一种快速深层液态发酵生产蝉拟青霉菌粉的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种快速利用深层液态发酵技术生产真菌 菌丝体的方法，更确切地说是一种快速深层液态发酵生产蝉拟青霉菌粉的方法。
【背景技术】
[0002] 微生物发酵可分为分批、补料分批、半连续、连续等多种模式。分批发酵的人力、物 力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，发酵周期 较长，生产效率较低;补料分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但是由于有害代 谢产物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏;连续发酵较分批发酵和补料分批发酵生 产强度大大提高，但容易遭受杂菌的污染，菌种易退化，设备投资较大，且发酵产物浓度较 低；半连续发酵过程中，通过放掉部分发酵液再补入新鲜培养基，不仅可以补充养分和前 体，而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。
[0003] 半连续发酵工艺的应用可以起到缓解产物抑制和避免代谢副产物积累的作用，改 善了微生物的培养环境，有助于保持菌体活力的稳定，并且对于某些次级代谢产物，其最高 的生产速率仅在某些瞬态条件下才能达到。采用半连续发酵工艺不仅可以使这种瞬态条件 反复出现，而且还可以提高设备的利用率，因此半连续发酵工艺在次级代谢产物的生产方 面有着重要的应用。
[0004] 蝉花属虫生性药用真菌，是我国传统的一种名贵中药，又名蝉茸，蝉蛹草，虫花，是 由麦角菌科虫草属真菌蝉拟青霉寄生于蝉类若虫形成的复合体，是我国传统的中药材之 一。蝉花与冬虫夏草的无性型同属，功效相近。两者的菌株均为蝉拟青霉，且含有相近的化 学成分，目前在市场上流通的蝉花药材基本上为无性型的蝉拟青霉药材。
[0005] 现代医学研究表明，蝉花所具有的活性物质和冬虫夏草相当，其中腺苷和虫草酸 的含量远远超于冬虫夏草。实践证明蝉花的药用价值和保健价值主要可以归纳为增强机体 免疫调节功能、调节脂类代谢功能、抗肿瘤功能、解热镇痛功能、改善肾功能等。
[0006] 传统蝉拟青霉液态发酵工艺多为间隙性的分批发酵工艺，而分批发酵工艺的人 力、物力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，非 发酵周期较长，生产效率较低;而后续的分离工艺传统多用离心机进行分离，该方式因受制 于离心机分离因子影响，分离过程中菌丝体遭到剪切力破坏，部分有效成分流失到滤液中 导致产品质量和收率下降，分离所得滤液较浑浊，里面含有较多的碎菌丝，导致外排滤液 C0D偏高，该滤液若达到污水排放标准，需要经过复杂的污水处理，污水处理系统工作量太 大，给企业带来了严重的经济负担。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了解决上述蝉拟青霉菌粉生产的不足，从而设计了一种快速深 层液态发酵生产蝉拟青霉菌粉的绿色新方法，该方法采用半连续发酵工艺既能减少了工艺 环节，缩短了非发酵时间，提高了设备利用率，降低了生产成本；同时又采用高效的陶瓷膜 过滤，提高菌丝体的收率，减少进入滤液的菌丝体，降低滤液的COD，降低污水处理量;又不 破坏细胞本身，保证胞内有效成分的全部回收。该发明不但能快速得到高品质的蝉拟青霉 的菌丝体，又提高了分离过程中菌丝体的收率，增加了经济效益;又降低了废水中C0D，减轻 了污水处理系统压力，增加了社会效益。
[0008] 本发明目的主要是通过以下方式实现的：
[0009] -种快速深层液态发酵生产蝉拟青霉菌粉的方法，该方法按照下述步骤进行：
[0010] 1)蝉拟青霉半连续发酵液制备:将蝉拟青霉种子液接种到灭菌后的发酵培养基进 行深层液态发酵得到蝉拟青霉发酵培养液，所述的深层液态发酵接种量为体积含量的10~ 20%，通风比为1:0.1-1.(^￥111，罐压0.02~0.051^^，在20~30°(：下发酵培养2-7天后，放出 培养器容积的10-50%的发酵液，补入同等灭菌后的发酵培养基，继续发酵1-3天;如此不断 放料、补料，操作周期为1-3天，得到蝉拟青霉发酵液;将蝉拟青霉种子液接种到灭菌后的发 酵培养基之前可以将蝉拟青霉菌株以常规方法活化后制备得到蝉拟青霉种子液；
[0011] 2)蝉拟青霉发酵液陶瓷膜过滤:将步骤2)中所得的蝉拟青霉发酵液通过微滤膜得 到微滤透析液和菌丝体，收集菌丝体；
[0012] 3)低温真空烘干:将步骤2)中所得的菌丝体在真空度为-0.065~-0.095Mpa，65~ 85°C条件下进行干燥。
[0013] 所述的蝉拟青霉种子液是通过以下方法制备得到的：蝉拟青霉种子培养基组成为 葡萄糖1-3%、麸皮0.5-1.5%、蛋白胨0.5-1.5%、酵母粉0.1-1%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、 丝氨酸〇. 1-0.5 %、七水硫酸镁0.1-0.5 %、豆油0.01-0.05 % ;调节pH值5.0-6.5;培养条件 为:通风比为1:0 · 1-1 · Ovvm，罐压0 · 02~0 · 05Mpa，培养温度25~30°C，培养周期2-6天；
[0014] 上述蝉拟青霉种子液优选通过以下方法制备得到的:将经活化摇瓶蝉拟青霉菌种 接入种子培养基，种子培养基组成为葡萄糖2 %、麸皮1 %、蛋白胨1.5 %、酵母粉0.5 %、丝 氨酸0.2 %、磷酸二氢钾0.3 %、七水硫酸镁0.2 %、豆油0.02 % ;调节pH值5.5。培养条件为： 通风比为1:0.5vvm，罐压0.03Mpa，培养温度26-28°C，培养5天。
[0015] 蝉拟青霉发酵培养基组成为葡萄糖1-3 %、麸皮0.5-1.5 %、蛋白胨0.5-1.5 %、酵 母粉0.1-1 %、磷酸二氢钾0.1-0.5 %、丝氨酸0.1-0.5%、七水硫酸镁0.1-0.5%、豆油0.01-0.05% ;调节pH值5.0-6.5;
[0016]上述微滤膜为陶瓷膜或有机膜，其孔径在0.05~0.5μπι，操作温度为50~60°C，工 作压力:进压为2~4bar，出压为0~5bar。
[0017]优选步骤2)所述的微滤膜为陶瓷膜或有机膜，其孔径在50nm，操作温度为50~60 °C，工作压力:进压为3bar，出压为lbar。
[0018] 本发明适用于任何蝴拟青霉菌种(Paecilomyces cicadae)，如保藏于云南大学微 生物资源中心，保藏号YUMCCc359等均可以使用。
[0019] 本发明所采用的蝉拟青霉菌株不限于某个具体生产厂家，市售均可使用。
[0020] 本发明为快速深层液态发酵生产蝉拟青霉菌粉提供了一种新的方法。该方法具有 以下几个突出的优点：
[0021] 1、发酵周期短：传统的分批发酵工艺，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放 料、清洗等操作，工序繁琐，非发酵周期长，而采用半连续发酵工艺减少了工艺环节，缩短了 非发酵时间和发酵时间，提高了设备利用率和发酵强度，降低了生产成本。
[0022] 2、提高收率:采用微滤膜孔径0.05~0.5μπι，显著提高了菌丝体得率。
[0023] 3、提高产品质量:传统离心机分离过程中蝉拟青霉菌丝体遭到剪切力破坏，部分 有效成分流失到滤液中导致菌丝体有效成分降低，该工艺采用微滤膜过滤，操作过程中不 会产生剪切力，有效保证菌丝体有效成分。
[0024] 3、降低滤出液C0D，减轻环保压力：传统卧螺分离由于菌丝体截留率低，部分菌丝 体进入滤液，导致滤液中C0D含量增高，本方法分离因子高，对菌丝体截留率大大增加，滤液 澄清，滤液中菌丝体少，得到的透析液C0D大大降低，其C0D指标可以达到直接排放标准，仅 污水处理每天就为企业减少30吨处理量，大大降低了污水处理费用。
[0025] 4、清洁连续生产，能耗低:本发明方法可连续生产，膜及其配套设备使用寿命长， 装置维护方便，投资少，操作过程无噪声污染，易清洁。
【附图说明】 图1实施例1所述传统工艺图。
[0026] 以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发 明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
[0027] 实施例1
[0028] 1)蝴拟青霉菌(Paecilomyces cicadae)，保藏于云南大学微生物资源中心，保藏 号YUMCCc359。将培养好的蝴拟青霉菌株种子液种到种子培养基，接种量是10%，种子培养 基组成为葡萄糖2 %、麸皮1 %、蛋白胨1.5 %、酵母粉0.5 %、丝氨酸0.2%、磷酸二氢钾 0.3 %、七水硫酸镁0.2%、豆油0.02% ;调节pH值5.5。培养条件为:通风比为1:0.5vvm，罐压 0.03Mpa，培养温度26-28Γ，培养5天左右即可得到种子液。将培养好种子液接种到灭菌后 50L发酵培养基，按体积百分含量接种量