一种赤霉菌角蛋白酶及其发酵和应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于工业生物技术领域，涉及一株产角蛋白酶的赤霉菌及其发酵和应用方 法。
【背景技术】
[0002] 角蛋白是一种难降解蛋白，广泛存在于动物的爪、角、毛等组织，对动物起保护作 用；角蛋白由于存在大量的二硫键、氢键结构致密，所以不易被普通蛋白酶降解。角蛋白酶 是一种能专一性降解角蛋白的蛋白水解酶类，可以由真菌、细菌和放线菌等多种微生物产 生。
[0003] 角蛋白酶具有突出的清洁性能和效果，处理条件温和，对环境无污染，因此，相对 于传统的化学洗涤剂，具有一定的优势和应用潜力。所以，角蛋白酶的去污能力和增强化学 洗涤剂去污效果的能力使其可作为洗涤剂配方中的添加剂。另外，角蛋白酶在制革工业中 同样具有重要应用；目前制革工业中脱毛基本采用灰碱法，但是脱毛废液中含有高浓度的 硫化物，严重污染环境，而以角蛋白酶为催化剂的酶法替代或者半替代灰碱法脱毛便既可 以保证皮革脱毛质量，又可以彻底消除或者降低硫化物对环境的污染，酶法具有清洁性、环 境友好、作用效率高等特征，因此在制革中具有广泛的应用前景。传统研究主要针对细菌来 源的角蛋白酶开展工作，真菌角蛋白酶作为一种重要的微生物资源，其潜力还远未得到开 发。
[0004] 本发明目的在于提供一株产角蛋白酶的赤霉菌，并初步考察其酶学性质及在洗涤 剂行业和制革脱毛中的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的发明人获得一株产角蛋白酶的真菌菌株，命名为赤霉菌Gibberel la intermedia CA3-1，于2011年5月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号 为CGMCC No.4903。
[0006] 本发明对提供的产角蛋白酶的赤霉菌株发酵条件进行了初步优化，获得了对该菌 株进行培养的发酵培养基及发酵条件，培养基配方为:蛋白胨l-l〇g/L、麦芽糊精5-20g/L、 NH4CI 0.1-5g/L、NaCl 0.1-5g/L、K2HP〇4*3H2〇 0.1_2g/L、KH2P〇4 〇.l_2g/L、MgCl2*6H2〇 0 · 1 -1 g/L、羊毛粉 5-15g/L，初始 pH 值为 6-9。
[0007] 发酵培养条件为:接种量为1-10%、培养温度20-40°C、转速为100-400rpm，发酵周 期为30-80h，产角蛋白酶活力为109U/mL。
[0008] 所述的赤霉菌角蛋白酶酶学性质研究结果:分别考察了作用温度和作用pH对该酶 活力的影响，发现该角蛋白酶的最适作用温度和pH分别是60°C和pH 9;该酶对角蛋白和酪 蛋白酶活高、对胶原蛋白酶活低;PMSF对其的抑制作用显示该酶属于丝氨酸蛋白酶类;活性 可以被巯基乙醇完全抑制；而DTT对其有促进作用（约1.5倍）；SDS对酶活具有促进作用。 该酶为中温碱性蛋白酶。
[0009]本发明具有以下有益效果:本发明提供了一种适用于工业化生产角蛋白酶的赤霉 菌菌种，并优化了相应的发酵条件，发酵酶活力在100U/mL以上。所获得角蛋白酶对表面活 性剂具有良好的耐受性。该菌株所产真菌角蛋白酶，对多种商用洗涤剂有较好的耐受性，并 且可在30min内独立或者辅助洗涤剂在15min内高效去除棉布血污，可以应用于洗涤剂行 业。采用本发明的菌株所产真菌角蛋白酶，可以在24h内完成对羊皮的脱毛，可应用于制革 行业。
【附图说明】
[0010]图1.赤霉菌角蛋白酶的最适pH。
[0011] 图2.赤霉菌角蛋白酶的最适温度。
[0012] 图3.底物特异性。1，可溶性角蛋白；2,酪蛋白；3,明胶;4，BSA;5，Type-I胶原蛋白； 6，AAPF; 7，偶氣酷蛋白；8，羊毛粉;9，羽毛粉;10，人发;11，天青角蛋白。
[0013] 图4 ·赤霉菌角蛋白酶对洗涤剂的耐受性。1，Bluemoon; 2，Comfort; 3，Walch; 4， 班1；^6〇31:;5儿让7;6,〇]\0;7,3即61';8，1(丨8口3。无洗涤剂的酶活设定为100%。
[0014]图5.赤霉菌角蛋白酶的去污效果。a，未经处理的血污;b，无血污棉布;c，血污棉布 经100mL的自来水处理15min;d，血污棉布经100mL的洗涤剂(0.7mg/mL)处理15min; e，血污 棉布经100mL的角蛋白酶(60U/mL)处理15min;f，血污棉布经100mL的角蛋白酶(60U/mL)和 洗涤剂(〇. 7mg/mL)处理 15m i η。
[0015] 图6.去污效果电镜扫描图.al、a2，血污棉布;bl、b2，无血污棉布;cl、c2，血污棉布 经洗涤剂处理;dl、d2,有血污棉布经酶处理;el、e2,血污棉布经酶和洗涤剂共同处理。
[0016] 图7.赤霉菌角蛋白酶脱毛效果研究。a，羊皮经水处理24h; b，羊皮经酶处理24h，c， 羊皮经化学方法脱毛;d体式显微镜观察酶处理24h羊皮;e体式显微镜观察经化学法脱毛的 羊皮。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1赤霉菌产角蛋白酶发酵条件优化
[0018] 从实验室已有菌株中筛选获得一株产角蛋白酶的菌株，命名为赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1，于2011年5月24日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国 科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 4903。
[0019] 利用单因素优化策略，选取不同的碳源、氮源、无机盐和温度、pH及转速，对赤霉菌 的发酵培养基及发酵条件进行优化。得到最适培养基配方为(g/L):蛋白胨5、麦芽糊精10、 NH4CI 0.5、NaCl 0.5、Κ2ΗΡ〇4·3Η2〇 0.3、KH2P〇4 0.4、MgCl2.6H20 0.1、羊毛粉 10,初始pH 9.0。发酵条件选为：培养温度30°C、转速为200rpm。发酵周期为60h，产角蛋白酶活力为 1091]/11^，是优化前的7.27倍。
[0020] 实施例2赤霉菌角蛋白酶酶学性质研究
[0021 ]研究了所产赤霉菌角蛋白酶的粗酶性质，分别考察了作用温度(30、40、50、60、70) 和作用?讯6、7、8、9、10、11、12)对该酶活力的影响，发现该角蛋白酶的最适作用温度和?!1分 别为60°C和9.0(图1和图2)。
[0022]抑制剂、表面活性剂和有机溶剂对角蛋白酶活性的作用，显示该酶属于丝氨酸蛋 白酶类；角蛋白酶活性可以被β-巯基乙醇完全抑制；而DTT却对其有促进作用（相对酶活 157% )，SDS也对其具有一定促进作用(表1)。
[0023] 赤霉菌角蛋白酶底物特异性从高到底依次是偶氮酪蛋白〉可溶性角蛋白〉羊毛粉〉 羽毛粉;对I型胶原蛋白活性低;对明胶没有酶活(图3)。
[0024] 表1.多种抑制剂、表面活性剂和有机溶剂对角蛋白酶活性的影响
[0026] ND代表没有检测到酶活。
[0027]实施例3赤霉菌角蛋白酶对洗涤剂的耐受性和去污能力
[0028]赤霉菌角蛋白酶对洗涤剂的耐受性实验:如图4显示，在0.7 %和1.0 %商用洗涤剂 作用30min，赤霉菌角蛋白酶还保留有50-85 %的活性;并且高浓度洗涤剂对其角蛋白酶活 性有促进作用:浓度为5%和10%，除蓝月亮和金纺两种洗涤剂有抑制效果(至35%)，其他 多数洗涤剂表现出促进作用（10-75% )。
[0029] 赤霉菌角蛋白酶去污效果研究:该酶可以在20min内独立完成去除棉布血污，并且 可以协助洗涤剂(〇. 7mg/mL)在15min内完成去除血污（图5)，该酶对棉布纤维没有损伤效果 (图 6)。
[0030]实施例4赤霉菌角蛋白酶的脱毛能力
[0031]赤霉菌角蛋白酶可以独立完成脱毛，图7显示，该角蛋白酶在24h内可以对羊皮进 行彻底脱毛，且相对于阴性对照和阳性对照来说，酶法脱毛对羊皮未造成明显损伤;感官检 测显示酶法脱毛后的羊皮颜色较亮、更加柔软，且表面光滑。
【主权项】
1. 一株产真菌角蛋白酶的菌株，为赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1，于2011年5 月24日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国普 通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.4903。2. -种赤霉菌产角蛋白酶方法，其特征在于采用赤霉菌CGMCC No. 4903进行液体发酵， 发酵培养基组成成分为：蛋白胨l-l〇g/L、麦芽糊精5-208/1、顺4(：10.1-5 8/1、似(：10.1-5g/L、K2HP〇4.3H2〇 0.1-2g/L、KH2P〇4 0.1-2g/L、MgCl2.6H20 Ο.Ι-lg/L、羊毛粉5-15g/L， 初始pH值为6-9。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于采用赤霉菌CGMCC No . 4903进行液体发酵，其 发酵培养条件为:培养温度20_40°C、转速为100-400rpm，发酵周期为24-80h。4. 一种赤霉角菌蛋白酶的应用方法，其特征在于可单独或与其他酶制剂复配后应用在 洗涤剂添加剂、纺织用酶、制革用酶行业。
【专利摘要】本发明公开了一株产角蛋白酶的真菌赤霉菌Gibberella？intermedia？CA3-1及其应用方法。经初步发酵优化后真菌角蛋白酶的活力可达109U/mL；该酶对角蛋白和酪蛋白酶活高、对胶原蛋白酶活低，SDS对酶活具有促进作用。所产角蛋白酶可独立完成或协助去污剂完成去除棉布上的污渍，提高洗涤效率。同时，该真菌角蛋白酶可完成对羊皮的脱毛处理。本发明所获得的产真菌角蛋白酶的赤霉菌在洗涤、制革、纺织领域具有良好的应用前景。
【IPC分类】C11D3/386, C12R1/645, C12N9/58, C12N1/14
【公开号】CN105505793
【申请号】CN201511026721
【发明人】史劲松, 龚劲松, 张荣先, 许正宏, 李恒, 窦文芳, 陆震鸣, 张旦旦
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月31日