具有增强子作用的家蚕BmMITE-2转座子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及的是一种来自家蚕的具有显著增强下游基因表达的微型反向重复转座子(BmMITE-2)。该增强子由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列组成。本发明是通过生物信息学方法在家蚕基因组中鉴定获得并通过转基因，细胞转染和分子生物学方法验证其具有增强子的功能，该发明不但有助于获取高丰度的目的蛋白推动家蚕生物反应器的发展而且有利于家蚕品种的改良。
【专利说明】具有增强子作用的家蚕BmM ITE-2转座子
【技术领域】
[0001]本发明涉及的生物【技术领域】，主要是家蚕转基因生物反应器和品种改良领域。
【背景技术】
[0002]转座子(transposon)或称转座兀件(transposableelements, TEs)是可以从基因组中的一个位置通过不同转座机制转移到另一个位置的所有移动元件(Finneganl989)。由于转座子不具有编码功能基因的能力，所以在很长一段时间内都被人们所忽视并且一度被认为是基因组中的垃圾DNA (junk DNA)。但是随着人们对转座子关注的不断加深，对其功能的不断探索和对其概貌的逐步认识，渐渐发现最初的认识完全是错误的。最近的研究发现转座子不但可以通过增加自身拷贝数来促进基因组的进化，还可以通过贡献调控序列和外显子序列来改变基因的表达、功能和结构。
[0003]目前大量的研究表明转座子不管是在基因的转录水平还是转录后水平，都可以直接影响邻近基因的表达。具体的调控机制有:(I)通过提供调控元件来调节其邻近基因的表达；(2)通过转座破坏已有的调控元件；(3)产生反义RNA来沉默邻近基因的表达等。但是已有的报道主要集中在少数转座子家族，如人类的Alu类转座子。
[0004] 微型反向重复转座元件(MITE)是一类不具有编码转座酶能力的非自主DNA转座子，其序列结构如图1所示。MITE转座子最初是由Bureau和Wessler在玉米种的基因组中发现并命名。目前对于其研究仍停留在对其全基因组鉴定和扩增机制上。目前已有的报道表明MITE转座子广泛分布于真核生物基因组中并且在基因组中通常具有高拷贝、高保守和偏向分布于基因附近等特征。但是真核生物基因组中为什么会保留如此多拷贝的MITE序列？为什么偏向分布于基因附近？带着这些疑问我们应用生物信息学的方法在家蚕基因组中鉴定出了具有高拷贝、高保守性和偏向分布于基因附近的BmMITE-2转座子。进一步通过转基因，细胞转染和一些常用的分子检测方法证明了该转座子具有增强子的作用。
【发明内容】
[0005]本发明是利用生物信息学，分子和细胞生物学方法在家蚕中鉴定并证实了家蚕BmMITE-2转座子起到了增强子的作用。目的在于将该元件构建到表达载体或者转基因载体中可以有效增加目的基因表达的效果。
[0006]本发明 申请人:利用生物信息学方法在家蚕基因组中鉴定了一个微型反向重复转座子BmMITE-2。应用PCR和TA克隆的方法在家蚕基因组中获得了该转座子的序列。测序验证为我们的目的序列。然后将该转座子分别连接到转基因载体PiggyBac (A3-EGFP-SV40)和细胞转染载体pGL3-Basic Vector载体的报告基因的5’端，再将这两个载体分别进行家蚕的转基因显微注射和细胞转染实验，结果证实了 BmMITE-2转座子具有增强子的作用。这不但有助于原核/真核表达获取高丰度的目的蛋白而且对家蚕生物反应器的发展也将起到推动作用。
[0007]本发明的家蚕增强子BmMITE-2通过以下步骤获得和证实:[0008](I)家蚕BmMITE-2转座子的鉴定:首先应用MUST软件在家蚕9倍基因组序列进行MITE转座子序列的搜索。结果在家蚕基因组中鉴定出BmMITE-2转座子。该转座子的一致序列(consensus sequence)长度278bp,末端反向重复序列(TIR)长度20bp (TGAGTCGACTATTATCAAAG)，TSD 为 TA。进一步以 BmMITE-2 的一致序列作为问询序列，用BLASTN程序在家蚕9倍基因组数据库中搜寻BmMITE-2的同源序列(e值<e_6，相似度>80% ,序列长度>80bp)，最终发现BmMITE-2转座子家蚕基因组中具有2790个拷贝。最后应用Perl程序分析这些拷贝在家蚕基因附近的分布情况，发现BmMITE-2转座子偏向分布于家蚕的基因附近。
[0009](2)家蚕BmMITE-2转座子序列的获得:以家蚕大造品系的基因组DNA为模板，BmMITE-2转座子的核苷酸序列设计特异性引物(构建细胞转染载体的上游引物为:5’GAGTGAGTCGACTATTATCAAAGCCGGCAATGTGACT-3’ ;构建细胞转染载体的下游引物为:5’ -GCTAGctgagtcgtctattatcaaaggtggcaatctgtgcat-S'下划线分别为限制性内切酶 Xho I 和 NheI酶切位点；构建转基因载体的上游引物为:5’ -AGATCTTGAGTCGACTATTATCAAAGCCGGCAATGTGACT-3’ ；构建转基因载体的下游引物为:5’ -AGATCTTGAGTCGTCTATTATCAAAGGTGGCAATCTGTGCAT-3’下划线为限制性内切酶bgl II酶切位点；)进行PCR扩增，获取目的条带，PCR产物回收后与PMD-19-T载体连接转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物工程公司测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致。
[0010](3)将目的片段构建到转基因载体和细胞转染载体
[0011]转基因载体构建:将含有目的片段的T克隆载体和转基因载体PiggyBac (A3-EGFP-SV40)分别用Bgl II进行酶切，分别回收目的片段和载体骨架，电泳检测后，将骨架进行去磷酸化处理，然后用DNA连接酶将目的片段BmMITE-2与转基因载体连接，并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选获得含有BmMITE-2重组质粒的克隆，然后将扩大培养的菌液送往上海生工生物工程公司测序，测序结果与第一次测得的序列一致，获得正确的克隆；
[0012]细胞转染载体构建:将含有目的片段的T克隆载体和细胞转染载体pGL3-BasicVector分别用限制性内切酶Xho I和Nhe I进行双酶切，分别回收目的片段和载体骨架，电泳检测后，用DNA连接酶将目的片段BmMITE-2与细胞转染载体连接，并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选获得含有BmMITE-2重组质粒的克隆，然后将扩大培养的菌液送往上海生工生物工程公司测序，测序结果与第一次测得的序列一致，获得正确的克隆；
[0013](4)转基因家蚕的获得，分子检测和细胞转染结果
[0014]对家蚕大造品系产下3-4小时内的蚕卵进行转基因显微注射，在Fl代进行转基因阳性家蚕的筛选和饲养。在2龄幼虫眠期，分别将有BmMITE-2插入和无BmMITE-2插入的转基因家蚕置于荧光显微 镜下拍照，比较不同转基因家蚕发出的绿色荧光信号的强弱。然后提取5龄3天的不同转基因家蚕的mRNA并反转录成cDNA，利用荧光定量PCR的方法检测绿色荧光蛋白基因EGFP在不同家蚕转基因系里的表达差异。
[0015]将构建好的具有BmMITE-2转座子插入的细胞转染载体，内参质粒和转染试剂一同转入家蚕的卵巢细胞系(BmN)内，转染后的细胞27°C培养24~48个小时候后，用荧光素酶活性检测仪来检测这两种报告基因的表达量。
[0016]本发明的优点是:[0017]目前对于家蚕的研究已进入后基因组即功能基因组时代，根据已有的报道大量与家蚕抗性和丝蛋白产量相关的基因被鉴定。然而寻找到合适的增强子来增加这些基因在家蚕中的表达以期获得抗病力强和高产茧丝的家蚕品种变得尤为迫切。所以我们发明的这一增强子不但有望推动家蚕优良品种的繁育而且可能对家蚕生物反应器的发展起到推动作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为转基因验证BmMITE-2转座子具有增强子作用。其中A显示的分别是具有和没有BmMITE-2转座子插入的转基因载体pBac(A3-EGFP-SV40)整合进家蚕基因组后的转基因系在体视显微镜下呈现的绿色荧光信号强度。B为荧光定量PCR检测不同转基因系报告基因EGFP的mRNA表达情况。
[0019]图2为双荧光素酶报告基因检测结果。
【具体实施方式】
[0020]实施例1:
[0021]家蚕BmMITE-2转座子的鉴定:应用MUST软件在家蚕9倍基因组序列进行MITE转座子序列的搜索。结果在家蚕基因组中鉴定出BmMITE-2转座子(NCBI登录号为KC874840)。该转座子的一致序列(consensus sequence)长度278bp,末端反向重复序列(TIR)序列长度2(^口0^61^1^0^1"^1^446)，靶位点正向重复(TSD)序列为TA。BmMITE-2的具体序列组成，见 SEQ ID NO:1。
[0022]实施例2:
[0023]家蚕BmMITE-2转座子对下游基因表达增强作用的鉴定:将BmMITE-2转座子构建到家蚕转基因载体Pi ggyBac (A3-EGFP-SV40)上，然后分别用有BmMITE-2插入和无BmMITE-2插入的PiggyBac载体对家蚕进行转基因注射，分别获得阳性的转基因家蚕并荧光显微镜拍照，结果发现有BmMITE-2插入的转基因家蚕的荧光信号要明显强于没有BmMITE-2插入的对照组(见附图1A)。进一步用荧光定量PCR的方法检测不同转基因家蚕5龄3天幼虫GFP基因mRNA水平的表达量后，发现具有BmMITE-2插入的转基因家蚕GFP基因的表达量要显著地高于对照组(见附图1B)。
[0024] 为了进一步证明BmMITE-2插入到基因的5’端会增强其下游基因的表达，我们进行了双荧光素酶报告基因转染实验。我们首先将家蚕的A3启动子序列构建到萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3Basic Vector)的报告基因的5’端，然后再将BmMITE-2的序列构建到A3启动子的前面。然后将这个构建好的载体和内参载体(海肾荧光素酶报告基因)共转染家蚕卵巢细胞(BmN)，转染48小时后测酶活。结果发现当荧光素酶报告基因的5’端插入了 BmMITE-2时，显著的增加了报告基因的表达量(P〈0.01)(见附图2)。
【权利要求】
1.具有增强子作用的BmMITE-2转座子，其特征在于该转座子是家蚕来源的，序列组成如 SEQ ID NO:1 所示。
2.根据权利要求1的增强子，其中所说的增强子来源于家蚕BmMITE-2转座子。
3.根据权利要求1或2，其中所说的家蚕是家蚕大造品系。
4. 根据权利要求1中的增强子BmMITE-2转座子在构建家蚕重组表达载体并提高外源或内源基因表达产物的产率中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103952404SQ201410192824
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】张泽, 韩民锦, 唐洲 申请人:重庆大学