一种制备链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法

专利名称：一种制备链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法
技术领域：
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及新型链霉亲和素标记的藻红蓝 蛋白类荧光蛋白质的制备方法。
技术背景藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin )通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670mn的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB ) ; PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。PEC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley AJ, Glazer AN.Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptidephycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J" Bacteriol. 2002;184(17) : 4666 4671)。 PCB生物合成基因由力o7和pc州组成，可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产PCB (F. T. Undgraf, C. Forreiter, et al. Recombinant holophytochrome inEcherichia coli [J]. FEBS Letters, 2001, 508:459-462)。与前人的方法不同，我们发现力/7aZ^e/7a sp. PCC7120中aA^339基因编码betal55裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的betal55裂合酶。这些betal55裂合酶能催化PCB与PEC的beta亚基及其同源蛋白质的155位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合，从而生成具有优良荧光性质
的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。通过基因工程技术，把链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白亚基脱 辅基蛋白基因拼接后克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋 白亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，直接实现链链霉亲和素和藻红蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连 接，而不需要通过化学交联等方法来实现链霉亲和素标记。藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。藻红蓝蛋白 类荧光蛋白质具有优良的荧光性质，通过直接实现链链霉亲和素和藻红蓝蛋白亚基脱辅基 蛋白的连接，可用于生物学检测以及医疗检测领域。本发明为藻红蓝蛋白类色素蛋白质功 能材料应用于医药和生物工程领域，特别是检测领域奠定了基础。发明内容本发明的目的在于提供分子设计制备新型链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法。它是应用betal55裂合酶催化PCB与链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。将含有betal55裂合酶基因、链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接的基因、PCB生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过如此设计的基因工程菌生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。为实现上述发明目的，本发明的技术方案是这样的 一种制备链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，包括下述步骤(1) 用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得 到beta裂合酶表达质粒；(2) 用基因工程方法将藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因和链霉亲和素基 因拼接后克隆于第二个表达载体中，可以表达链霉亲和素和藻红蓝蛋白的融合蛋白，得到 链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(3) 用基因工程方法将PCB生物合成酶基因力o7和；x^4或其同源基因同时克隆于第 三个表达载体中或分别克隆于第三、第四个表达载体中，得到PCB合成质粒；(4) 将betal55裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、PCB生 物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程 菌，应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻 红蓝蛋白类荧光蛋白质。上述的制备链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法中所述的宿主菌为大 肠杆菌。所述的betal55裂合酶基因是指与^7aZ^e/ a sp. PCC7120中a7J5"J，效基因同源 的基因。所述的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与^a6ae/73 sp. PCC7120或 M.laminosus sp. PCC7603中/pecB基因同源的基因。本发明与现有技术相比，具有以下优点1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，大肠杆菌繁殖快，可以大大缩短周期；2、 与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；3、 通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质 类似的蛋白，提取方便；4、 方便进行藻胆蛋白分子设计，有利于发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料。


图1为本发明中A115339催化下生成的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的 吸收与荧光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
具体实施方式
下面以实例对本发明作进一步详细地说明。 实施例1(1) 从GeneBank中可以査到，藻种/l朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， ^ 7a/z i/7os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。^朋Z ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必^T j'/7o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力朋tee;73 sp.PCC7120中的 aL^ 滞基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a〃M滞，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^7a6a朋a sp. PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-sa-链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o/和pc//0克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即链霉亲和素基因幼在pET30中在A>/7l和^^1I两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基 因/ ec;9是在fcoRV和i w I两个酶切位点之间；裂合酶基因a^5JJ^在pCDFDuet中，处 于第二个多克隆位点，酶切位点是5g7II和/力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc州)， 它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力W处于第一个多克隆位点，在Afco I和,"I之间， pcj^在第二个多克隆位点，在M/e I和J/ o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-a^5JJ久pET30-sa^eM和pACYCDuet-力o7-转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至0a。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-{3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。其吸收与荧 光光谱见附图l所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养基， 37。C振荡培养过夜；取100pL饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37'C振荡培养至 0D6。。=0. 3 0.4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10min;离心lmin (10000g， 4'C)弃去上清，收集沉淀菌体；用lmL预冷的O.lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体，离心 30s(10000g， 4。C)去上清，菌体沉淀用100nL预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰上， 加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30min， 42。C热休克90s，冰浴5min后加入 300)aLLB培养基，37。C低速振荡培养45min，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平 板上，倒置于37'C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；分别从中取100pL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37"振荡培养至006。。=0. 5-0. 7时，冰浴约30min，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、 150转/分，表达约12小时。离心
收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进 行大量表达。 实施例2G)从GeneBank中可以查到，藻种力朋力朋/73 sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M 7柳i;7asiAS sp. PCC7603部分序列已经测定。^/7a6ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，傲^3/w'77oms"sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋6ae/73 sp.PCC7120中的 W^5J^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a775JJA在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将力朋力朋朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5 (C84A)和链 霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-sa-pec5(C84A)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠 杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标 记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-/ cW，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因sa在pET30中在A>7l和《^n两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基 因/ ecMC84A)是在AcoRV和J力o I两个酶切位点之间；裂合酶基因a"5^J9在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^^II和; PCB合成酶基因是2个(力o/和 pc/力)，它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力W处于第一个多克隆位点，在；Vco I和尸" I之间，/ c^在第二个多克隆位点，在yWel和之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-aJ75"風pET30-i; ec5 (C84A)和pACYCDuet-力o7-p一转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0Ds。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l隱ol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例3(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^aAse朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， M〗a/w'/ os〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M 7a/M7 os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力朋6朋y7a sp.PCC7120中的 a775J，效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-s775^J^，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将必Z3/w'/7M^ sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因/ ec^和链霉亲 和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pcy/I)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-p《W，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因^在pET30中在A>/71和力WII两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因pec5是在^boRV和两个酶切位点之间；裂合酶基因a"5^39在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是5《711和Wo I ; PCB合成酶基因是2个(力W和pc/"，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸st I之间，pc/力在第二个多克隆位点，在AWe I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-a^5JJ义pET30-sa""/ e^和pACYCDuet-力o7-p《W转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37X:振荡培养至0D咖为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩rophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1國1/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例4
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种」朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， yK 7a7 j'y osiAs sp. PCC7603部分序列已经测定。^/Ja6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，脱2a奶'/7os^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7s/^ez^ sp.PCC7120中的 a^5"J3^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a7753J51，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将M 7a历i/7o幼s sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因(C84A) 和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质 粒叫pET30-^-pec万(C84A)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后， 在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲 和素标记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o/和pooO克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l
中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-/5C7A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因^在pET30中在j/wi和《^n两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因pec5(C84A)是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间；裂合酶基因a^5"J^^在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^"7II和^力o1 ; PCB合成酶基因是2个(力o7和 pc州)，它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o/处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸" I之间，pc/力在第二个多克隆位点，在AWel和i7wI之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-a"5息pET30-sa~pec"C84A)和pACYCDuet-力o7-/ 一转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例5(1) 从GeneBank中可以査到，藻种」朋6朋朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， yK 7柳y/ o犯s sp. PCC7603部分序列己经测定。^ a力ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，;)/. J柳i; awssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力朋力a朋a sp.PCC7120中的 a775"J^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-3W533A在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^7aA朋朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质粒叫 pCOLADuet-sa-pec5，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记 的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pcj^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-/w/-/7C/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因pec^拼接后连接到pCOLADuet的￡boR I和 /^tl之间；裂合酶基因sW53，效在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是 i^7II禾n J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和/ c州)，它们在同一个载体pACYCDuet-1 中，力o7处于第一个多克隆位点，在；VcoI和尸Wl之间，pc^在第二个多克隆位点，在 AWeI和iT oI之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-3"5^3义pCOLADuet-s^"pecS和pACYCDuet-Zzo7-pc;^转入大肠杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB 培养基中，37t:振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmraol/L， 20。C至37'C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例6(1)从GeneBank中可以查到，藻种」朋6朋朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成，yK 7a/z/i/70OTs sp. PCC7603部分序列已经测定。^ a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，必7柳iy o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7s/^朋a sp.PCC7120中的 a7J5^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a^5^^A在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^朋力se朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因； ec^ (C84A)和链 霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质 粒叫pCOLADuet-sa-peM (C84A)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接 后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链 霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-Z o7-;x^A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因pec沃C84A)拼接后连接到pC0LADuet的￡coR I和尸sH之间；裂合酶基因W^^39在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位 点是和X力o I ; PCB合成酶基因是2个(/ o/和pcW)，它们在同一个载体pACYCDuet-l 中，力o7处于第一个多克隆位点，在7fcoI和尸stl之间，pc^在第二个多克隆位点，在 肠I禾口勘I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet—a775^3久pC0LADuet-stpec5 (C84A)禾卩pACYCDuet-/ o7—转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH 7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8,加入异丙基硫代-f3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lramol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例7(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力朋6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 必Ja/zu'/7ows印.PCC7603部分序列已经测定。力朋6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，尨J柳j'/7owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将如a6a朋s sp.PCC7120中的 W^5^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-W75JJ"在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将必Ja啦'/7oms sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5和链霉亲 和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所得质粒叫 pCOLADuet-链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记 的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-/ o/-/ c/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因pec^拼接后连接到pC0LADuet的v5boR I和 尸"I之间；裂合酶基因aW5JJ9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是 ^g^n禾卩J力ol ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcW)，它们在同一个载体pACYCDuet-l 中，力o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和尸Wl之间，pc^在第二个多克隆位点，在 胁I和勘I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-a^5J朋、pC0LADuet-sa^pec^和pACYCDuet-/ o7-pc_M转入大肠杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB 培养基中，37"C振荡培养至0D6。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-13-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集 菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到 相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例8(1) 从GeneBank中可以査到，藻种J"a6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， Ja肌'/ os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。力"a6ae77a sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，必7a/w'/7osi/ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7Wae朋sp.PCC7120中的 s7i5"JJ5"基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-s775J3义在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将尨h历2'/70SM sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因(C84A) 和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所 得质粒叫pC0LADuet-sa-pec^ (C84A)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因 拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得 到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(/w/和； cW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7了《W,在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因幼和脱辅基蛋白基因pec汉C84A)拼接后连接到pC0LADuet的fcoR I和尸stl之间；裂合酶基因a775JJ9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位 点是和i7 o I ; PCB合成酶基因是2个(/ o7和pcW)，它们在同一个载体pACYCDuet-l 中，力o7处于第一个多克隆位点，在vVcoI和尸WI之间，pc州在第二个多克隆位点，在 她I禾口 J/ 。I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分
别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-aLZM激、pC0LADuet-st; ecS (C84A)和pACYCDuet-力o/-pc/力转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例9(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力朋力朋/7a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必J柳i/ as"s sp. PCC7603部分序列已经测定。力/7a&e朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，尨Ja/w'/w幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^ s6朋朋sp.PCC7120中的 W75^39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a7753JA在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^73&e朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-pe^，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-/w/，在大肠杆菌中能表达H01 。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc;^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-;5c州，在大肠杆菌中能表达PcyA。即脱辅基蛋白基因peM在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因m在1和《^n两个酶切位点之间；裂合酶基因a^5^J^在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是^^/II和lol ;PCB合成酶基因是2个(力W和pc/"， Z o7在pACYCDuet-l中，处于第一个多克隆位点，在Afcol和尸W I之间，pcy/1在pETDuet-1 中第二个多克隆位点，在M/e I和/力01之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-aL 5JJ久pET30-sa"pec5和pACYCDuet-力o厶pETDuet-; c州转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0 的LB培养基中，37"振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N;T亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例10(1)从GeneBank中可以査到，藻种j/7afee朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必7柳众os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。J朋&e朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，yf/. 7a啦'"osiASsp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254, 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将」朋&e朋sp.PCC7120中的 a7753J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a775339，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^7s6ae朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5 (C84A)和链 霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-/7M^(C84A)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠 杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标 记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 Zw7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01 。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc^，在大肠杆菌中能表达PcyA。即脱辅基蛋白基因pe^(C84A)在pET30中是在fcoRV和I力o I两个酶切位点之间， 链霉亲和素基因sa在和^WII两个酶切位点之间；裂合酶基因W75^J9在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^5^n和; PCB合成酶基因是2个(力W和 pc/力)，Z o7在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在〃co I禾Q尸"I之间，pc州在 pETDuet-1中第二个多克隆位点，在AWe I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-a^5^JR pET30-s^/ ec5(C84A)和pACYCDuet-力o7、 pETDuet-pc/Z 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至OD6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L, 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白 B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析， 可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例11(1)从GeneBank中可以査到，藻种^ s力ae"a sp. PCC7120的全序列已经测定完成，7a肌V os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。/I朋tee/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必7a肌'"osi/s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^7stee"s sp.PCC7120中的 a^5^c^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a^^^"在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将必Ja肌'/7oms sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^和链霉亲 和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱 辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01 。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcy/l克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pcj^，在大肠杆菌中能表达PcyA。即脱辅基蛋白基因pe"在pET30中是在fcoRV和J力oI两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在tT/m I和万^HI两个酶切位点之间；裂合酶基因a775JJ9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是SWII和/力o1 ;PCB合成酶基因是2个(力o7和pcW), /w/在pACYCDuet-l中，处于第一个多克隆位点，在Afco I和At I之间，pc州在pETDuet-1 中第二个多克隆位点，在;Wel和/力oI之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-a^5^J久pET30-sa"/ ecS和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pc/力转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH7.0
的LB培养基中，37。C振荡培养至006。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L, 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例12(1) 从GeneBank中可以查到，藻种細6細a sp, PCC7120的全序列已经测定完成， 必7柳i/7os〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。/l朋Z^e/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M JaTM'/70^ys sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力朋力朋朋sp.PCC7120中的 a^5^3^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-3刃M滞，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^/w'加幼s sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^ (C84A) 和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质 粒叫pET30-幼-pec5 (C84A)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后， 在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲 和素标记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01 。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcj^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc7A在大肠杆菌中能表达PcyA。即脱辅基蛋白基因pec^(C84A)在pET30中是在fcoRV和J/ o I两个酶切位点之间，链霉亲和素基因sa在,p/ I和5^1I两个酶切位点之间；裂合酶基因W7^^9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是^WII和io1 ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcyyO，力o7在pACYCDuet-l中，处于第一个多克隆位点，在Afco I和At I之间，pcj^在pETDuet-l中第二个多克隆位点，在I和/力o I之间。 基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-aWMJA pET30-sa"pec5(C84A)和pACYCDuet-力o厶pETDuet—pc州 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至ODe。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(is叩rophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白 B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析， 可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例13(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^"steena sp. PCC7120的全序列己经测定完成， h/w'/ o犯s sp. PCC7603部分序列已经测定。^ a6ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，必/a肌V ow5"sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将^朋6se朋sp.PCC7120中的 a775^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a^5^Jft在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将^7a&e朋sp. PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5和链霉亲和素 基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所得质粒叫 pCOLADuet-链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记 的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，
所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达HOI 。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 z c/力克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-/7cW，在大肠杆菌中能表达PcyA。即链霉亲和素基因5"s和脱辅基蛋白基因^M拼接后连接到pCOLADuet的^bdU和 户"I之间；裂合酶基因aW5JJ9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是 A《7II和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o/和pc^)，力o/在pACYCDuet-1中，处于第 一个多克隆位点，在Afco I和At I之间，pc/力在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在AW I和之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet-a^5^滞、pCOLADuet-和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pc/力 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至ODe。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白 B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析， 可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例14(1)从GeneBank中可以査到，藻种J/7a/ ae/7a sp. PCC7120的全序列已经测定完成，^ h/772'/7asiAS sp. PCC7603部分序列已经测定。」朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，必h/M'/ osi/ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将/I朋tee/7a sp. PCC7120中的a^MJ^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-aW5MA在大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将A7a&e朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5 (C84A)和链 霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质 粒叫pCOLADuet-幼-pec5 (C84A)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接 后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链 霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 7 o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力W，在大肠杆菌中能表达HOl。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc_M，在大肠杆菌中能表达PcyA。即链霉亲和素基因幼和脱辅基蛋白基因W"(C84A)拼接后连接到pCOLADuet的iboR I和之间；裂合酶基因a^5JJ^在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位 点是^7II和J/wI; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc/"，力o7在pACYCDuet-1中，处 于第一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间，pcj^在pETDuet-1中第二个多克隆位点， 在AWeI和之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pCDFDuet-a775^J9、 pC0LADuet-sa~pec5 ( C84A )和pACYCDuet-力o7 、 pETDuet-pc^转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此 工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫 代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆 素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通 过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素 -藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例15(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^7aAae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M 7a/w'"os〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。//朋6ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M 7柳i加s〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力朋6朋朋sp.PCC7120中的 a^5JJ^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a77^^A在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目^^片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将必^/w'/ osY^ sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5和链霉亲 和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所得质粒叫 pC0LADuet-幼-pecA链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记 的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-Zw7，在大肠杆菌中能表达HOI 。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc州克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc^，在大肠杆菌中能表达PcyA。即链霉亲和素基因幼和脱辅基蛋白基因pe"拼接后连接到pC0LADuet的I和 尸"I之间；裂合酶基因a"5JJ9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是 万Wn和I ; PCB合成酶基因是2个(力o/和/ c^)，力o7在pACYCDuet-l中，处于第 一个多克隆位点，在Afcol和尸W I之间，； cW在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在M/e I禾口 之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到^f需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。 (4)将pCDFDuet-a^5"微pCOLADuet-^pecS禾口 pACYCDuet-力o厶pETDuet-p一 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至ODe。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白 B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析， 可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例16(1) 从GeneBank中可以查到，藻种細6a函sp. PCC7120的全序列已经测定完成， ^ 7ayz j'/70s"s sp. PCC7603部分序列已经测定。如a&e朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，/K 7a迈/770s"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将力"W朋朋sp.PCC7120中的 aL 5J39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a"MM，在 大肠杆菌中能表达betal55裂合酶。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目^Ut段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2) 将#. h/z/i加s"s sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^ (C84A) 和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所 得质粒叫pCOLADuet-幼-pec5 (C84A)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因 拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得 到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcyj克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc/A在大肠杆菌中能表达PcyA。即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因pec^(C84A)拼接后连接到pCOLADuet的fcoR I和尸"I之间；裂合酶基因aL 5"9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点'酶切位 点是和i7 o I ; PCB合成酶基因是2个(力o/和pc;^)，力o7在pACYCDuet-1中'处
于第一个多克隆位点，在Afcol和尸"I之间，pc/Z在pETDuet-1中第二个多克隆位点， 在WeI和i7wl之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pCDFDuet—aWMW、 pCOLADuet-s^pecS ( C84A )禾D pACYCDuet-力o7 、 pETDuet-/ c^转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此 工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫 代-卩-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37"C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆 素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通 过Nr亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素 -藻红蓝蛋白B。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的betal55裂合酶、藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白、 藻蓝胆素生物合成酶基因或其同源基因以及链霉亲和素基因及其同源基因来制备链霉亲 和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了 GenBank中已公开全序列的蓝藻勘a&e朋sp. PCC7120和已经部分测序的^ Ja肌'/70s"s sp. PCC7603为例对本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开的内容采用其 它原料实施本发明。
权利要求
1. 一种制备链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于包括下述步骤(1)用基因工程方法，将beta155裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒；(2)用基因工程方法将藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因和链霉亲和素基因拼接后克隆于第二个表达载体中，可以表达链霉亲和素和藻红蓝蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(3)用基因工程方法将PCB生物合成酶基因hol和pcyA或其同源基因同时克隆于第三个表达载体中或分别克隆于第三、第四个表达载体中，得到PCB合成质粒；(4)将beta155裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。
2. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的betal55裂合酶基因是指与 爿朋/ 犯朋sp. PCC7120中a"MW基因同源的基因。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因 是指与力朋/ 朋朋sp. PCC7120或M sp. PCC7603中/ ec5基因同源的基因。
全文摘要
本发明公开了一种制备链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，通过应用藻胆蛋白betal55裂合酶催化藻蓝胆素与链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。
文档编号C12N15/09GK101397557SQ20071003060
公开日2009年4月1日 申请日期2007年9月28日 优先权日2007年9月28日
发明者佟顺刚, 坤 夏 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司