一株绿色木霉及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一株绿色木霉及其应用，特别是涉及一株耐抑 制物强的绿色木霉及其在制备纤维素酶方面的应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素是世界上最大的可再生性有机资源，每年通过全球生物合成可再生性纤维 素达1000亿吨以上，但被利用的极少。将天然纤维素降解为可利用的糖类，再进一步转化 为乙醇、菌体蛋白、气体燃料等物质，对解决当今世界所面临的环境污染、粮食短缺、资源紧 张和能源危机等问题具有重大现实意义，而纤维素酶是降解纤维素最有效的生物催化剂。
[0003] 酶解法的高成本是生物质能源工业化的主要制约因素之一。降低纤维素酶成本主 要涉及降低纤维素酶产生菌培养基及发酵成本、提高纤维素酶活性等问题。因此，提供能够 利用廉价原料，发酵周期短和耐受能力强的菌株产生高活性纤维素酶对木质纤维素转化为 生物质能源具有重要意义。
[0004] 许多细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶，其中真菌类是研究和应用最 广的纤维素酶生产菌。生产纤维素酶的真菌主要有木霉属曲霉属 iAsperigillus')、着霉M (Penicillium)、敏霉Μ 私燦嚴霉M Qfyrotheeium) 等，尤以木霉属类菌种居多。
[0005] CN201210408018. 6 公开了一株深绿木霉 B-8-1-34 (7-ricAocfeiis airoK/riofe)及 其在制备纤维素酶方面的应用，该菌株能够利用含有木质纤维素的工农业生产废弃物，配 合麸皮、玉米浆、豆饼粉等廉价原料，通过液态或固态发酵生产纤维素酶。其液态产酶发酵 培养基中当以2. 5%木糖渣为碳源时，发酵66h得到粗酶液，然后用粗酶液糖化木糖渣和玉 米芯48h，还原糖浓度分别达3. 7%和4. 4%。
[0006] CN201210295819. 6公开了一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取 方法与应用，解决了现有产纤维素酶菌株酶活产量低的问题，该菌株为绿木霉ZY-01 (TricAocferaza Kireas ZY-01)，该菌株可以用于甘鹿渔及結杆的高效降解，分泌的纤维素 酶具有较高的纤维素降解活性。
[0007] Krisztina Kovacs ^(Trichoderma atroviride mutants with enhanced productionof cellulase and β -glucosidase on pretreated willow[J], Enzyme and Microbial Technology, 2008(43) :48-55)报道了通过诱变获得的三株深绿木霉TUB F-1721、TUB F-1741 和 TUB F-1753,滤纸酶活分别达 1. 14 FPU/mL、l. 18 FPU/mL 和 1. 14 FPU/mL〇
[0008] 林英等(产纤维素酶绿色木霉F_UV264产酶条件优化，安徽农业科学，2006, 34 (11): 2312-2314)对诱变菌株绿色木霉F-UV264的产纤维素酶条件进行了研究，结果表明：以 1%(NH4) 2S04和2%酵母膏为氮源，并加入3%表面活性剂，2%的Mandels营养盐，麸皮与稻草 粉比例为1:3,30°C发酵130h可达到最高酶活。
[0009] 目前获得的产纤维素酶的菌株，大多数是直接采用木质纤维素原料为碳源和酶蛋 白诱导物，酶蛋白产量少，分泌的纤维素酶对预处理木质纤维素底物酶解适应性不强，用于 预处理木质纤维素原料的酶解，葡萄糖得率不高。为了提高产纤维素酶对预处理木质纤维 素的酶解效果，可以利用预处理木质纤维素原料作为碳源和诱导物，但是，木质纤维素在预 处理过程中由于糖类及木质素的降解，会释放一些微生物生长的抑制剂，有弱酸类抑制物 (甲酸，乙酸，乙酰丙酸等)，糠醛类抑制物(糠醛、5-羟甲基糠醛）以及酚类抑制物(香草醛， 对苯二酚，4-羟基苯甲酸)等，这些抑制物尤其是酚类对菌株产纤维素酶及纤维素酶解都有 一定的抑制作用，因此需要进行中和、水洗等脱毒处理，操作繁琐。如果直接采用预处理后 木质纤维素原料，则由于菌体耐受能力有限，纤维素酶的产量和活性不高。
【发明内容】
[0010] 针对现有技术的不足，本发明提供了 一株绿色木霉F4 Kiriofe F4) 及其应用。该菌株在以预处理木质纤维素作为碳源和诱导物生产纤维素酶的过程中，能够 耐受预处理木质纤维素引入的多种抑制物，仍然可以高效产酶，分泌的纤维素酶成分全，酶 活性高，用于酶解预处理木质纤维素时的耐受性强。
[0011] 本发明所述的绿色木霉F4，其分类命名为绿色木霉（Kiriofe )，已于 2008年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No. 2736。
[0012] 本发明所述的绿色木霉F4的分生孢子梗形成金字塔式的分枝轮廓，分枝末 端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，8-12X2. 5-3. 5μηι ;分生孢子卵形、宽椭圆形， 4-5 X 3. 5-4 μ m，或近球形，直径3. 5-4. 5 μ m ;单个近无色，聚集时呈淡绿色，壁粗糙。
[0013] 本发明所述的绿色木霉F4菌落在PDA平板上25°C培养4天扩展5-lOcm，初期白 色稀疏，后形成绿色产孢区，反面无色。该菌株可以在腐木，秸杆，有纤维素的土壤，马铃薯， 玉米粉等上生长，生长最适pH值为5. 0-5. 5,生长最适温度为25-35°C。
[0014] 本发明所述的绿色木霉F4是通过富集，木块涂布筛选，滤纸涂布筛选，刚果 红-CMC双层平板筛选得到的一株耐受抑制物能力强，纤维素酶成分全，酶活性高的绿色木 霉菌株。
[0015] 本发明所述的绿色木霉F4在生产纤维素酶方面的应用。所述绿色木霉F4发酵生 产纤维素酶的pH值为3. 0-6. 0,发酵温度为23-35°C，发酵时间为48-120h。
[0016] 本发明所述的绿色木霉F4在以预处理木质纤维素为培养基碳源和诱导物发酵生 产纤维素酶方面的应用，具有耐受抑制物能力强，纤维素酶成分全，酶活性高的特点。所 述的发酵培养基为：麦麸10-50g/L，预处理木质纤维素10-60g/L，微晶纤维素5-30g/ L,酵母膏 5-30g/L，ΚΗ2Ρ04 0· l-10g/L，CaCl2 0· 01-3g/L，MgS04 0· 01-3g/L，ZnS04 · 7H20 0.01-50mg/L，MnS04.4H20 0.01-20mg/L，CoCl2 0.01-50 mg/L。发酵结束后，经检测发酵液 中的滤纸酶活为5-15IU/ml，CMC酶活为10-20IU/ml，β-葡萄糖苷酶活为l-5IU/ml，酶产 量及酶活稳定。
[0017] 本发明所述的木质纤维素原料包括一切含纤维素的生物质原料，如秸杆、木屑、能 源植物(如柳枝稷）和废纸等，优选为玉米秸杆。采用稀酸预处理、稀酸蒸汽爆破预处理， 或其它一切可用于木质纤维素预处理过程中，提高木质纤维素酶解效果的预处理技术。稀 酸预处理的条件为：酸浓度为〇. 5wt%_2. 5wt%，干物质浓度为（可溶性固体和不可溶性固 体质量之和与体系总质量的百分比，下同）l〇wt%-20wt%，温度115-180°C，时间5-120min。 稀酸蒸汽爆破预处理的条件为：酸浓度〇. 5wt%-2. 5wt%，干物质浓度25wt%-40wt%，温度 150-180°C，时间5-20min。预处理木质纤维素挤压脱水后直接加入到发酵培养基中，挤压脱 水后干物质中，木糖含量lwt%-10wt%,纤维素含量30wt%-40wt%,木质素含量15wt%-18wt%, 乙酸含量〇· 5wt%-2wt%，甲酸含量(λ lwt%-〇. 5wt%，5-羟甲基糠醛含量(λ 01wt%-0. 05wt%，糠 醛含量 〇· 02wt%-0. 08wt%，总酚含量 0· 005wt%-0. 015wt%。
[0018] 本发明所述的绿色木霉F4在以预处理木质纤维素为培养基碳源和诱导物，发酵 生产纤维素酶的过程中，当发酵l〇_24h后，加入山梨糖、纤维二糖、槐树粉、异麦芽糖、葡糖 酸内脂等的一种或几种，再发酵48-120小时。
[0019] 本发明采用绿色木霉F4生产的纤维素酶在酶解预处理木质纤维素方面的应 用，将发酵后粗酶液采用2-50 KD超滤膜进行浓缩，浓缩10-200倍；采用浓缩的酶液对 预处理木质纤维素原料进行酶解，酶加入量为0. 01-0. lg/g纤维素。控制酶解体系的 pH为4. 8-5. 2,温度为48-52°C，干物质浓度为5wt%-30wt%。酶解结束后，葡萄糖浓度为 4. 5wt%-15. 8wt%，葡萄糖得率为 83. 4%-99· 5%。
[0020] 本发明筛选获得的绿色木霉F4在以预处理木质纤维素作为碳源和诱导物生产纤 维素酶过程中，能够耐受预处理木质纤维素(硒酸预处理或稀酸蒸汽爆破预处理）引入的多 种抑制物（乙酸、甲酸、5_羟甲基糠醛、糠醛和酚等)，在这些抑制物存在下仍然可以高效产 酶，分泌的纤维素酶成分全，酶活性高，产生的纤维素酶用于酶解预处理木质纤维素时，具 有耐受性强，酶解活性高。
[0021] 生物材料保藏说明 本发明的绿色木霉F4 Kiriofe F4)菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研 究所；保藏号：CGMCC No. 2736 ;保藏日期：2008年11月10日。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过实施例对本发明进行详细说明。本发明中，wt%为质量分数。
[0023] 实施例1绿色木霉F4的分离筛选 本发明绿色木霉F4 Kiriofe F4)是从辽宁省抚顺市山顶松树根部的泥 土中筛选获得的，是通过富集，木块涂布筛选，滤纸涂布筛选，刚果红-CMC双层平板筛选得 到的。具体筛选过程为： (1) 将取得的泥土样品稀释，混悬于无菌水中，加入到发酵培养基中，于30°C培养 7