6]实施例1
[0027]本发明实施例中，一种绿色木霉突变株的发酵方法，包括以下步骤:
[0028](I)液体发酵，包括以下步骤:
[0029]11)菌株的活化:将经分离筛选诱变的绿色木霉突变株接种到PDA培养基上培养5?7天，使其菌物活化并适应发酵的新环境；
[0030]其中绿色木霉突变株的诱变过程为:先从野外植物腐烂残体的水溶液取样，于26°C接种于TOA固体培养基上培养3?5天，对照国家微生物菌库所公布图样M1、M2进行筛选鉴定后，经二代连续培养出纯化绿色木霉菌株;将纯化绿色木霉菌株再经液态I3DA培养基(该液体PDA培养基按照重量百分比由以下物质配置而成:马铃薯2?3 % ;鱼蛋白粉0.5?3.3% ；FeS04 0.01 ?0.03% ;KH2P04 0.02?0.20% ;MgS04 0.05?0.35% !Na2B2O7.1H2O
0.025?0.05% ；Na2SeO3 0.025?0.05% ,ZnSO4 0.01 ?0.02%，余量为水；pH值调至5.8?6.5，培养温度为27±1.0°C，培养时间为5天)中扩大培养，离心去清液(保留冰箱4°C)，测定活性，再用二级纯水洗涤，以8000r/min离心15min，取沉淀并重复一次扩大培养，离心去清液(保留冰箱4°C)，测定活性，再用二级纯水洗涤，以8000r/min离心15min，取沉淀吹干后保存于冰箱暗处，以保障菌物优良特征改变较小;将离心后的清液放入PDA培养基中，以几丁质或者结晶羧酸纤维素钠为反应底物(其中几丁质的添加量是单独按照发酵物体积容量配制(10g/L)加入发酵容器内，结晶羧酸纤维素钠的加入也是单独按照发酵物体积容量配制(10g/L)加入发酵容器内)，以化学诱变剂一一秋水仙碱作为诱变剂，进行诱变，其中诱变剂的浓度为0.005?0.08wt % ；诱变时间为6?120h，诱变终止后，经离心取沉淀物，即为绿色木霉突变株，置于暗处稳定4?6h，避免遇光恢复突变而导致失败。
[0031]12)活化后菌株的孢子悬浮液培养:取活化后的菌株，接种培养于可在显微镜下显示孢子成熟，用1ml无菌水冲洗活化后的孢子至150ml无菌三角瓶中，然后在恒温摇床上以12(^/1^11振荡201^11，使孢子团充分分散后，用血球计数器计数，再以1\108个/1111的接种量接种于一定体积并装有液体培养基的发酵装置罐(V:30L-5吨)中发酵5?7天，得到活化后菌株的孢子悬浮液；
[0032]其中发酵罐有效体积的设定为:该类真菌的发酵为有氧发酵，为保障发酵有效性，需持续通过一定供氧装置保持供氧，除不停搅拌充氧外，还使发酵罐内保持1/3?2/5空间无液体培养基沾壁及罐底，防止杂菌污染。
[0033]发酵体系的防杂菌污染:绿色木霉虽抗土传病的病原体，但在发酵过程中仍受同类不同菌株污染而影响抗菌性，在发酵过程中，每升体积溶液需加80单位青霉素200yL。
[0034]发酵罐内反应体系pH控制:发酵的启动、延续与周围环境pH紧密相关，关键启动后延续时间和产物的产量高低，及时检测，用0.10?0.25mol或0.10?0.25mol NaOH调节pH于4.3?6.5之间，以5.3?6.2较好。
[0035]发酵物主要产物的活力测定:活力的测定表示产品质量的高低、抗菌作用的有效性。以所产几丁质酶和纤维素酶活性大小最重要，前者用DN5法测定(李江遐，蒋立科;木霉在坪用黑麦草上应用效果初报[J])草业科学，2008，23(1):103-105);后者用滤纸糖-DNA法测定[孔雷等，滤纸糖-DNA比色法测定纤维素酶酶活力[J]印染，1999，25(1):36?38]。
[0036]发酵液的浓缩与储存，液体发酵产物的活性大小与发酵液有效物含量相关，欲保持较高活性需通过浓缩达到一定浓度，一般常温下需浓缩至3?5倍，方可达到6个月后，浓缩液活性物质的活性(即酶活)不低于原活性的50%以下。故常采用旋转蒸发或真空浓缩，前者较理想。
[0037](2)固体发酵，包括以下步骤:
[0038]21)固体发酵培养基料准备:
[0039]固体发酵的糖类基料:收集制作压榨后的甘蔗渣(或玉米杆、稻草、豆类秸杆等)晒干粉碎成0.10?0.50mm，经自然风干或红外烘干，使含水量< 10 %，储存;麦麸、玉米壳及碎米糠(同样干燥)；普通自来水；
[0040]固体发酵的其他非糖类基料:收购集贸市场宰杀后的动物血，倒入蒸煮锅的沸水中，3min即捞出沉淀，粉碎风干或烘干再打成粉末，即为血粉，用瓶装储放。
[0041 ]固体发酵所需无机元素:KH2PO4；Na2HPO4； NaH2PO4； (NH4)NO3，尿素，(順4)2SO4，MgSO4o
[0042]发酵诱导物:由于发酵的菌株是嗜几丁质缺陷型，需要供给几丁质或能供给含几丁质的中间体，促进菌株繁育，合成高产高效几丁质抗菌酶的几丁质，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、蛋白胨。
[0043]固体发酵基料配比组合:
[0044]1、外加碳源
[0045]A.名称:麦麸、甘蔗杆粉、玉米杆粉、碎米糠、玉米壳粉。
[0046]B.碳源组合:①麦麸+甘蔗杆粉;②玉米壳粉+麦麸;③甘蔗杆粉+玉米壳粉;④麦麸+碎米糠;⑤碎米糠+玉米壳粉;⑥玉米壳粉。
[0047]上述6组均合适，其中以①和⑤较好，既含有绿色木霉所嗜好的糖，又有代谢合成所需的维生素和矿物质。
[0048]2、外加氮源
[0049]其较合适的氮源:无机氮源(尿素，(NH4)NO3 ,NaNO3，亚硝酸钠，硫酸铵)；有机氮源(蛋白胨，鱼粉，血粉)。其中无机氮中以硝酸铵和尿素较好，来源容易而广泛，易于操作;有机氮中以蛋白胨和血粉较好，来源容易，成本低，且发酵快。
[0050]磷酸盐矿质元素:KH2PO4，K2HPO4，Na2HPO4，(NH4)H2PO4，其中以1:1 的KH2PO4+ (NH4)2ΗΡ04或单独的KH2PO4为好，用量各为Iwt %。
[0051]固体培养基组合:质量比为1:4的玉米壳粉+麦麸，或质量比为3:2的麦麸+甘蔗杆粉，将碳素设为A，氮素设为B，磷酸盐矿质元素为C，石碳粉设为D，水为E，菌物为F，所成比为Α38 Β4 Cl D22 Ε25 FlQ每个字母右下角为发酵系统的质量百份数。
[0052]22)固体发酵:将A、B、C、D按上述比例组合，经充分搅拌，于蒸煮锅或消毒罐高温消毒(1.13个大气压下)消毒30min，出料，冷至室温后，依设定份额加入步骤(I)中活化后菌株的孢子悬浮液，经充分拌匀后，转入大型发酵罐控温(28±0.5°C)发酵5?7天，冷风吹干包装，即得绿色木霉突变株的发酵产物。发酵中需定时(6?8h)抽样检测pH。
[0053]具体地，本发明实施例中，按固液两种产物设计重量比，配制培养基:
[0054]固体制种培养基:去皮马铃薯150?200g/L;蔗糖101.5g/L;磷酸钠3.5-5.0%;FeS040.1?0.3g;KH2P04 0.2?2.0g;MgS04 0.5?0.35g;CaSO4 0.5?0.10g;ZnS04 0.1 —0.2g;重蒸水1.0L; pH自然状态；
[0055]诱导补偿物的配制:称取诱导物几丁质(亦称甲壳素)(若本地有化剂公司可从当地购取)1g，加入10ml于4°C预冷的85 %磷酸溶液，充分混合，并置于4°C保温2个昼夜;再加入过量pH值为6.0的磷酸缓冲液调整几丁质浓度为10g/L，放入厚壁玻璃瓶中，加入直径3mm的玻璃珠，再于摇床上以180r/min的速度振荡2h，S卩可得到浓度为10g/L的胶态几丁质，用于诱导缺陷型绿色木霉突变株产抗病菌的几丁质酶和纤维素酶，提高抗病害效果。若无上述诱导物几丁质，则可参照蒋立科方法自制(ZL200510039128.X)。
[0056]蒋立科制几丁质的方法:将经剔除残余(剩)腐肉后的贝壳、蟹壳、虾皮等洗净烘干，粉碎成粉末，0.2mol cp级盐酸浸提I个昼夜，并不停搅拌(或用电磁振荡器搅拌80次/min)，过滤或离心所得沉淀物用自来