一种利用rna干扰技术提高里氏木霉生产纤维素酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用RNA干扰技术提高里氏木霉产纤维素酶 酶活的方法。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁多糖主要包括纤维素和半纤维素，它的来源丰富、可再生，是生产可再 生生物燃料的理想原料。将植物细胞壁多糖，尤其是其中的主要成分-纤维素-完全降解为 可发酵的简单寡糖和单糖如葡萄糖需要复杂的纤维素酶酶系协同作用。里氏木霉是一种丝 状真菌，具有强大的分泌纤维素酶的能力。工业上，改造里氏木霉，提高其产纤维素酶的产 量，从而在降解植物细胞壁多糖以及相关应用上具有重要的应用价值。
[0003] 里氏木霉的纤维素酶系包括两个外切纤维素酶、五个内切纤维素酶、一个β_葡萄 糖苷酶和三个裂解性多糖单加氧酶（lytic polysaccharides monooxygenases，LPM0s，即 原GH61家族成员）。对这些纤维素酶的分泌表达的调控非常复杂，涉及到多个阶段，如转录、 翻译、转运、蛋白折叠、胞外降解等以及多种关键因子，但最主要的调控发生在转录阶段。
[0004] Crel是一个广域的转录抑制因子，除能调节纤维素酶基因的表达外，还调控很多 其它基因、甚至转录因子的表达。在里氏木霉主要的纤维素酶、木聚糖酶基因上，都或多或 少的存在着Cre 1转录因子的结合位点。
[0005] 虽然Crel的主要作用是转录抑制因子，但它的作用非常复杂:完全敲除crel基因 的里氏木霉菌株，在以微晶纤维素做唯一碳源进行诱导时，产酶水平不能达到野生型菌株 的最大产酶水平，意味着Cre 1还具有一定的转录激活作用。因此，对cre 1基因的调控，不能 简单的米取基因敲除的策略，而应该米取抑制其表达的策略，使得cre 1基因的表达具有从 高到低逐渐变化的趋势，从而能够从中选择一个最优的crel表达水平，促进纤维素酶基因 的高效分泌表达。
[0006] RNA干扰(RNAi)技术提供了一种快速、有效抑制目的基因表达的方法，通过设计， 使得细胞合成双链RNA、发卡状RNA或反义RNA等，诱导细胞内产生和目的mRNA互补的单链小 分子RNA，再介导DICER对目的mRNA的切割和降解，从而降低目的基因的表达水平。
[0007] 基于以上考虑，采取RNAi技术对里氏木霉的主要转录抑制因子crel基因进行干扰 调节，有可能提高受体菌株产纤维素酶的水平。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种利用RNAi快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法。
[0009] 本发明的再一目的是提供可以提高里氏木霉产纤维素酶酶活的crel基因的RNA干 扰质粒，该质粒转化入里氏木霉后纤维素酶酶活能得到提高。
[0010]根据本发明的【具体实施方式】，对crel基因进行RNA干扰的质粒是以pRS424为模板 构建而成，将cbhl启动子、反向的crel基因568-963bp片段、正向的crel基因655-961bp片段 以及cbh2终止子串联拼接而成的。
[0011] 其中，Cbhl启动子的序列如SEQ ID No.l所示：
[0012] ATATCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGA ACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGA GACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGA AAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTG CAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCA GCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATG TCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTC TGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATA GCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAA GTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAA CGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCT GGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGC GTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTT GAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACG
[0013] AATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGG CACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATG TTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGA TAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGAT AGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCC TCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCA ATAGTCAACCGCGGACTGCGCATC
[0014] 反向的crel基因的序列如SEQ ID No.2所示：
[0015] ATGCTTGCCAAGGCGGCAAATCAGATTGAGCGCGAGACGCTTTCTGGCGGGCCGTCCAACCACAACTCGAGGCACCA CCCTTACTTTGGCCAGGGTGTTCCGGGTTCTCGAGGCCACCCCTCGCTTTCTTCGTACCACATGGCGAGAGCTCACT CCAACGACGAGGATGACCACTACCATGGCAGCTTGAGGCACGCCAAGAGGTCAAGGCCCAACTCGCCCAACTCTACG GCTCCTTCTTCTCCCACCTTTTCGCACGACTCTCTGTCCCCCACCCCGGATCACACTCCCATCGCAACTCCCGCTCA CTCCCCCCGTCTCCGTCCCTTTTCGGGCTACGAGCTGCCGAGTCTGAGAAACCTGTCCCTGCAGCACAATACGACTC CGGCGCTGGCC
[0016] 正向的crel基因的序列如SEQ ID No.3所示：
[0017] GGCCAGGGTGTTCCGGGTTCTCGAGGCCACCCCTCGCTTTCTTCGTACCACATGGCGAGAGCTCACTCCAACGACGA GGATGACCACTACCATGGCAGCTTGAGGCACGCCAAGAGGTCAAGGCCCAACTCGCCCAACTCTACGGCTCCTTCTT CTCCCACCTTTTCGCACGACTCTCTGTCCCCCACCCCGGATCACACTCCCATCGCAACTCCCGCTCACTCCCCCCGT CTCCGTCCCTTTTCGGGCTACGAGCTGCCGAGTCTGAGAAACCTGTCCCTGCAGCACAATACGACTCCGGCGCTGG
[0018] cbh2终止子的序列如SEQ ID No .4所示：
[0019] GGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAACAATGATGTGCGATGGTGTGGTTCCCGGTTGGCGGAGTCTTTGTCTACTTTGGT TGTCTGTCGCAGGTCGGTAGACCGCAAATGAGCAACTGATGGATTGTTGCCAGCGATACTATAATTCACATGGATGG TCTTTGTCGATCAGTAGCTAGTGAGAGAGAGAGAACATCTATCCACAATGTCGAGTGTCTATTAGACATACTCCGAG AATAAAGTCAACTGTGTCTGTGATCTAAAGATCGATTCGGCAGTCGAGTAGCGTATAACAACTCCGAGTACCAGCAA AAGCACGTCGTGACAGGAGCAGGGCTTTGCCAACTGCGCAACCTTGCTTGAATGAGGATACACGGGGTG CAACATGGCTGTACTGATCCATCGCAACCAAAATTTCTGTTTATAGATCAAGCTGGTAGATTCCAATTACTCCACCT CTTGCGCTTCTCCATGACATGTAAGTGCACGTGGAAACCATACCCA
[0020] 根据本发明的【具体实施方式】，构建对crel基因进行RNA干扰的质粒的方法为:设计 引物，从里氏木霉Tu6AtKU70的基因组DNA中扩增cbhl基因启动子片段、反向的crel基因 568-963bp片段和cbh2终止子片段，同时将pRS424质粒载体进行EcoRI的酶切，电泳回收这 四个片段。将这四个片段同时转化酿酒酵母A109菌株，由于在引物设计时，加入了特殊的末 端重叠序列，因此PRS424和这三个外源片段可以通过酿酒酵母的体内重组无缝拼接起来。 挑取筛选平板上的阳性克隆，通过PCR及质粒测序的方法验证这三个外源片段的插入。然后 设计引物，再从里氏木霉Tu6AtKU70的基因组DNA中扩增正向的crel基因655-961bp片段， 将其连接至PEASY-T3质粒载体中。用EcoRI和ΚρηΙ双酶切将该外源片段切下并电泳回收。同 时将含有cbhl基因启动子、反向的crel基因和cbh2终止子片段的重组pRS424质粒用EcoRI 和ΚρηΙ也进行双酶切，同时亦电泳回收质粒载体片段，将二者连接，即得编码对crel基因进 行RNA干扰的重组质粒。
[0021]所述构建pCrel-i的引物是：
[0022]扩增cbhl启动子片段的引物对序列如下：
[0023] PcbhlP(SR)F1:5，-TGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGATATCTAGAGTTGTGA AGTCGG-3 '
[0024] PcbhlP(SR)R1:5，-GCACAATACGACTCCGGCGCTGGCCGATGCGCAGTCCGCGGTTGACTATT-3 '
[0025] 反向的crel基因片段的引物对序列如下：
[0026] Pcre1(SR