水洗涤至中性，再用蒸馏水洗去氯离子，干燥粉碎即可。
[0057]液体培养基:去皮马铃薯600g，先切成薄片再粉碎煮沸20min，用尾布过滤并拧干弃渣(留作饲料)留汁，加入45g麦麸(或等重的玉米壳粉，或等重的碎米糠)作为B族维生素供体，煮沸半小时以上，趁热过滤弃渣;加蔗糖60g、蜂蜜90g，用注射器从发酵罐加样孔注入80万单位青霉素，酵母粉15g，浓度为1g/!的胶态几丁质3ml，再加水直至5L发酵罐内相当于3L的体积，灭菌。
[0058]本发明所采用的绿色木霉突变株是从残腐木材上分离纯化出来的野生菌株经化学诱变而获得高效抗小麦赤霉病等类土传病的突变菌株，其是一种有遗传缺陷的突变株，只需要合适的培养基，它就能较好生长并合成较野生菌株更高产量和抗菌性较好的生物活性产物，以提高目标产物的使用价值，降低生产成本，达到较好经济效益。该绿色木霉突变株的抗菌目标产物几丁质酶、纤维素酶的活性较野生型分别由340U提高至710U，14U上升至58U，可以用于防止土壤中的有害病原菌物，一方面，可以避免其危害农作物导致的减产，另一方面，还可以避免其通过食物链影响人畜健康。
[0059]本发明通过筛选出几丁质和微晶羧甲基纤维素作为诱导物进行促进该真菌对几丁质酶和纤维素酶的合成并依该菌的嗜甘蔗糖的特性，以禾本科作物秸杆、畜禽屠宰血为氮源为基料进行发酵，达到既对作物抗病又促进生长，还可实现充分对农牧业宰杀废弃物进行综合利用，减少环境污染，促进经济、社会、生态三个效益协同发展。
[0060]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0061]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【主权项】
1.一种绿色木霉突变株的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)液体发酵，包括以下步骤: 11)菌株的活化:将经秋水仙碱化学诱变的绿色木霉突变株接种到PDA培养基上培养5?7天，使其菌物活化并适应发酵的新环境； 12)活化后菌株的孢子悬浮液培养:取活化后的菌株，接种培养于可在显微镜下显示孢子成熟，用1ml无菌水冲洗活化后的孢子至150ml无菌三角瓶中，然后在恒温摇床上以12(^/1^11振荡201^11，使孢子团充分分散后，用血球计数器计数，再以1\108个/1111的接种量接种于一定体积并装有液体培养基的发酵罐中发酵5?7天，得到活化后菌株的孢子悬浮液;在发酵过程中，用0.10?0.25mol NaOH调节pH于4.3?6.5之间； (2)固体发酵，包括以下步骤: 21)固体发酵培养基料准备:按照质量百分比计，由碳素38%、氮素4%、磷酸盐矿质元素1%、石碳粉22%、水25%和菌物10%组成;所述的碳素源自含水率均<10%的甘蔗渣、作物秸杆粉、麦麸、玉米壳粉、碎米糠中的一种或两种以上的混合物;所述的氮素包括无机氮源和有机氮源，无机氮源为尿素、(NH4)NO3、NaN03、亚硝酸钠和硫酸钱中的一种或两种以上的混合物，有机氮源为蛋白胨、鱼粉和血粉中的一种或两种以上的混合物;所述的磷酸盐矿质元素为KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO4、(順4) 2ΗΡΟ4和(順4) H2PO4中的一种或两种以上的混合物;所述的菌物源自步骤(I)中的活化后菌株的孢子悬浮液;所述的血粉的配制:收购集贸市场宰杀后的动物血，倒入蒸煮锅的沸水中，3min即捞出沉淀，粉碎风干或烘干再打成粉末，即为血粉； 22)固体发酵:将碳素、氮素、磷酸盐矿质元素、石碳粉按上述比例组合，经充分搅拌，于蒸煮锅或消毒罐在1.13个大气压下高温消毒30min，出料，冷至室温后，按比例加入步骤(I)中活化后菌株的孢子悬浮液，经充分拌匀后，转入大型发酵罐控温发酵5?7天，发酵温度在28 ±0.5°C，冷风吹干包装，即得绿色木霉突变株的发酵产物。2.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法，其特征在于，所述步骤12)中，还按照每升体积溶液加入80单位青霉素200yL的量，添加80单位青霉素;发酵罐内需持续通过供氧装置保持供氧，同时，还需保持发酵罐内留有1/3?2/5的空间。3.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法，其特征在于，所述步骤12)中，在发酵过程中，用0.10?0.25mol NaOH调节pH于5.3?6.2之间。4.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法，其特征在于，所述步骤12)中，还包括采用旋转蒸发或真空浓缩的方法将得到的活化后菌株的孢子悬浮液浓缩至3?5倍。5.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法，其特征在于，所述的作物秸杆粉包括甘蔗杆粉、玉米杆粉、稻杆粉和豆类秸杆粉。6.根据权利要求5所述的绿色木霉突变株的发酵方法，其特征在于，所述的碳素为麦麸+甘蔗杆粉、玉米壳粉+麦麸、甘蔗杆粉+玉米壳粉、麦麸+碎米糠、碎米糠+玉米壳粉、玉米壳粉中的一种。7.根据权利要求6所述的绿色木霉突变株的发酵方法，其特征在于，所述的碳素为玉米壳粉+麦麸，麦麸+甘蔗杆粉，或者碎米糠+玉米壳粉;所述的无机氮源为硝酸铵和尿素;所述的有机氮源为蛋白胨和血粉；所述的磷酸盐矿质元素为质量比为KH2PO4,或者等质量的ΚΗ2Ρ04+(ΝΗ4)2ΗΡ04。8.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法，其特征在于，所述步骤(I)中，液体培养基的配制:去皮马铃薯600g，先切成薄片再粉碎煮沸20min，用尾布过滤并拧干弃渣留汁，加入45g麦麸或玉米壳粉或碎米糠作为B族维生素供体，煮沸半小时以上，趁热过滤弃渣;加蔗糖60g、蜂蜜90g，用注射器从发酵罐加样孔注入80万单位青霉素，酵母粉15g，浓度为10g/L的胶态几丁质3ml，再加水直至5L发酵罐内仅余下2L的空间，灭菌;所述的胶态几丁质的配制:称取几丁质10g，加入10ml于4°C预冷的85%磷酸溶液，充分混合，并置于4°C保温2个昼夜，再加入过量pH值为6.0的磷酸缓冲液调整几丁质浓度为10g/L，放入玻璃瓶中，加入直径3mm的玻璃珠，再于摇床上以180r/min的速度振荡2h，S卩可得到浓度为10g/L的胶态几丁质。9.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中，固体发酵所用培养基的组分及配比为:去皮马铃薯150?200g/L;蔗糖101.5g/L;磷酸钠3.5-5.0% ；FeS04 0.1?0.3g;KH2P04 0.2?2.0g;MgS04 0.5?0.35g;CaS04 0.5?0.10g;ZnS040.1?0.2g;重蒸水1.0L;pH自然状态。10.如权利要求1?9任一所述的发酵方法制得的绿色木霉突变株的发酵产物在制备防治土传病的药剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种绿色木霉突变株的发酵方法及应用，所述方法包括：菌株的活化；活化后菌株的孢子悬浮液培养；固体发酵培养基料准备；固体发酵得到绿色木霉突变株的发酵产物，该发酵产物可用于制备防治土传病的药剂。本发明通过筛选出几丁质和微晶羧甲基纤维素作为诱导物进行促进该真菌对几丁质酶和纤维素酶的合成并依该菌的嗜甘蔗糖的特性，以禾本科作物秸秆、畜禽屠宰血为氮源为基料进行发酵，达到既对作物抗病又促进生长，还可实现充分对农牧业宰杀废弃物进行综合利用，减少环境污染，促进经济、社会、生态三个效益协同发展。
【IPC分类】A01P3/00, C12N1/14, C12R1/885, A01P21/00, A01N63/04
【公开号】CN105505799
【申请号】CN201610049068
【发明人】李晓白, 蒋立科
【申请人】李晓白
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月26日