一种高产纤维素酶里氏木霉工程菌及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种高产纤维素酶里氏木霉工程菌，它是将里氏木霉Rut?C30的bgl1基因采用单酶切同源重组的方法导入里氏木霉Rut?C30中获得。本发明还公开了前述高产纤维素酶里氏木霉工程菌的构建方法和应用。与现有技术相比，本发明中工程菌产生的胞外β?葡萄糖苷酶相对于出发菌株Rut?C30提高了17.3倍，同时，内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、滤纸酶活和蛋白质含量也得到了提高。此外，该菌株表现出较强的葡萄糖耐受能力和更好的糖化能力。
【专利说明】
一种高产纤维素酶里氏木霉工程菌及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物能源及生物技术领域，具体涉及一种高产纤维素酶里氏木霉工程 菌及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 石油能源危机以及石油能源使用带来的日益严重的环境污染，使人们不断追求具 有可替代性的可再生能源。纤维素在自然界中广泛存在，是由葡萄糖残基通过β_1，4糖苷键 连接形成的一种大分子多糖聚合物。它可以被真菌产生的纤维素酶降解成葡萄糖，进而被 微生物利用生产生物能源分子、生物基精细化工产品和药物等。纤维素酶是一类复杂的酶 混合物，而其中参与纤维素降解的主要有三种酶：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和葡萄糖 苷酶。首先，内切葡聚糖酶将纤维素降解成纤维寡糖，然后纤维寡糖在纤维二糖水解酶的作 用下降解成纤维二糖，最后纤维二糖在葡萄糖苷酶的作用下水解为可发酵性葡萄糖。
[0003] 里氏木霉因其纤维素酶活性高、遗传性状稳定、生长繁殖迅速、培养条件简单和生 物安全性高，成为理想的纤维素酶工业生产菌株(Journal of Biotechnology ,1994,37
[3] : 193-200)。纤维素酶在内质网中产生，经过高尔基体到达菌丝顶端，大量分泌到胞外培 养液中。然而，只有少量的β-葡萄糖苷酶BGLl分泌到细胞外，使得纤维素的降解只停留在产 生纤维二糖上。但是纤维二糖的积累以及代谢终产物葡萄糖的产生都会抑制纤维素酶的产 生，导致纤维素降解效率的降低。此外，工业上收集纤维素酶只是收集上清液中的纤维素 酶，无法同时收集胞内的BGLl，导致所得纤维素酶液中的BGLl的含量很低，无法充分降解纤 维素。该问题只能通过提取不同发酵液中的纤维素酶进行混合来解决，这样大大增加了生 产成本。如何提高纤维素酶中的葡萄糖苷酶成为商业化纤维素酶生产中一个迫切需要解 决的重要问题。因此，获得一株具有葡萄糖耐受性的高产葡萄糖苷酶的里氏木霉基因工 程菌株将有助于降低纤维素酶生产成本和提高纤维素酶酶活。
[0004] 国内外研究人员已经通过基因突变、过表达目的基因、优化强启动子、增加强启动 子拷贝数等方法获得了高产纤维素酶里氏木霉工程菌株，并已经应用到工业生产中。如 Mandals等通过辐射获得里氏木霉QM6a的高产突变株QM9414，其蛋白和纤维素酶产量分别 是野生型菌株的2倍和4倍。但是该菌株具有较强的碳代谢抑制作用。后来，KovScs等通过 UV，N-硝基胍，UV的三步法获得了突变株Rut-C30 Aut-CSO是一株具有较弱碳代谢抑制的β-葡萄糖苷酶高产菌株，同时其胞外纤维素酶总水平比野生菌提高了 150倍，但其生长缓慢、 生孢延迟、生孢减少。目前，通过异源或同源过表达β-葡萄糖苷酶以获得高产纤维素酶菌株 也取得了一定进展。Ma等人将斜卧青霉来源的β-葡萄糖苷酶基因在cbhl启动子作用下，在 里氏木霉菌株Rut-C30中表达，所得转化子的β-葡萄糖苷酶活性提高6到8倍，滤纸活性也提 高了30%，秸杆糖化能力也得到显著提高。Zhang等通过使bgl 1基因在改造的四拷贝cbhl启 动子控制下进行过表达，使葡萄糖苷酶和滤纸酶活分别增加了 3.7倍和1.3倍。
[0005] 本发明以里氏木霉RUT-C30为出发菌株，利用同源重组获得了一株高产β-葡萄糖 苷酶的里氏木霉突变菌株，其β-葡萄糖苷酶活性是出发菌株Rut-C30的17.3倍。同时，该菌 株表现出了极强的葡萄糖耐受能力，能耐受225mM葡萄糖。该菌株24小时的纤维素糖化能力 是出发菌株的120%。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种高产纤维素酶里氏木霉工程菌，以解决现有 产纤维素酶菌株存在的生长缓慢、效率较低和碳代谢抑制作用较强等问题。
[0007] 本发明还要解决的技术问题是提供上述高产纤维素酶里氏木霉工程菌的构建方 法。
[0008] 本发明最后要解决的技术问题是提供上述高产纤维素酶里氏木霉工程菌的应用。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0010] 一种高产纤维素酶里氏木霉工程菌，它是在里氏木霉Rut-C30中过表达bgll基因 得到，所述的bgll基因序列如SEQ ID No. :1所示。
[0011]上述高产纤维素酶里氏木霉工程菌的构建方法，它包括如下步骤：
[0012] (1)以里氏木霉Rut-C30的cDNA为模版设计bgll基因扩增引物，进行PCR扩增；
[0013] (2)将步骤（1)中PCR扩增后所得产物采用单酶切同源重组的方法插入质粒中，得 到表达盒PBGL，并通过基因测序验证该基因正确整合；
[0014] (3)将步骤(2)中得到的表达盒pBGL导入里氏木霉Rut-C30的孢子中，筛选得到稳 定遗传的转化子，即高产纤维素酶里氏木霉工程菌，命名为TRB1。
[0015] 步骤（1)中，所述的bgll基因扩增引物中，上游引物的核苷酸序列为 ACCCAATAGTCAATCTAGAATGCGTTACCGAACAGCAGC ;下游引物的核苷酸序列为 TCGGCATCTACTTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGCGCTACCGACAGAGTGCTCGo
[0016] 步骤（1)中，进行PCR扩增时，预变性条件为95°C反应15s，变性条件为95°C反应 15s，退火条件为66 °C反应30s，延伸条件为72 °C反应3min，彻底延伸条件为72 °C反应5min。 [0017]步骤(2)中，所述的质粒为pDHt/sk。
[0018]步骤(3)中，将表达盒pBGL导入里氏木霉Rut-C30的方法为农杆菌介导法。
[0019] 步骤(3)中，筛选得到稳定遗传的转化子的方法为:表达盒PBGL导入里氏木霉Rut-C30的孢子后，在筛选培养基中培养5天得到转化子，再将转化子进行3轮稳定的传代培养以 使得bgl 1在转化子中稳定地过表达，即得稳定遗传的转化子；
[0020] 其中，所述筛选培养基的配方为:含有相应筛选标记的PDA培养基。
[0021] 上述高产纤维素酶里氏木霉工程菌在纤维素水解方面的应用也在本发明的保护 范围之内。
[0022] 其中，所述的应用方法为，将权利要求1所述的高产纤维素酶里氏木霉工程菌接种 至培养基中，会产生纤维素水解酶。
[0023] 其中，将高产纤维素酶里氏木霉工程菌接种至培养基的方法为:将高产纤维素酶 里氏木霉工程菌在I3DA固体培养基中于25~30 °C下培养5~10天后，取孢子接种于SDB培养 基活化24~50小时后，再接种到含有葡萄糖的TMM+2%微晶纤维素培养基中培养5~10天。
[0024] 其中，将高产纤维素酶里氏木霉工程菌接种至培养基的方法优选为:将高产纤维 素酶里氏木霉工程菌在PDA固体培养基中于28°C下培养7天后，取孢子接种于SDB培养基活 化30小时后，再接种到含有葡萄糖的TMM+2 %微晶纤维素培养基中培养7天。
[0025] 其中，
[0026] PDA固体培养基的制备方法为:取去皮马铃薯200g切成小块后加水IL，煮沸30分后 去滤液，加葡萄糖20g和琼脂15g后融化分装，并于115°C灭菌15分钟。
[0027] SDB培养基的配方为:葡萄糖4g、酵母膏lg、蛋白胨lg、水1L。
[0028] 含有葡萄糖的TMM+2%微晶纤维素培养基的配方为：（NH4)S〇4 5g、KH2P〇4 15g、 MgS〇4 0.6g、CaCl2 0.6g、FeS〇4*7H20 0.005g、MnS〇4 0.0016g、ZnS〇4*7H20 0.0014g、C0Cl2 0.002&、葡萄糖10~5(^、2(^微晶纤维素、水1匕
[0029] 其中，所述的纤维素水解酶包括β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和滤 纸酶活。
[0030] 其中，
[0031] 为提高β-葡萄糖苷酶的酶活，ΤΜΜ+2%微晶纤维素培养基中葡萄糖浓度优选10~ 50g〇
[0032] 为提高内切葡聚糖酶的酶活，TMM+2%微晶纤维素培养基中葡萄糖浓度优选10~ 50g〇
[0033] 为提高外切葡聚糖酶的酶活，TMM+2%微晶纤维素培养基中葡萄糖浓度优选10~ 50g〇
[0034] 为提高滤纸酶的酶活，TMM+2 %微晶纤维素培养基中葡萄糖浓度优选10~30g。
[0035] 有益效果:本发明利用同源重组获得了高产β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。该工程 菌的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和滤纸酶活都相应增加，除此之外它的细胞形态以及内 质网形态都没有发生变化，且对葡萄糖有较强的耐受能力。
[0036] 与现有技术相比，本发明具有如下优势：
[0037] (I)TRBl产生的胞外β-葡萄糖苷酶相对于出发菌株Rut-C30提高了17.3倍。在提高 β-葡萄糖苷酶的同时，内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶以及滤纸酶活和蛋白质含量得到了一 定程度的提高和维持。
[0038] (2)该菌株表现出550mM的葡萄糖耐受能力。
[0039] (3)表现出更好的糖化能力。
【附图说明】
[0040]图1为实施例1中pBGL表达盒质粒图谱；
[0041]图2为实施例1中转化子筛选结果；
[0042]图3为实施例1中转化子TRBl~5与Rut-C30发酵7天后酶活和蛋白含量的对比图； [0043] 图4为实施例2中TRBl和Rut-C30的上清液酶活对比图；
[0044]图5A为实施例3中不同浓度葡萄糖培养基中TRBl和Rut-C30上清液β-葡萄糖苷酶 活性；
[0045]图5Β为实施例3中不同浓度葡萄糖培养基中TRBl和Rut-C30上清液外切葡聚糖酶 活性；
[0046]图5C为实施例3中不同浓度葡萄糖培养基中TRBl和Rut-C30上清液内切葡聚糖酶 活性；
[0047]图为实施例3中不同浓度葡萄糖培养基中TRBl和Rut_C30上清液滤纸酶活活性；
[0048]图6A为实施例4中A组培养条件下，TRBl和Rut-C30的粗酶液水解纤维素能力检测 图；
[0049]图6B为实施例4中B组培养条件下，TRBl和Rut-C30的粗酶液水解纤维素能力检测 图；
[0050]图6C为实施例4中C组培养条件下，TRBl和Rut-C30的粗酶液水解纤维素能力检测 图；
[0051 ]图7A为实施例5中Rut-C30的内质网的荧光共聚焦显微镜图；
[0052]图7B为实施例5中TRBl的内质网的荧光共聚焦显微镜图；
[0053]图8A为实施例5中Rut-C30的细胞膜的荧光共聚焦显微镜图；
[0054]图8B为施例5中TRBl的细胞膜的荧光共聚焦显微镜图；
[0055] 图9A为实施例6中Rut-C30的菌丝球形成状态；
[0056] 图9B为实施例6中TRBl的菌丝球形成状态。
【具体实施方式】
[0057]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0058] 实施例1
[0059] pBGL表达盒的构建，包括以下步骤：
[0060] (l)bgll基因扩增引物的设计见表一。以里氏木霉Rut-C30的cDNA为模版，用该引 物扩增bgl 1基因。扩增条件为预变性:95°C，15s;变性:95 °C，15s;退火:66°C，30s;延伸：72 °C，3min;彻底延伸：72 °C，5min;
[00611 (2)经纯化的目的基因 PCR产物采用单酶切同源重组插入到质粒pDht/sk的XbaI酶 切位点上获得表达盒PBGL，见图1;
[0062] (3)采用农杆菌介导的办法将该表达盒转入到里氏木霉孢子中具体方法如下：
[0063] 根癌农杆菌转化：
[0064] a. _70°C保持的根癌农杆菌置于冰上孵育IOmin;
[0065] b.往根癌农杆菌中加入0.5_lyg的质粒，冰浴30min;
[0066](；.液氮5111；[11，37。05111；[11，冰浴2111；[11;
[0067] d.加入1ml的液体LB，200rpm，28°C培养3h后，离心收集菌体，再洗一次；
[0068] e.用100μΙ液体LB重悬菌体并均匀涂布在LB抗性平板上(含50μg/ml的羧苄青霉素 和50μg/ml的卡那霉素），28°C培养两天。
[0069] 根癌农杆菌介导的里氏木霉的转化
[0070] a.瑞氏木霉孢子要求新鲜制备，0.02 %的Tween-80水从平板上洗下孢子，浓度约 lxl06/ml;
[0071] b.农杆菌:首先将农杆菌AGLl单菌落(含双元载体)接种于3ml含有50μg/ml的羧苄 青霉素和50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm，28°C过夜培养至0D660为0.6,然 后离心收集菌体并用适量的IM液体培养基(含200μΜ的乙酰丁香酮)重悬菌体，并将菌液浓 度调到0D660为0.15，然后200rpm，28°C培养至0D660为0.5-0.8。将100μΙ农杆菌液与100μΙ 的里氏木霉的孢子混匀后，均匀涂在固体頂(含200μΜ的乙酰丁香酮)平板上，26 °C避光培养 48h。将共培养两天后的混合物用0.02%的Tween-80水刮下后，均匀涂在含有600μΜ头孢噻 月亏(cefotaxime，以杀死农杆菌细胞）、0.1 %Triton Χ-100以及相应抗生素的F1DA平板上，28 °C培养一周。获得转化子，见图2;
[0072] (4)对（3)步骤中获得的转化子进行3轮的稳定遗传，于SDB中活化30h后，接种于 TMM+2 %微晶纤维素培养基中进行酶活的检测，见图3。
[0073] 实施例2
[0074]将里氏木霉各菌株在纤维素培养基摇瓶培养7天的上清液经4°C，8000rpm，15min 离心收集上清用于纤维素酶活的测定。纤维素酶活测定方法如下：
[0075] (1)β_葡萄糖苷酶(pNPGase)酶活测定:将适当稀释的酶液上清20μ1加入90μ1 4mM 的pNPG(50mM NaCl，pH5 · 0)，50 °C保温IOmin，吸取100μΙ加入等体积的2 % NaC03，置于酶标 板读取〇D405(Biochem-Tokyo 1999，125(4): 728-736) 〇
[0076] (2)外切葡聚糖酶（pNPC)酶活测定：90μ1 4mM 的 pNPC 溶液（0.05M NaAc，pH5.0， lmg/ml 1，5-δ-葡萄糖酸内酯）加入20μ1适当稀释倍数的酶液，50°C保温30min，吸取100μΙ 加入等体积的2%NaC03,置于酶标板中读取0D405(Anal Biochem 1984,138(2):481-487)
[0077] (3)内切葡聚糖酶(CMCase)酶活测定:取一定稀释倍数的酶液30μ1，加入30μ1 CMC (PH4.8,50mM恥六(：，2%)，50°(：保温3〇1^11，然后加入12(^1的0吧，95°(：保温51^11，之后取出 36μ1加到装有160μ1超纯水的酶标板里读取0D540的数值。一个酶活单位(IU)定义为:在每 分钟内释放Iymol还原糖所需的酶量(Anal Biochem 2005,342(1): 176-178)。
[0078] (4)滤纸酶活(FPase)测定:取20μ1-定稀释倍数的发酵液上清，加入40μ1醋酸钠 缓冲液(50mM，ρΗ4.8)，混匀后加入到放有小滤纸片的PCR板的孔里，50°C保温一小时，然后 加入120μ1的DNS，95°C保温5min，之后取出36μ1加到装有160μ1超纯水的酶标板(Greiner bi〇-〇ne ,Frickenhausen ,Germany)里在酉每标仪Varioskan Flash microplate reader (Thermo electron,Finland)读取0D492的数值(Method Enzymol 1988,160:87-112)。测定 结果见图4。
[0079] 实施例3
[0080] 将里氏木霉各菌株在加不同浓度葡萄糖的纤维素培养基摇瓶培养7天的上清液经 离心收集上清用于纤维素酶活的测定。纤维素酶活测定方法参照实施例3,测定结果见图5。 [0081 ] 实施例4
[0082]不同条件下获得的培养上清液用于水解纤维素，检测里氏木霉TRBl所产纤维素酶 的纤维素水解效率及底物特异性，具体方法如下:称取乙二胺处理的玉米秸杆(EDAPCS)(该 水解纤维素由天津大学李丙智老师提供)75mg/ml于离心管中，向各管分别加入IOOmM乙酸 钠缓冲液(pH5.0)(A组），0.2mg/ml的叠氮化钠(B组）以及150ug/ml的发酵上清液(C组），于 50 °C，200rpm条件下反应72小时，每24小时测定一次葡萄糖含量。结果见图6。图6中，横坐标 C30表示Rut-C30在含有微晶纤维素的TMM培养基中培养，横坐标TRBl表示TRBl在含有微晶 纤维素的TMM培养基中培养，横坐标C30-l%Glu表示Rut-C30在含有微晶纤维素和1%葡萄 糖的TMM培养基中培养，横坐标TRB H % Glu表示TRB1在含有微晶纤维素和1 %葡萄糖的TMM 培养基中培养。从图中可看出，在只含有微晶纤维素的TMM培养基中培养的工程菌在24h的 水解效率比Rut-C30高出18 %，在含有微晶纤维素以及1 %葡萄糖的??Μ培养基中培养的工 程菌在24h的水解效率比Rut-C30高出35%。
[0083] 实施例5
[0084]在诱导培养基培养3天的各菌株用红色ER-tracker，FITC染色，在共聚焦显微镜下 观察，具体方法如下：取培养好的菌液8000rpm离心5min，加入HBSS with Ca2+&Mg2+ (Hanks'Balanced Salt Solution with Ca2+&Mg2+)缓冲液再离心两次，去除洗涤液取少 量ER-Tracker Red按照1:1000的比例加入到ER-Tracker Red稀释液中，配制好的并37°C预 温育的ER-Tracker Red染色工作液，与细胞37°C共孵育30分钟。激光共聚焦观察结果见图7 和图8。
[0085] 实施例6
[0086] 在添加有葡萄糖的TMM培养基里培养里氏木霉Rut-C30和TRBl (按照5%接种量接 种)3天后，观察其菌丝球形成状态，结果见图9。
【主权项】
1. 一种高产纤维素酶里氏木霉工程菌，其特征在于，它是在里氏木霉Rut-C30中过表达 bgll基因得到，所述的bgll基因序列如SEQ ID No.:l所示。2. 权利要求1所述的高产纤维素酶里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，它包括如 下步骤： (1) 以里氏木霉Rut-C30的cDNA为模版设计bgl 1基因扩增引物，进行PCR扩增； (2) 将步骤（1)中PCR扩增后所得产物采用单酶切同源重组的方法插入质粒中，得到表 达盒pBGL; (3) 将步骤(2)中得到的表达盒pBGL导入里氏木霉Rut-C30,筛选得到稳定遗传的转化 子，即高产纤维素酶里氏木霉工程菌。3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的bgll基因扩增引物 中，上游引物的核苷酸序列为ACCCAATAGTCAATCTAGAATGCGTTACCGA ACAGCAGC;下游引物的 核苷酸序列为TCGGCATCTACTTCTAGATTAATGATGATGA TGATGATGCGCTACCGACAGAGTGCTCG 〇4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的质粒为pDHt/sk。5. 权利要求1所述的高产纤维素酶里氏木霉工程菌在纤维素水解方面的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用方法为，将权利要求1所述的高 产纤维素酶里氏木霉工程菌接种至培养基中，会产生纤维素水解酶。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将高产纤维素酶里氏木霉工程菌接种至培 养基的方法为:将高产纤维素酶里氏木霉工程菌在TOA固体培养基中于25~30 °C下培养5~ 10天后，取孢子接种于SDB培养基活化24~50小时后，再接种到TMM培养基中培养5~10天。8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的纤维素水解酶包括β-葡萄糖苷酶、 内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和滤纸酶。
【文档编号】C12N1/15GK105861338SQ201610288756
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】林凤鸣, 李程程
【申请人】东南大学