110的纵深方向垂直加 压，进行间叶干细胞的三维细胞培养。如图2F所示，三维细胞培养一段时间后，细胞会排列 分布，分化为成齿质细胞及成釉细胞，从而形成象牙质及牙釉质。如图2G所示，将凹面载体 的凹面部分110朝下，移植至牙窝洞内，再用树脂封闭。这种情况下，有时也可将MMP3蛋白 载体置于牙髓裸露面或活髓断面上，在其上面再直接放置未粘附有源于牙髓的干细胞·前 体细胞的凹面载体300。通过上面的一系列操作，牙髓、象牙细管及牙釉质(牙釉质是在口 腔粘膜上皮等上皮细胞粘附于凹面载体100的凹面对侧的时候形成的)即可形成。也可以只将凹面载体100覆盖在裸露的牙髓表面。牙髓断面较浅时，只将MMP3蛋 白吸附在载体上然后覆盖在牙髓表面即可见效。
(牙髓细胞)本发明提供的牙科材料可单独含有牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、能分化 为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞及能分化为成齿质细胞的细胞中1种或2种以上的细胞成 分，也可与载体共同含有所述细胞成分。将这些细胞置于缺损部位时，会进一步促进牙髓及 /或象牙质的形成·再生。其中，牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞及能分化为牙髓细胞 的细胞能促进牙髓及象牙质的形成及再生，而成齿质细胞及能分化为成齿质细胞的细胞能 促进象牙质的形成及再生。本牙科材料以载体为支持物，成为这些细胞的支架，使之粘附其 上，细胞才能得以增殖。这些细胞(牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、能分化为牙髓细 胞的细胞、成齿质细胞及能分化为成齿质细胞的细胞)的含量最好在IXIO3个/μ I-IXlO6 个/μ ι之间。若其含量低于IXIO3个/μ 1，则促进牙髓及象牙质形成、再生的效果可能不 理想。若其含量高于IXlO6个/μ 1，在填充至牙窝洞内时则会产生无法预期的副作用。牙髓干细胞来源于恒齿或乳齿。特别是在源于人乳齿的牙髓细胞中，CD105+细胞 含量较多，大约占50%左右(在源于人恒齿的CD31_ ；SP细胞中，CD105+细胞的含量约为 20% )，源于人乳齿的牙髓细胞在试管内的实验表明，这种细胞具有诱导血管再生、恢复下 肢缺血部位的血流、促进新生血管形成的功能。牙髓干细胞包括人牙髓SP细胞、⑶3Γ ；⑶146—细胞、⑶M+细胞、⑶105+细胞、 CD150+细胞等。例如，人牙髓SP细胞在促进血管新生等组织再生方面的功能较强。在促进 下肢缺血部位血管新生能力上，人牙髓SP细胞与人乳齿牙髓细胞比较，前者是后者的1. 2 倍；人牙髓SP细胞是人恒齿牙髓细胞的2. 6倍。这些细胞可从拔掉的人齿中采集。人牙髓细胞可参照Nakashima M. Archs oral boil. 36(9)，655-663，1991文献中记载的方法采集。能分化为人牙髓细胞的细胞可按照下 列方法采集无菌取出阻生牙(impacted tooth)，在Phosphate Buffered Saline(以下简 称PBQ溶液等适当的保持液中保存。清除牙齿中的钙化部分，再将组织切成小块，用PBS 溶液清洗。接着用胶原酶(Collagenase)或中性蛋白酶(dispase)酶解组织。酶解后，通 过过滤和离心操作以分离细胞。所得细胞为均质的同类细胞较好，最好为自体细胞。也可 以是经细胞培养所得的细胞。成齿质细胞的采集方法如下将重组子Bone MorphogeneticProteins (BMPs)(从 BMP2、BMP7及BMPll中选择1种或2种以上)加入至牙髓细胞、牙髓干细胞或牙髓前体细 胞内或导入其编码基因，在Dulbecco ‘sModified Eagle Medium(DMEM)中进行二维或三维 培养，使所述细胞发生分化即可得到成齿质细胞。能分化为成齿质细胞的细胞是指牙髓细 胞、牙髓干细胞或牙髓前体细胞等细胞。牙髓细胞是通过胶原酶酶解牙髓组织后，分离得到 的(参照文献 Nakashima M. Archs oral boil. 36 (9)，655-663，1991)。牙髓前体细胞及牙 髓干细胞是经流式细胞仪，从大量排出Hoechst33342的组分Side population (SP)中分选 后得到的。另外，牙髓前体细胞及牙髓干细胞也可用⑶对、⑶；34、⑶105、⑶133或⑶150抗 体来分选⑶24+、⑶34+、⑶105+、⑶133+或⑶150+细胞进而得到所需细胞。本发明牙科材料还可含有血管内皮细胞或血管内皮前体细胞。因MMP3活性蛋白 可促进这些细胞向损伤部位迁移增殖、促进新生血管的形成，同时还能促进牙髓及/或象 牙质的形成。这些细胞为同类细胞较好，最好为自体细胞。这二种细胞也可通过细胞培养 的方法获得。
本发明牙科材料还可含有上皮细胞或其前体细胞。上皮细胞或其前体细胞随着成 齿质细胞的成齿质形成及再生，分化为成齿质细胞及成釉细胞，从而形成象牙质及牙釉质。 这样的上皮细胞或其前体细胞可以从口腔粘膜上皮或羊膜上皮采取。相比同种细胞，这种 细胞更加优选同族细胞。另外，这种细胞可以是培养细胞。本发明牙科材料含有牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞及能分化为牙髓细胞 的细胞、成齿质细胞、能分化为成齿质细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、上皮细胞或 其前体细胞，也可在所述细胞中添加从骨髓、胎盘及脐带血等组织中采集的间叶干细胞或 未分化的间叶干细胞。另外，也可通过下列方法将采集的细胞作为本牙科材料中含有的细胞成分即 用CD31、⑶146、⑶105及VEGFR2抗体标记牙髓细胞，利用流式细胞仪分选⑶3Γ及/或 ⑶146_及/或⑶105+及/或VEGFR2+细胞，进而获得所需细胞。本发明发明人通过所述方 法，分离得到一种大量分泌MMP3活性蛋白的SP细胞，这种细胞中可能富含牙髓干细胞。牙科材料中若含有细胞成分，无论是否添加MMP3活性蛋白，只要含有细胞培养增 殖后产生的细胞培养物即可。另外，如果牙看材料中含有细胞，有无载体均可。如果牙科材 料中含有载体，只要将细胞(或培养细胞)接种至载体上即可，也可将其培养物接种至载 体。在牙科材料包含细胞和载体时，MMP3蛋白最好吸附于载体上。MMP3蛋白既可在细 胞接种前吸附于载体上，也可在细胞接种的同时、细胞培养时或细胞培养后吸附于载体上。本发明牙科材料中也可含有象牙质基质。象牙质基质可促进损伤部位象牙质的形 成。胶原蛋白、羟磷灰石(hydroxyapatite)、三磷酸钙等均可作为象牙质基质。象牙质基 质中也可含有蛋白质成分，如dentin sialophosphoprotein(Dspp)、人造蛋白聚糖、dentin matrix protein(Dmpl)等。本发明牙科材料中还可含有形态形成因子，该因子可促进细胞分化诱导为成齿 质细胞。这种形态形成因子包括1，25 二羟维生素D3、地塞米松(dexamethasone)、Bone morphogenetic proteins (BMPs)、Insulin-like growthfactors(IGFs) > Fibroblast growth factors (FGFs)等。(筛选方法)本发明提供的筛选方法是指下列所述工艺即在牙髓干细胞或血管内皮细胞中添 加被检化合物，然后测定牙髓干细胞或血管内皮细胞中的基质金属蛋白酶-3编码基因的 表达量，与未添加被检化合物时进行比较，通过此种方法来筛选能够增加金属蛋白酶-3编 码基因表达量的被检化合物并以此作为治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成药物的有效成 分。根据此筛选方法来选择能促进牙髓干细胞或血管内皮细胞表达MMP3蛋白的被检化合 物。这些被检化合物可与MMP3蛋白同时或代替MMP3蛋白作为所述药物的有效成分。MMP3基因的表达量，按照下述方法测定，即从接触被检化合物的细胞中采集全 RNA，逆转录得到的cDNA后进行PCR扩增，从扩增产物中得出MMP3基因的表达量。MMP3 活性蛋白的表达量可通过测定牙髓细胞的上清培养液中的MMP3活性来获得。MMP3的活 性可通过 MMP3 活性测定系统(Nagase et al.，J. Biol. Chem. 1994 269 :20952-20957) 进行测定，这些测定系统主要是基于明胶酶谱(Gelatin-zymography)、Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA)或焚光妝等方法。
以下，将通过应用实例具体说明本发明。本发明并不只限于以下几个应用实例。应用实例(应用实例1牙髓创伤治愈过程中，MMP3的表达情况)1.大鼠活髓切断模型的制作首先准备大鼠上颚切齿500，如图3A所示。大鼠体重在220g ^Og之间，为8周 龄雄鼠(购于日本东京CLEA公司)。如图:3B所示，使用钻石牙钻510，将大鼠上颚左右切 齿的牙冠上部除去2mm。如图3C所示，用#1/2球钻520疏通，然后对大鼠上颚左右切齿进 行活髓切断处置。如图3D所示，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗断面540并止血。如图3E所 示，将含有50ng MMP3的明胶和树脂(Unifil low、GC、东京)填充至断面开口处。暂封处 置后，分别于1小时、12小时、24小时、72小时及7天后，使用4%的多聚甲醛固定液进行 灌流固定，摘除上颚切齿。将摘除的上颚切齿在4°C下、置于4%的多聚甲醛溶液中浸泡固 定过夜，然后在10%乙酸中脱钙2周。将所述处理后的上颚切齿使用乙醇进行脱水，石蜡 (Sigma)包埋，制成5μπι厚度的切片，将石蜡切片置于APS Coated slide (Matsunami东京) 上。玻片在进行原位杂交实验(hybridization)及HE染色之前需4°C保存。将免疫组化 用的sample使用OCT复合物进行包埋处理，制成12 μ m厚的冷冻切片后，置于APS Coated slide 上。图4为创伤出现12小时后的低倍图片，在箭头处进行断髓操作。图5A为1小时 后的创伤状态，图5B为图5A方形区域的放大图片。如图5A和图5B所示，在创伤出现1小 时后，图中可观察到出血及血管扩张现象。大鼠覆髓后，创伤表面出现坏死、变性现象，在创 伤面下可见以嗜中性粒细胞为主的炎症性细胞浸润，整个牙髓组织出现浮肿。图5C为创伤M小时后的情况，图5D为图5C中方框区域的放大图片。ν表示新生 血管。如图5C和图5D所示，在创伤出血M小时后炎症性细胞浸润减轻，在变性牙髓正下 方，可见断面下的牙髓组织内出现很多成纤维细胞样细胞、多角形细胞及新生血管。图5Ε为创伤72小时后的情况，图5F为图5Ε中方框区域的放大图片。OD表示骨 样象牙质。如图5Ε及图5F所示，创伤72小时后，断面下牙髓组织内的上部附近，纺锤形细 胞周围有胶原蛋白基质并形成了 一些骨样象牙质。图5G为创伤7日后的情况，图5Η为图5G中方框区域的放大图片。OB表示成齿质 细胞，TD表示细管象牙质。如图5G及图5Η所示，创伤7日后，出现了具有一定方向性的、 1 2层成齿质细胞(0Β :odontoblast-like cells)，骨样象牙质下形成了细管象牙质(TD tubular dentin) 0如图5G所示，新生血管已延伸至成齿质细胞层附近，显示牙髓创伤已治 愈。所述情况说明，在牙髓创伤治愈过程中，此模型有助于研究分析MMP3的表达情况并推 测其功能。2.牙髓创面中mRNA表达的变化情况在形成创伤后的0(刚创伤后)、12、M、48、72小时，分离牙髓组织。从上颚切齿 中采集的正常牙髓组织做对照。从切碎的牙髓组织中，使用TRIzoI(R)试剂(invitrogen) 分离全RNA，取2 μ g的RNA用ReverTra Ace- α (购于东洋纺，东京)进行逆转录。通过实 BiRT-PCRj^MLightCycler FastS tart DNAMaster SYBR Green I (Roche diagnostics, Pleasanton)对cDNA进行扩增。在95 "C，10秒、62 "C 15秒、72 "C 8秒条件下，以经 LightCycler FastStart DNA MasterSYBR Green I (Roche diagnostics, Mannheim)标记的 β-肌动蛋白(3-actin)、MMPl、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10、MMP14、VEGF、CXCR4、SDFl 为 引物(如表1所示)，在LightCycler(Roche Diagnostics)中进行实时RT-PCR扩增。根 据GenBank中大鼠基因序列来设计引物。根据对解链曲线的分析和PCR产物的电泳结果， 来确认扩增片段的大小，另外，将各自的RT-PCR产物亚克隆至pGEM-Easy Vector (Τ载体) (Promega, Madison, WI，美国)上，在数据库中确认基因序列，从而进行PCR产物特异性分 析。β-actin值标准化后，用与大鼠切齿牙髓正常组织的比值来表示各产物的表达量。结 果如图6A和图6B所示。基因名#5' ~ K' ^ !i —3*(bp)GenBankβ凋A蛋力Forward ReverseAAGTACCCCATTGAACACGG ATCACAATGCCAGTGGTACG257NM 一031144MMPIForward ReverseTTGATGGACCTGGAGGAAAC GGTACATCAAAGCCCCAATG192EU597482ΜΜΡ2forward ReverseGATGGCAAGGTGTGGTGTG AATCGGAAGTTCTTGGTGTAGG191NM.031054ΜΜΡ3Forward ReverseTGGCAGTGAAGAAGATGCTG GCTTCCCTGTCATCTTCAGC167NMJ 33523ΜΜΡ9Forward ReverseCGCTTGGATAACGAGTTCTCTC GCAGGAGGTCATAGGTCACG163NM.031055AfMPfOForward ReverseACCCCACTCACATTCTCCAG CATCGAAGTGAGCATCTCCA163NMJ 33514ΜΜΡ14Forward ReverseAGTCAGGGTCACCCACAAAG GGTATCCGTCCATCACTTGG204NM-031056VEGFForward ReverseCTACCTCCACCATGCCAAGT ACACAGGACGGCTTGAAGATt83NM.031836CXCR4Forward ReverseTCCGTGGCTGACCTCCTCTT CAGCTTCCTCGGCCTCTGGC210NM.022205SDFIForward ReverseGCTCTGCATCAGTGACGGTA TAATTTCGGGTCAATGCACA184NM.022177DsppForward ReverseGGAACCGCAGCACAGAATGA CACTGTTCCCCTGTGCGTTT199NM—012790潍意溶.解第Forward ReverseGGCGAGATGGTGGCAAGA GGAAGAGGCGGTAGTTAG163NM.OOt 106800表1在创伤产生后的0小时、12小时、M小时、48小时、72小时，利用real-timeRT_PCR 来分析 MMPl、MMP2、MMP3、MMP9、MMP14、VEGF、SDFl、CXCR4mRNA 的表达情况。如图 6A 所示， 在大鼠牙髓创伤的治愈过程中，MMP3mRNA的表达量在切断牙髓M小时时开始上升，其表达 量是正常牙髓组织的9倍。MMP3 mRNA的表达量在切断牙髓M小时时开始减少，其表达量 是正常牙髓组织的4倍，72小时后是正常牙髓组织的2倍。MMP9 mRNA的表达量在12小时 后为牙髓组织的2倍，其表达水平较低，但在牙髓创伤治愈过程中均维持此低水平表达。在 牙髓创伤的治愈过程中，MMP1、MMP2、MMP14/MTI-MMPmRNA的表达量与正常牙髓组织基本相 同，未见表达水平的变化。MMPlOmRNA在正常和创伤牙髓组织中均未表达。由此可见，MMP3 的表达情况与创伤治愈的关系最为密切。另一方面，如图6B所示，VEGF的表达量在经治疗处置后上升了 3. 5倍，M小时后， 上升了 5倍，然后其表达量开始减少，72小时后，其表达量与正常牙髓组织相同。SDFl在M 小时后开始上升以至表达高峰，其表达量是正常组织的3. 5倍，表达水平较低。SDFl配体的受体CXCR4的表达量在M小时后达到正常牙髓组织的3. 5倍。3.牙髓创伤模型中，MMP3、SDF1、CXCR4表达的局部性在处置牙髓M小时、72小时后，用4%的多聚甲醛固定液进行灌流固定，然后浸泡 固定过夜。过夜后用OCT复合物(购于sakura，东京)包埋，制作12μπι厚的冷冻切片，最 后置于 APS Coated slide 上(Matsunami Glass ，大阪)。对 CXCR4 和 MMP3、MMP3 和 BSl-血凝素分别进行免疫荧光双重染色。将切片置于2%的H2A中反应20min，以消除内源性过氧化物酶的活性，再加入 10mg/ml blocking reagent (Invitrogen corporation, carlsbad，CA, USA)在室温下反 应1小时以消除非特异性反应，然后加入溶于Cangent 1 buffer (东洋纺，大阪)中的一 抗羊抗大鼠CXCR4 (Santa cruze、Santa Cruz，CA) (1 50)，室温反应1小时。反应完成 后，用PBT(PBS，0. 05% Tween20, ρΗ7· 4)洗涤3次，再加入Alexa488标记的二抗兔抗羊 IgG(Invitrogen) (1 200)，室温下反应1小时。反应完成后，用PBT洗涤3次，最后将切 片置于一抗小鼠抗大鼠MMP3中(第一化学，富山)(0.5 48/!111)，41过夜。过夜后，用PBT 洗涤3次，再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG，室温下反应1小时。反应结束后，用lOng/ml的 Hoechst 33342 (Sigma,St. Louis,MO,USA)细胞核染色 lOmin，最后用封片剂 prolong Gold antifade reagent (Invitrogen)封片。如图 7D-图 71 所示。为进一步研究MMP3与血管之间的关系，将冷冻切片置于20μ g/ml的proteinase K (Invitrogen)中，室温下反应6min，反应结束后用PBS洗涤3次，再用20 μ g/ml的 Fluorescein Griffonia(Bandeiraea)染色，染色完成后将切片置于 Simplicifolia lectin(BSl-lectin、vector laboratories, Burlingame, CA)中反应 15min。上面的 BSl-Iectin是用于对血管内皮细胞和血管内皮前体细胞进行染色。反应结束后，用PBS洗 涤3次，再按照所述方法对MMP3进行荧光染色。阴性对照只使用一抗和二抗。结果如图 7A-图7C所示。在切断活髓后，MMP3和CXCR4均未表达。图7J是活髓切断M小时后的牙髓创伤 面，经HE染色后的情况。图7K是活髓切断M小时后，牙髓断面下新生毛细血管和新生大 血管经HE染色后的情况。图7L是活髓切断72小时后，新生毛细血管和新生大血管经HE 染色后的情况。MV表示新生毛细血管，LV表示新生大血管。图7A为活髓切断M新生后，对MMP3及BSl-Iectin进行免疫荧光双重染色后 MMP3的图片。图7B为活髓切断M小时后，对MMP3及BSl-Iectin进行免疫荧光双重染色 后BSl-Iectin的图片。图7C为活髓切断M小时后，对MMP3及BSl-Iectin进行免疫荧光 双重染色后，经Merge处理的图片。如图7A-图7C所示，活髓切断M小时后，在牙髓创面 下，通过BSl-Iectin染色可见新生毛细血管和新生大血管已延伸至血管内皮细胞和血管 内皮前体细胞，且在新生血管周围表达有MMP3。图7D为活髓切断M小时，MMP3和CXCR4经免疫荧光双重染色后，MMP3的表达情 况。图7E为活髓切断M小时时，MMP3和CXCR4经免疫荧光双重染色后，CXCR4的表达情 况。图7F为活髓切断M小时时，MMP3和CXCR4经免疫荧光双重染色后，经Merge处理的 图片。图7G为MMP3和CXCR4经免疫荧光双重染色后，MMP3的放大图像。图71为MMP3和 CXCR4经免疫荧光双重染色后，经Merge处理的图片。CXCR4是SDFl配体的受体，在干细胞 中可表达，如图7D-图71所示，可见CXCR4靠近SDF1，表达具有局部性。在血管周围可见MMP3和CXCR4的重复表达。图7M为活髓切断M小时后，经原位杂交，MMP3mRNA在血管内皮细胞和血管内皮 前体细胞中的表达情况。图7N为活髓切断72小时后，经原位杂交，MMP3 mRNA在血管内 皮细胞和血管内皮前体细胞中的表达情况。如图M的箭头所示，在活髓切断M小时时，经 原位杂交，可见血管周围MMP3 mRNA大量表达。如图7N箭头所示，在活髓切断72小时时， MMP3 mRNA的表达量减弱。由此可见，牙髓干细胞迁移至牙髓创伤处，定居在血管周围，分泌 MMP3，通过旁分泌(paracrine)作用于血管内皮细胞，促进新生血管的形成。(应用实例2 MMP3在体外对血管内皮细胞和牙髓细胞的作用)1.MMP3促进血管内皮细胞增殖的作用将1000个源于人脐带血的血管内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells、HUVECs) (kurabo公司、大阪)接种至96孔细胞培养板上，在各种 EBM2 (cambrex Bio Science ffalkersville, Inc. ,ffalkersville,MD,USA)中培养(EBM2 中 可分另Ij添力口 MMP3 (50ng/ml、Chemicon，Temecula, CA)、NNGH (N-IsobutyI-N- (4-methoxyphe nylsulfonyl)) -glycylhydroxamic Acid) 0. 13 μ m, Biomol, Plymouth Meeting, PA)、MMP3 和 NNGH、MMPlO (50ng/ml, R&Dsystems, Minneapolis, MN)等共 4 种 EBM2)。添加 10 μ 1 的 Tetra-color one (Seikagaku Kogyo, Co.，东京)后，分别于 2，12，24，36，48，60 小时测定 450nm处的吸光度。未接种细胞的孔值做对照。图8A为体外，MMP3促进血管内皮细胞增殖情况的图片。图8B为体外，MMP3促进 血管内皮细胞迁移情况的图片。图8C为体外，MMP3对血管内皮细胞的抗凋亡作用的图片。 如图8A所示，添加MMP3后，可促进血管内皮细胞(HUVEC)的增殖。在MMP3添加组中，活髓 切断48小时的增殖效果与添加2小时进行比较，前者增加了约10倍。在未添加MMP3组中， 活髓切断48小时的增殖效果与切断2小时比较，约增加了 5倍。所述数值均具有统计学差 异(P < 0. 01)。另一方面，同时添加NNGH(MMP3的特异抑制剂)时，在各个时间点上，MMP3 刺激细胞增殖的活性均被抑制。添加NNGH组的增殖效果与未添加MMP3组进行比较，结果 显示二者几乎无差异。另外，MMP3对HUVEC的增殖促进作用与添加VEGF-A(50ng/ml)组基 本相同。2. MMP3对血管内皮细胞的迁移促进作用在24 孔 PET 膜(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)上，37°C条件下，进行 24 小 时的Modified Boyden Chamber 实验。分别在 10ng/ml 的MMP3 或 100ng/ml 的MMP3 或 IOOng/ ml 的 MMP3 与 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50ng/ml 的 MMPlO 或 50ng/ml 的 MMPlO 和 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50 μ g/ml 的 VEGF-A 存在下，将 5 X IO4 的 HUVEC 置于 Chamber 的上部进行培养。0. 02%小牛血清白蛋白(Sigma)做对照。培养完成后，使用胰蛋白酶剥离 迁移至filter下部的HUVEC并进行细胞计数。用橡胶刮刀(Scraper)的将残留在filter 上部未迁移的细胞刮掉。实验数据用4个样品的平均值士SD来表示。结果如图8B所示。如图8B所示，在lOng/ml水平下，MMP3对HUVE的迁移促进作用与对照组比较无 统计学差异。在lOOng/ml水平下，MMP3的迁移促进作用是对照组的3. 5倍且有统计学差 异(P < 0. 01)。100ng/ml的VEGF对细胞迁移的促进作用约为对照组的2倍且有统计学差 异(ρ <0.01)。也就是说，MMP3具有浓度依赖性，确实具有迁移促进作用。另外，若在添加 MMP3的同时添加NNGH，其促进迁移作用受到抑制。
3. MMP3对血管内皮细胞凋亡的抑制作用为研究MMP3的凋亡抑制作用，将HUVEC置于EGM2中，用；35_ dish培养3天， 接着在分别加有 50ng/ml 的 MMP3 或 50ng/ml 的 MMP3 和 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50ng/ml 的 MMPlO 或 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50ng/ml 的 VEGF-A 的 EBM-2 中添加 IOOnM 的星型胞 菌素(staurosporine) (Sigma)，诱导细胞凋亡。NNGH在添加MMP3的30min前加入。在 Stauroporine存在下，未添加任何成分的EBM-2中培养的细胞做对照。4小时后，剥离 HUVEC，在所得细胞悬液中加入 Annexin V-FITC (Roche)和 Propidium Iodide(Sigma)作用 15min，然后使用flow cytometer JSAN(Bay Bioscience，神户)测定坏死和凋亡细胞的比 例。每个数据测量3次，取典型数据作为实验结果如图8C所示。如图8C所示，HUVEC中加入IOOnM的Mauroporine诱导细胞凋亡4小时后，52 %的 细胞出现凋亡现象。同时添加Mauroporine与MMP3时，凋亡细胞的比例减少至20%，与添 加VEGF-A的结果相同，均出现了凋亡抑制现象。同时添加NNGH时，其抑制凋亡的作用受到 抑制。MMP10/Stromelysin-2 是MMP3 的异构体。如图 8A-图 8C 所示，MMP10/^tromelysin_2 实验组中未观察到MMP3实验组中所见的细胞增殖、细胞迁移、凋亡抑制现象。4. MMP3诱导牙髓细胞分化为成齿质细胞的功能从大鼠上颚切齿中，用酶解法(胰蛋白酶和胶原酶)分离得到的牙髓细胞，在含 有 100 单位 /ml 的 penicillin G> 100 μ g/ml 的 dtreptomycin (Invtrogen, Carlsbad, CA, USA) >50 μ g/ml 的 Magnesium ascorbyl phosphate (禾口光纯药)禾口 10% (v/v)小牛白血i青 (SAFC Biosciences, Lenexa, Kansas, USA)的 DMEM(Sigma，St. Louis，M0，USA)中培养。二 次传代细胞铺满(confluent)后，添加 100ng/ml 的 MMP3 或 0. 13 μ mol 的 NNGH 和 50ng/ml 的重组人BMP2。14天或21天后，提取RNA，使用Real time RT-PCR来分析成齿质细胞的分 化标志、Dentin Sialophosphotein (Dspp)及 enamelysin 的表达情况(如表 1 所示)。所 述物质的表达量，用标准β-actin值η与大鼠第二代牙髓细胞铺满(confluent)时的比值 来表示。添加MMP3实验组与对照组比较，14天和21天后，均未观察到细胞分化为成齿质细 胞的现象。因此，根据所述实验结果，在大鼠牙髓创伤治愈过程中，MMP3可促进血管内皮细 胞 血管内皮前体细胞向创伤局部迁移、增殖、抗凋亡，同时在血管新生、象牙质及牙髓再生 过程中可能发挥作用。(应用实例3在大鼠及狗活髓切断模型中，体内MMP3对象牙质 牙髓再生促进作 用)1.在大鼠活髓切断模型中添加MMP3切断大鼠上颚切齿，用生理盐水清洗断面，在明胶(gelafusal)内添加50ng的 MMP3,然后用于断面的牙髓表面上。将50ng的MMP3及30nmol的NNGH加至明胶上，用 于断面牙髓的表面作为实验对照。最后将粘合剂涂布于表面，再用光聚合型composite resin (Unifillow flow、GC、东京)暂封。接着分别于M小时、72小时、7天后制作5 μ m 厚的石蜡切片，然后做HE染色或马松三色染色，进行形态学观察。新生血管的定量检测 如下取4颗牙齿分别制作40张切片，经MMP3及PBS处理M小时后，每颗牙齿选取5张 切片用 FluoresceinGriffonia (Bandeirase) Simplicifolia lectin (BSl-Iectin)染色。 在每颗牙齿的5张切片的断面下方的牙髓组织上，选取面积为0. Imm2的矩形区域。使用KeyenceBZ-9000荧光显微镜(Keyence，东京)的BZ-II Anaalyzer (Keyence)软件对总面积 为1. 5mm2的lectin阳性区域进行定量分析。实验数据用4颗牙齿所得数据的平均值士SD 来表示。为研究MMP3对细胞增殖的促进作用，通过PCNA(proliferating Cell Nuclear Antigen)法，进行免疫组化分析。将切断牙髓M小时后制作的石蜡切片进行脱蜡处理，按 照标准操作方法，使用抗原修复液(vectorlaboratories，Burlingame, CA)进行抗原修复。 同时需封闭内源性过氧化物酶活性及非特异性染色。切片中加入抗PCNA抗体(Dako)，4°C 孵育过夜，抗PCNA抗体使用时需用抗体稀释液进行1 100稀释。孵育过夜后加入过氧 化物酶标记的二抗(ImmPRESS reagent ；Vector Laboratories)室温孵育 30min。用 DBA Liquid System显色后，再用苏木精进行对比染色，然后用Olympus Vanox-s显微镜(购于 Olympus公司，东京)拍照。增殖细胞的定量分析方法如下用MMP3和PBS处理M小时后， 从每个牙齿的3张石蜡切片断面下方的牙髓组织上部，取3个面积为0. Imm2的矩形区域。 对染色阳性细胞进行细胞计数、定量分析。细胞外基质的定量分析如下分别取4颗切齿 的5张切片，经MMP3、NNGH、PBS处理，7天后，进行马松三色染色。在阳性区域中，对断面下 Ornm深)的上部牙髓组织，用BZ-II Analyzer软件进行定量分析。实验数据用4颗牙齿的 平均值士 SD来表示。通过实验来验证MMP3在机体内是否能诱导牙髓创伤部位产生新生血管。在大鼠 切齿牙髓处分别加入MMP3、MMP3与NNGH，PBS为阴性对照。图9A为大鼠活髓切断后加入 MMP3,24小时后再经BSl-Iectin染色后的图片。图9B为大鼠活髓切断后未使用MMP3J4 小时后，再经BSl-Iectin染色后的图片。添加MMP3的实验组与未使用MMP3组进行比较， 在M小时后经BSl-Iectin染色，牙髓断面下形成了大量的新生血管。图9C为大鼠活髓断面下的上方牙髓组织，通过使用MMP3使其血管密度增加的定 量显示图。如图9C所示，MMP3使用组与PBS对照组比较，其新生血管的密度增加了 2倍并 有统计学差异。图9D为大鼠活髓切断处加入MMP3 24小时后，PCNA的免疫染色图片。图9E为 大鼠活髓切断后未使用时后，PCNA的免疫染色图片。MMP3使用组细胞密度为 98. 5cells/mm2士 17. 7，MMP 3 未使用组(PBS 对照组)为 36. Ocells/mm2士 14. 1。也就是说， MMP3使用组与PBS对照组比较，在其创面下牙髓组织中，PCNA染色阳性的增殖细胞是对照 组的2. 7倍。另外，在其断面下方可观察到大量的PCNA染色阳性细胞。图9F为大鼠活髓切断处加入MMP3 72小时后的HE染色图片。图9G为大鼠活髓 切断处未使用MMP3，72小时后的HE染色图片。如上图所示，MMP3使用组与未使用组比较， 前者已形成了大量的骨样象牙质。2组均未出现炎症性细胞浸润。图9H为大鼠活髓切断处加入MMP3 72小时后，经马松三色染色的图片。如图9H 所示，72小时后，在MMP3使用组中，新分化的成齿质细胞/骨样成齿质细胞周围可观察到骨 样象牙质的形成。图91为大鼠活髓切断处加入MMP3 72小时后，原位杂交的图片。如图91所示，原 位杂交图片显示，在骨样象牙质基质周围新近分化的成齿质细胞/骨样成齿质细胞中已有 DSPP mRNA的表达。图9J为大鼠活髓齿切断72小时后，未添加MMP3，经马松染色的染色图。如图9J 所示，PBS添加组及MMP3周围观察不到成齿质细胞/骨样成齿质细胞。
图9K为大鼠活髓切断72小时后，添加MMP3及NNGH，经马松染色的染色图。如图 9K所示，MMP3及NNGH添加组周围观察不到成齿质细胞/骨样成齿质细胞。图9L为大鼠活髓切断后未加入MMP37天后经马松三色染色的图片。如图9L所示， 未使用MMP3组(PBS对照组)未观察到成齿质细胞/骨样成齿质细胞。图9M为大鼠活髓切断后加入MMP3和NNGH 7天后经马松三色染色的图片。如图 9M所示，在使用MMP3和NNGH组中，未见成齿质细胞/骨样成齿质细胞的形成。图9N为大鼠活髓切断后加入MMP3和NNGH 72小时后，胶原蛋白基质增加情况的 图片。如图9N所示，72小时后，在 断面下象牙质基质的形成方面，MMP3使用组与PBS对照 组比较，前者增加了 3. 8倍并具有统计学差异(P < 0. 01)。图90为大鼠活髓切断后加入MMP3 7天后，胶原蛋白基质增加情况的图片。如 图90所示，NNGH添加组与PBS对照组比较，象牙质基质形成受到抑制且有统计学差异(*P < 0. 01)。所述现象可能是由于MMP3可促进修复性象牙质的形成，后者又会促进新生血管 的形成，而不能直接促进成齿质细胞的分化。2.在狗活髓切断模型中加入MMP3的情况将狗上颚臼齿活髓切断后，用5%的亚氯酸钠和3%过氧化氢交替清洗断面后再 用生理盐水清洗断面，把加有IOOng MMP3的明胶涂于牙髓断面上。接着填充磷酸粘固粉， 再将粘合剂涂布于表面，最后用光聚合型composite resin暂封。14天后拔牙，在4%多聚 甲醛固定液中4°C浸泡、过夜固定后，4°C下在10%蚁酸中脱钙1周。制作标本纵断面5μπι 厚的石蜡切片，经HE染色后在光学显微镜下观察象牙质的形成情况，结果如图IOA-图IOE 所示。图IOA为狗上颚臼齿活髓切断后添加ΜΜΡ3，第14天时，显示修复性象牙质(tertiary dentin)形成的显微照片。OD代表骨样象牙质。图IOB为狗上颚臼齿活髓切断后添加MMP3， 第14天时修复性象牙质形成的高倍显微照片。图IOC为狗上颚臼齿活髓切断后添加MMP3， 第14天时修复性象牙质形成的超高倍显微照片。图IOD为狗上颚白齿活髓切断后PBS控 制时第14天时的显微照片。图IOE为狗上颚臼齿活髓切断后加入PBS控制时第14天时的 高倍显微照片。如图IOA-图IOC所示，在MMP3添加组中，牙髓断面附近可见大量增殖细胞，其上 部可见大量修复性象牙质的形成。可是在PBS对照组中，如图IOD和图IOE所示，未见修复 性象牙质的形成。(应用实例4在狗牙髓炎模型中，象牙质·牙髓的再生)将发生牙髓炎的狗上颚白齿活髓切断后，把棉球置于牙髓断面上，在开放状态下 放置M小时。接着用5%亚盐酸纳溶液和3%的过氧化氢溶液交替清洗牙髓断面，然后用 生理盐水清洗，洗净后，把加有100ngMMP3的明胶涂于牙髓断面上。接着填充磷酸粘固粉， 再将粘合剂涂布于表面，最后用光聚合型composite resin暂封。14天后拔牙，4°C浸泡固 定过夜，4°C下在10%蚁酸中脱钙1周。脱钙完成后，制作5μπι厚的石蜡切片、进行HE染 色，最后在光学显微镜下观察修复性象牙质的形成情况，结果如图IlA-图IlD所示。图IlA 为在患有牙髓炎的狗上颚臼齿中加入ΜΜΡ3，14天后，显示炎症治愈情况的显微照片。图IlB 为患有牙髓炎的狗上颚臼齿中加入ΜΜΡ3，14天后，显示炎症治愈情况的高倍显微照片。图 IlC为患有牙髓炎的狗上颚臼齿中PBS控制时14天后的显微照片。图IlD为患有牙髓炎的 狗上颚臼齿中PBS控制时14天后的高倍显微照片。
如图IlA和图IlB所示，在MMP3添加组中，牙髓的炎症程度非常轻，在牙髓断面附 近可见细胞增殖，同时MMP3还促进了新生血管的形成。另外，还可观察到一些修复性象牙 质的形成。而在PBS对照组中，如图IlC和图IlD所示，炎症情况未见好转。因此，本发明提 供的药剂和牙科材料不仅具有促进损伤牙髓再生的功效，同时对牙髓炎还具有抗消炎、镇 静作用，促进新生血管的形成以及牙髓再生的作用。牙髓出现创伤与牙髓炎出现炎症是两 种不同的状态。在创伤(机械性创伤)治疗时不会发生感染，局部炎症细胞浸润一旦开始， 创伤组织则趋向治愈。另一方面，由牙髓炎引起的炎症具有感染症状，为排除机体异物，机 体的免疫防御系统被启动，根据感染物质的质和量，引发了以嗜中性粒细胞、巨噬细胞为首 的炎症性细胞浸润。牙髓组织的血管处于扩张状态，毛细血管的通透性增加。毛细血管通 透性的增加，血液成分会渗出(炎症性渗出)，结果引起间质压力增高。进而，免疫细胞产生 的炎症介质、蛋白酶组成一个复杂的网络，引起进一步的炎症恶化及组织坏死。在牙髓因创 伤产生的炎症和牙髓炎引起的炎症二种情况下，二者炎症性介质的表达情况是不同的。(应 用实例5 穴加工硅酮膜的成齿质细胞的分化)将机体亲和性高、具有氧透过性的硅酮(silicone)膜的表面进行等离子化 (plasma)处理，在其表面制成宽7 μ m、深7 μ m、节距(pitch) 20 μ m的小孔(参照图IA 图1C)，然后进行胶原蛋白涂层(Collagen Coat)处理。将源于猪牙髓的⑶31_ ;OT146_SP 细胞高密度地吸附于硅酮膜上，然后在含有10%小牛血清、50yg/ml的抗坏血酸的 Dy lbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基培养12小时。培养后的细胞形态如 图12A所示。图12A为附着在凹面硅酮膜载体上的源于猪的⑶31_;⑶146_SP细胞，培养12 小时后，相差显微镜观察的照片。培养完成后，在Container中注满培养基，使用氟树脂封 闭，然后从外部对膜表面进行单方向垂直加压，加压时，弱加压操作(引起弱压力刺激)与 强加压操作(引起强压刺激)分别进行6小时，弱加压操作和强加压操作的频率分别为每 分钟加压6次和每分钟加压10次以上。另外，牙髓⑶3Γ ；⑶146—SP细胞的采集方法如下将猪牙髓组织摘除后利用胶 原酶解法(Nakashima M. Archs oral Biol. 36 (9)，655-663，1991)酶解、分离细胞。细胞 分离后，用流式细胞仪，通过⑶31和⑶146抗体从强烈排出Hoechst 33342的组分(Side Population(SP))中分选出CD31_ ;CD146_SP细胞。分选后的细胞接种至coated collagen dish 上，在添加 10 % 小牛血清、insulin-likegrowth factor-1 (IGF-I)和 Epidermal Growth factor (EGF)的 EBM2 培养基中培养。图12B为培养2天后，显示β -actin、Dspp、Enamelysin的mRNA表达情况 的图片。如图12B所示，培养2天时，膜上的细胞排列紧密，Enamelysin和Dentin sialophosphoprotein (Dspp)等的mRNA已表达，已分化诱导为成齿质细胞。尤其是经弱加 压刺激处理过的细胞，能有效地对其进行分化诱导。产业利用价值本发明具有很好的消炎镇静作用，对于发生炎症龋齿的牙髓炎也具有能适当恢复 牙髓功能的作用。另外，因本发明具有很好的促进血管新生、牙髓再生及象牙质形成作用， 所以，完全可以用于创伤性象牙质的治疗、修复领域。
权利要求
1.一种用于治疗牙髓炎和/或促进象牙质形成的药剂，其特征在于，含有有效成分，其 中，该有效成分至少含有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前 体蛋白中的任意一种。
2.如权利要求1所述的药剂，其特征在于，有效成分的含量比例为12ng/ml IOOOng/ ml，其中，该有效成分至少含有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白 酶-3前体蛋白中的任意一种。
3.一种牙科材料，其特征在于，含有有效成分，其中，该有效成分至少包括具有基质金 属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一种。
4.如权利要求3所述的牙科材料，其特征在于，含有机体亲和性载体。
5.如权利要求4所述的牙科材料，其特征在于，上述载体的一侧纵向排列多个同一指 向的凹形结构，此载体系由氧透过性及/或物质透过性的材料制成的膜状载体。
6.如权利要求4所述的牙科材料，其特征在于，所述载体至少含有下列中的任意一种 胶原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱、透明质酸、几丁 质、氨基葡萄糖、纤连蛋白、海藻酸、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、磷酸钙、羟基磷灰石、 β-TCP、多聚乳酸、聚乙醇酸、DL-聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、多晶硅、聚已酸 内酯、碳酸钙、钛、金、陶瓷、硅树脂、以及硅水凝胶。
7.如权利要求3所述的牙科材料，其特征在于，至少还含有牙髓细胞、牙髓干细胞、牙 髓前体细胞、可分化为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞以及可分化为成齿质细胞的细胞中的 任意一种。
8.如权利要求7所述的牙科材料，其特征在于，细胞含量在1X IO3个/ μ 1 1 X IO6个 /μ ι之间，其中，该细胞至少含有所述牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、可分化为牙髓 细胞的细胞、成齿质细胞以及可分化为成齿质细胞的细胞中的任意一种。
9.如权利要求3所述的牙科材料，其特征在于，还含有血管内皮细胞或血管内皮前体 细胞。
10.如权利要求3所述的牙科材料，其特征在于，还含有上皮细胞。
11.如权利要求3所述的牙科材料，其特征在于，还含有象牙质基质。
12.如权利要求3所述的牙科材料，其特征在于，有效成分的含量比例为12ng/ml lOOOng/ml，其中，该有效成分至少含有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金 属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一种。
13.如权利要求7所述的牙科材料，其特征在于，所述牙髓干细胞至少包含牙髓SP细 胞、⑶3Γ ；⑶146-SP细胞、⑶M+细胞、⑶105+细胞、⑶150+细胞中的任意一种。
14.一种用于治疗牙髓炎以及/或促进象牙质形成的药剂的有效成分的筛选方法，在 牙髓干细胞或血管内皮细胞中添加被检验化合物，然后测定牙髓干细胞或血管内皮细胞中 的基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量；牙髓干细胞或血管内皮细胞中没有添加被检验 化合物时，测定基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量；将两者基质金属蛋白酶-3编码基因 的表达量进行比较，以将基质金属蛋白酶-3编码基因表现量所增加的被检验化合物作为 所述药剂的有效成分进行选择。
全文摘要
本发明提供了一种用于治疗牙髓炎和/或促进象牙质形成的牙科材料。根据本发明的牙科材料至少含有具有基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase，MMP-3)活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白(即酶原)的任意一种；另外，根据本发明的牙科材料含有机体亲和性载体；根据本发明的牙科材料中至少含有牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、能分化为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞(odontoblast)以及能分化为成齿质细胞的细胞的任意一种。
文档编号G01N33/50GK102046194SQ20098011224
公开日2011年5月4日 申请日期2009年4月6日 优先权日2008年4月7日
发明者中岛美砂子, 中村洋 申请人:独立行政法人国立长寿医疗研究中心