一种绿色木霉突变株的发酵方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物培养技术领域，具体是一种绿色木霉突变株的发酵方法及应用。
【背景技术】
[0002]绿色木霉在木霉属中是一种较为理想的抗土传病的半知菌，不仅效果快，且抗菌的广谱性强，还具有一定的促作物生长之作用。尤其是对防治土壤中的立枯病和赤霉病均有快而显著的作用，当上述病害发生时，既可以迅速控制病情，也可在作物种子播撒时拌入种子起到防疫作用。此外还可以对作物的营养利用、环境温度及光等环境因子适应方面发挥良好作用。因此，在了解它的生物学作用的基础上，筛选出适合于它生长并合成发挥生物学抑菌作用的产物，应用于减少作物病害、促进作物生长、为人畜提供安全健康的食物具有重要意义。
[0003]近年来(2007年?2014年)黑龙江林业职业研究院孙永琴通过绿色木霉对栽培黑木耳的危害研究产生的生物学特性及防治，王春等人从向日葵菌核病筛选出对菌核病菌生长及其菌核病萌发有关抑制力的生防绿色木霉菌株，对有关病菌孢子萌发抑制和离体叶片的防效分别达90%以上、80%以上，并发现培养该生防绿色木霉菌株具有良好的生产性状和生防效果。其机制即在于将所筛选分离的野生绿色木霉经诱变筛选的第二次纯化菌物经进一步扩大培养(即发酵)，形成大量孢子体或菌丝体，再适当加入添加剂制成颗粒剂、粉剂，使之便于拌入种子一起播入土壤中，当下雨或土壤湿度适当时即萌发，通过分解土壤有机质(如作物秸杆)，其菌丝沿异源菌体缠绕并分泌细胞产物将异源菌物杀死，或抑制其他杂菌生长，保护农作物。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种成本低、效率高、无污染的绿色木霉突变株的发酵方法及应用。
[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0006]—种绿色木霉突变株的发酵方法，包括以下步骤:
[0007](I)液体发酵，包括以下步骤:
[0008]11)菌株的活化:将经秋水仙碱化学诱变的绿色木霉突变株接种到I3DA培养基上培养5?7天，使其菌物活化并适应发酵的新环境；
[0009]12)活化后菌株的孢子悬浮液培养:取活化后的菌株，接种培养于可在显微镜下显示孢子成熟，用1ml无菌水冲洗活化后的孢子至150ml无菌三角瓶中，然后在恒温摇床上以12(^/1^11振荡201^11，使孢子团充分分散后，用血球计数器计数，再以1\108个/1111的接种量接种于一定体积并装有液体培养基的发酵罐中发酵5?7天，得到活化后菌株的孢子悬浮液;在发酵过程中，用0.10?0.25mol NaOH调节pH于4.3?6.5之间；
[0010](2)固体发酵，包括以下步骤:
[0011]21)固体发酵培养基料准备:按照质量百分比计，由碳素38%、氮素4%、磷酸盐矿质元素I %、石碳粉22%、水25%和菌物10%组成;所述的碳素源自含水率均<10%的甘蔗渣、作物秸杆粉、麦麸、玉米壳粉、碎米糠中的一种或两种以上的混合物;所述的氮素包括无机氮源和有机氮源，无机氮源为尿素、(NH4)N03、NaN03、亚硝酸钠和硫酸钱中的一种或两种以上的混合物，有机氮源为蛋白胨、鱼粉和血粉中的一种或两种以上的混合物;所述的磷酸盐矿质元素为KH2P04、K2HP04、Na2HP04、NaH2P04、(ΝΗ4)2ΗΡ04和(NH4)H2PO冲的一种或两种以上的混合物;所述的菌物源自步骤(I)中的活化后菌株的孢子悬浮液;所述的血粉的配制:收购集贸市场宰杀后的动物血，倒入蒸煮锅的沸水中，3min即捞出沉淀，粉碎风干或烘干再打成粉末，即为血粉；
[0012]22)固体发酵:将碳素、氮素、磷酸盐矿质元素、石碳粉按上述比例组合，经充分搅拌，于蒸煮锅或消毒罐在1.13个大气压下高温消毒30min，出料，冷至室温后，按比例加入步骤(I)中活化后菌株的孢子悬浮液，经充分拌匀后，转入大型发酵罐控温发酵5?7天，发酵温度在28 ±0.5°C，冷风吹干包装，即得绿色木霉突变株的发酵产物。
[0013]作为本发明进一步的方案:所述步骤12)中，还按照每升体积溶液加入80单位青霉素200yL的量，添加80单位青霉素;发酵罐内需持续通过供氧装置保持供氧，同时，还需保持发酵罐内留有1/3?2/5的空间。
[0014]作为本发明进一步的方案:所述步骤12)中，在发酵过程中，用0.10?0.25molNaOH调节pH于5.3?6.2之间。
[0015]作为本发明进一步的方案:所述步骤12)中，还包括采用旋转蒸发或真空浓缩的方法将得到的活化后菌株的孢子悬浮液浓缩至3?5倍。
[0016]作为本发明进一步的方案:所述的作物秸杆粉包括甘蔗杆粉、玉米杆粉、稻杆粉和豆类秸杆粉。
[0017]作为本发明进一步的方案:所述的碳素为麦麸+甘蔗杆粉、玉米壳粉+麦麸、甘蔗杆粉+玉米壳粉、麦麸+碎米糠、碎米糠+玉米壳粉、玉米壳粉中的一种。
[0018]作为本发明进一步的方案:所述的碳素为玉米壳粉+麦麸，麦麸+甘蔗杆粉，或者碎米糠+玉米壳粉;所述的无机氮源为硝酸铵和尿素;所述的有机氮源为蛋白胨和血粉;所述的磷酸盐矿质元素为质量比为KH2P04，或者等质量的ΚΗ2Ρ04+(ΝΗ4)2ΗΡ04。
[0019]作为本发明进一步的方案:所述步骤(I)中，液体培养基的配制:去皮马铃薯600g，先切成薄片再粉碎煮沸20min，用尾布过滤并拧干弃渣留汁，加入45g麦麸或玉米壳粉或碎米糠作为B族维生素供体，煮沸半小时以上，趁热过滤弃渣;加蔗糖60g、蜂蜜90g，用注射器从发酵罐加样孔注入80万单位青霉素，酵母粉15g，浓度为10g/L的胶态几丁质3ml，再加水直至5L发酵罐内仅余下2L的空间，灭菌；所述的胶态几丁质的配制:称取几丁质10g，加入10ml于4°C预冷的85%磷酸溶液，充分混合，并置于4°C保温2个昼夜，再加入过量pH值为
6.0的磷酸缓冲液调整几丁质浓度为10g/L，放入玻璃瓶中，加入直径3mm的玻璃珠，再于摇床上以180r/min的速度振荡2h，即可得到浓度为10g/L的胶态几丁质。
[0020]作为本发明进一步的方案:所述步骤(2)中，固体发酵所用培养基的组分及配比为:去皮马铃薯150?20(^/1;蔗糖101.58/1;磷酸钠3.5-5.0% ；FeSO4 0.I?0.3g;KH2P04
0.2?2.0g;MgS04 0.5?0.35g;CaS04 0.5?0.1Og;ZnSO4 0.1?0.2g;重蒸水1.0L;pH自然状态。
[0021]所述的发酵方法制得的绿色木霉突变株的发酵产物在制备防治土传病的药剂中的应用。
[0022]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0023]本发明所采用的绿色木霉突变株是从残腐木材上分离纯化出来的野生菌株经化学诱变而获得高效抗小麦赤霉病等类土传病的突变菌株，其是一种有遗传缺陷的突变株，只需要合适的培养基，它就能较好生长并合成较野生菌株更高产量和抗菌性较好的生物活性产物，以提高目标产物的使用价值，降低生产成本，达到较好经济效益。该绿色木霉突变株的抗菌目标产物几丁质酶、纤维素酶的活性较野生型分别由340U提高至710U，14U上升至58U，可以用于防止土壤中的有害病原菌物，一方面，可以避免其危害农作物导致的减产，另一方面，还可以避免其通过食物链影响人畜健康。
[0024]本发明通过筛选出几丁质和微晶羧甲基纤维素作为诱导物进行促进该真菌对几丁质酶和纤维素酶的合成并依该菌的嗜甘蔗糖的特性，以禾本科作物秸杆、畜禽屠宰血为氮源为基料进行发酵，达到既对作物抗病又促进生长，还可实现充分对农牧业宰杀废弃物进行综合利用，减少环境污染，促进经济、社会、生态三个效益协同发展。本发明方法成本低、效率高、无污染。
【具体实施方式】
[0025]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
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