用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，首先用马铃薯蔗糖琼脂培养基试管斜面培养霉菌孢子，然后用无菌生理盐水将孢子洗下，再将孢子悬液稀释至一定浓度后接种于马铃薯蔗糖液体培养基中培养，所得到的细小菌粒即为霉菌液体菌种。本发明方法简单，所得霉菌液体菌种大小均匀、性状一致，接种时能够保证各摇瓶接种量的一致性，大大增强了摇瓶发酵实验的可比性及可信度。
【专利说明】用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种霉菌液体菌种的制备方法，尤其适应于制备用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种。
【背景技术】
[0002]霉菌是形成分枝菌丝的真菌的统称。霉菌与人类生产和生活关系极其密切，除了可使人、畜、农作物、工农业产品患病和霉变外，其分泌的酶、药物、色素等化合物广泛应用于农业、纺织、食品、医药、皮革等行业中。为了获得新的霉菌菌株或提高已有霉菌代谢产物的产量，常常需要进行菌株筛选、诱变或发酵条件优化等实验。在这些实验操作过程中，均涉及到大量的对比实验用于比较不同菌株或不同发酵条件下目标代谢产物的产量，以便确定最佳菌株或最佳发酵条件。
[0003]为了真实的反应不同菌株间或不同发酵条件对目标产物产量的影响，在进行发酵比较实验时，必须采取措施最大限度的降低实验误差，其中，降低对比实验间接种量、减少菌种性状的差异就是简便有效的措施。对于霉菌来说，一般通过两种方式进行接种，一是接种菌丝球，该种方法往往无法进行准确的定量从而引起较大的实验误差；二是接种孢子，该方法虽能准确定量，但由于孢子生成的时间存在差异导致孢子性状不同，也会给实验带来一定的误差。
【发明内容】
[0004]本发明的目 的是:提供一种用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，该方法制备的霉菌种子能最大限度的保证各实验摇瓶的接种量和菌体性状的一致。
[0005]本发明的技术解决方案是该用于摇瓶对比实验的霉菌液体菌种的制备方法包括以下步骤:
(1)将一小块霉菌菌苔接种于马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基试管斜面上，于25-30°C培养箱培养96-192h,直至固体斜面长满孢子；
(2)将霉菌孢子用生理盐水洗下，稀释至一定浓度后，用5mL移液器将孢子悬液按一定比例接种于装有IOOmL马铃薯蔗糖液体培养基和少量玻璃珠的500mL三角瓶中，250C -30°CU00-120rmp转速下培养48_72h，直至培养液中长出大量的均匀一致的小菌粒，所得到的细小菌粒即为霉菌液体菌种。
[0006]其中，移取霉菌液体菌种的操作是:用5mL移液器按3_5%的体积比将小菌粒接种于相应的液体发酵培养基中，25°C -37°C、120-150rmp转速下进行发酵，得所需要的霉菌代谢产物。
[0007]其中，步骤(1)中，所用试管规格为20mmX200mm。
[0008]其中，步骤(1)中，马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基配制:将去皮土豆200g切成Icm3左右的小块，加蒸馏水1000mL煮沸30min后，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g、琼脂粉15g，加热至琼脂溶化后，用蒸馏水补足至1000mL,然后分装于试管，用硅胶塞塞紧，牛皮纸包扎后于高压灭菌锅中121°C灭菌20min，待培养基冷却至80°C时，摆成试管斜面至冷却凝固。
[0009]其中，步骤(2)中，霉菌孢子稀释后的浓度为:在620nm波长下吸光度为0.5-0.7，孢子悬液的接种比例为马铃薯蔗糖液体培养基体积的3-5%。
[0010]其中，步骤(2)中，马铃薯蔗糖液体培养基配制:将去皮土豆200g切成Icm3的小块，加蒸馏水1000mL煮沸30分钟后，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g溶解，用蒸馏水补足至lOOOmL，500mL三角瓶中分装IOOmL,再加入少量玻璃珠，最后用6层纱布包住瓶口，牛皮纸包扎后于高压灭菌锅内121°C灭菌20min。
[0011]其中，5mL移液器是指:剪掉移液器吸头尖端后，吸头的尖端孔径为2-3_。
[0012]本发明的优点是:所得霉菌小菌粒呈颗粒状，其菌球较小，大小及菌体性状一致，在将其接种至发酵培养基时能够保证各实验摇瓶接入量和菌体性状一致，从而提高了实验的可比性，增强了实验数据的可信度，最终提高了实验效率。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。
[0014]实施例1:依以下步骤制备米曲霉液体菌种用以比较淀粉酶的产生量
(O马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基配制:将去皮土豆200g切成Icm3左右的小块，加蒸馏水1000mL煮沸30min后，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g、琼脂粉15g，加热至琼脂熔化后，用蒸馏水补足至1000mL,分装于试管(20mmX 200mm)至三分之一体积处，用硅胶塞塞紧瓶口，牛皮纸包扎后于高压灭菌锅中121°C灭菌20min，待培养基冷却至80°C时摆成试管斜面至冷却凝固；
(2)将霉菌接种于试管固体斜面:取试管斜面保藏的米曲霉菌种，在超净工作台上用灭菌接种铲取小块菌苔，接种于步骤(1)的新鲜试管斜面上，塞好硅胶塞后置于25°C培养箱培养192h,直至培养基表面长满大量孢子为止；
(3)马铃薯鹿糖液体培养基配制:将去皮土豆200g切成Icm3的小块,加蒸懼水1000mL煮沸30分钟后，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g溶解，用蒸馏水补足至lOOOmL, 500mL三角瓶中分装IOOmL,再加入少量玻璃珠后用6层纱布包住瓶口，牛皮纸包扎后于高压灭菌锅内121°C灭菌20min ；
(4)将霉菌孢子接种于马铃薯蔗糖液体培养基中:取步骤(2)的新鲜培养的固体试管斜面种子，在超净工作台上，用5mL灭菌移液器吸取5mL灭菌生理盐水加入到试管斜面中，再用灭菌刮铲轻刮试管斜面，直至将所有霉菌孢子刮下，轻轻震荡试管，使孢子呈均匀分布状态，然后在试管中继续加入灭菌生理盐水直至孢子悬液在620nm波长下的吸光度为0.5，用灭菌枪头吸取制备好的孢子悬浊液加入马铃薯蔗糖液体培养基中，每个含IOOmL培养基的三角瓶中接入3mL孢子悬液； (5)菌粒培养:将接种后的三角瓶置于恒温振荡器中培养48h，转速为120rmp，培养温度为30°C，直至三角瓶中长出均匀的小米粒大小的菌粒；
(6)米曲霉液体菌种培养:取5mL移液器吸头，用剪刀剪掉吸头的尖头少许，使吸头出口直径为2mm，高压灭菌锅灭菌备用；将培养好的菌粒用处理过的移液器吸头吸取一定体积后快速接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的3%，用8层纱布包扎后置于恒温培养箱中25 °C、150rpm条件下培养，用以比较淀粉酶的产生量。
[0015]实施例2:依以下步骤制备青霉菌液体菌种用以比较青霉素的产生量
(O马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基配制:将去皮土豆200g切成Icm3左右的小块，加蒸馏水1000mL煮沸30min后，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g、琼脂粉15g，加热至琼脂熔化后，用蒸馏水补足至1000mL,分装于试管(20mmX 200mm)至三分之一体积处，用硅胶塞塞紧瓶口，牛皮纸包扎后于高压灭菌锅中121°C灭菌20min，待培养基冷却至80°C时摆成试管斜面至冷却凝固；
(2)将霉菌接种于试管固体斜面:取试管斜面保藏的青霉菌种，在超净工作台上用灭菌接种铲取小块菌苔，接种于步骤(1)的新鲜试管斜面上，塞好硅胶塞后置于27.5°C培养箱培养144h,直至培养基表面长满大量孢子为止；
(3)马铃薯鹿糖液体培养基配制:将去皮土豆200g切成Icm3的小块,加蒸懼水1000mL煮沸30分钟后，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g溶解，用蒸馏水补足至lOOOmL, 500mL三角瓶中分装IOOmL,再加入少量玻璃珠后用6层纱布包住瓶口，牛皮纸包扎后于高压灭菌锅内121°C灭菌20min ；
(4)将霉菌孢子接种于 马铃薯蔗糖液体培养基中:取步骤(2)的新鲜培养的固体试管斜面种子，在超净工作台上，用5mL灭菌移液器吸取5mL灭菌生理盐水加入到试管斜面中，再用灭菌刮铲轻刮试管斜面，直至将所有霉菌孢子刮下，轻轻震荡试管，使孢子呈均匀分布状态，然后在试管中继续加入灭菌生理盐水直至孢子悬液在620nm波长下的吸光度为0.6，用灭菌枪头吸取制备好的孢子悬浊液加入马铃薯蔗糖液体培养基中，每个含IOOmL培养基的三角瓶中接入4mL孢子悬液；
(5)菌粒培养:将接种后的三角瓶置于恒温振荡器中培养60h,转速为IlOrmp,培养温度为27.5°C，直至三角瓶中长出均匀的小米粒大小的菌粒；
(6)青霉菌液体菌种培养:取5mL移液器吸头，用剪刀剪掉吸头的尖头少许，使吸头出口直径为2.5mm,高压灭菌锅灭菌备用；将培养好的菌粒用处理过的移液器吸头吸取一定体积后快速接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的4%，用8层纱布包扎后置于恒温培养箱中31 °C、135rpm条件下培养，用以比较青霉素的产生量。
[0016]实施例3:依以下步骤制备木霉菌液体菌种用以比较纤维素酶的产生量
(O马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基配制:将去皮土豆200g切成Icm3左右的小块，加蒸馏水1000mL煮沸30min后，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g、琼脂粉15g，加热至琼脂熔化后，用蒸馏水补足至1000mL,分装于试管(20mmX 200mm)至三分之一体积处，用硅胶塞塞紧瓶口，牛皮纸包扎后于高压灭菌锅中121°C灭菌20min，待培养基冷却至80°C时摆成试管斜面至冷却凝固；
(2)将木霉菌接种于试管固体斜面:取试管斜面保藏的木霉菌菌种，在超净工作台上用灭菌接种铲取小块菌苔，接种于步骤(1)的新鲜试管斜面上，塞好硅胶塞后置于30°C培养箱培养96h,直至培养基表面长满大量孢子为止；
(3)马铃薯鹿糖液体培养基配制:将去皮土豆200g切成Icm3的小块,加蒸懼水1000mL煮沸30分钟后，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g溶解，用蒸馏水补足至lOOOmL, 500mL三角瓶中分装IOOmL,再加入少量玻璃珠后用6层纱布包住瓶口，牛皮纸包扎后于高压灭菌锅内121°C灭菌20min ；
(4)将木霉菌孢子接种于马铃薯蔗糖液体培养基中:取步骤(2)的新鲜培养的固体试管斜面种子，在超净工作台上，用5mL灭菌移液器吸取5mL灭菌生理盐水加入到试管斜面中，再用灭菌刮铲轻刮试管斜面，直至将所有霉菌孢子刮下，轻轻震荡试管，使孢子呈均匀分布状态，然后在试管中继续加入灭菌生理盐水直至孢子悬液在620nm波长下的吸光度为
0.7，用灭菌枪头吸取制备好的孢子悬浊液加入马铃薯蔗糖液体培养基中，每个含IOOmL培养基的三角瓶中接入5mL孢子悬液；
(5)菌粒培养:将接种后的三角瓶置于恒温振荡器中培养72h，转速为lOOrmp，培养温度为25°C，直至三角瓶中长出均匀的小米粒大小的菌粒； (6)木霉菌液体菌种培养:取5mL移液器吸头，用剪刀剪掉吸头的尖头少许，使吸头出口直径为3mm，高压灭菌锅灭菌备用；将培养好的菌粒用处理过的移液器吸头吸取一定体积后快速接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的5%，用8层纱布包扎后置于恒温培养箱中37°C、120rpm条件下培养，用以比较纤维素酶的产生量。
【权利要求】
1.用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤: (1)将一小块霉菌菌苔接种于马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基试管斜面上，于25-30°C培养96-192h，直至固体斜面长满孢子； (2)将霉菌孢子用生理盐水洗下，稀释至一定浓度后，用5mL移液器将孢子悬液按一定比例接种于装有IOOmL马铃薯蔗糖液体培养基和少量玻璃珠的500mL三角瓶中，250C -30°CU00-120rmp转速下培养48_72h，直至培养液中长出大量的均匀一致的小菌粒，所得到的细小菌粒即为霉菌液体菌种。
2.根据权利要求1所述的用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，其特征在于移取霉菌液体菌种的操作是:用5mL移液器按3-5%的体积比将小菌粒接种于相应的液体发酵培养基中，25°C -37°C、120-150rmp转速下进行发酵，得所需要的霉菌代谢产物。
3.根据权利要求1所述用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，所用试管规格为20mmX200mm。
4.根据权利要求1所述用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基配制:去皮土豆200g切成Icm3左右小块，加蒸馏水1000mL煮沸30min，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g、琼脂粉15g，加热至琼脂熔化后，用蒸馏水补足至1000mL,分装于试管，并用硅胶塞塞紧，牛皮纸包扎后于高压灭菌锅中121°C灭菌20min，待培养基冷却至80°C时，摆成试管斜面至冷却凝固。
5.根据权利要求1所述用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，霉菌孢子稀释后的浓度为:在620nm波长下吸光度为0.5-0.7。
6.根据权利要求1所述用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，孢子悬液的接种比例为马铃薯蔗糖液体培养基体积的3-5%。
7.根据权利要求1所述用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，马铃薯蔗糖液体培养基配制:将去皮土豆200g切成Icm3的小块，加蒸馏水1000mL煮沸30分钟后，用六层纱布滤去马铃薯块，在滤液中加蔗糖20g溶解，用蒸馏水补足至lOOOmL，500mL三角瓶中分装IOOmL,再加入少量玻璃珠用6层纱布包住瓶口，牛皮纸包扎后于闻压灭囷锅内121 C灭囷20min。
8.根据权利要求2所述用于摇瓶发酵对比实验的霉菌液体菌种的制备方法，其特征在于:5mL移液器是指:剪掉移液器吸头尖端后，吸头的尖端孔径为2-3_。
【文档编号】C12N1/14GK103966106SQ201410192861
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】李明华, 孟秀梅, 陆正清, 张贵英 申请人:江苏食品药品职业技术学院