感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞冻存复苏技术领域，特别涉及一种感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法。
【背景技术】
[0002]家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是家蚕微粒子病的病原体，属于专性细胞内寄生的单细胞真核生物。利用昆虫和哺乳动物细胞培养建立微孢子虫体外感染增殖体系，对研宄微孢子虫与宿主细胞的互作机制以及微孢子虫基因组学等都具有重要意义。自从Trager等1973年首次利用昆虫细胞对家蚕微孢子虫的增殖情况进行研宄以后，Kawarabata、贡成良、郑祥明以及钱永华等相继利用桉大蚕蛾(Antheraea eucalypti)细胞系、家蚕胚胎细胞系(BmN)在体外成功建立了家蚕微孢子虫感染增殖体系。2005年，李艳红等利用来源于家蚕丝腺单病斑的家蚕微孢子感染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)，成功建立了 Sf21细胞系对家蚕微孢子虫的体外增殖培养体系。如何保存和复苏感染家蚕微孢子虫的稳定细胞系，是建立长期稳定的家蚕微孢子虫体外增殖培养体系需要解决的关键问题。
【发明内容】
[0003]本发明的首要目的在于克服现有持续传代培养保存感染细胞系技术中存在的缺点与不足，提供一种感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法。
[0004]本发明的再一目的在于提供所述的感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法的应用。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法，包括如下步骤:
[0006](I)将感染且分裂正常的细胞收集于离心管中进行差速离心，于1000r/min离心3min收集感染细胞，然后于4000r/min离心5min收集孢子，除去离心管内残余的培养基后，加入ImL冻存液重悬感染细胞和孢子；
[0007](2)将步骤(I)中重悬的感染细胞和孢子同时转移至冻存管中，密封并标识后于4°C放置Ih，然后转至-20°C放置3h，最后转至_80°C放置过夜后保存于液氮中；
[0008](3)将步骤(2)中冻存的感染细胞和孢子解冻后加入培养瓶中，贴壁培养0.75-lh后，收集培养液，更换培养基，将收集的培养液进行差速离心，1000r/min离心5min收集上清液，将收集的上清液经4000r/min离心5min，取沉淀，加入100 μ L培养基重悬后添加回培养瓶，培养48h后再次更换培养基，培养48h，得到复苏的微孢子虫及感染微孢子虫的细胞；
[0009]所述的细胞为家蚕胚胎细胞；
[0010]所述的孢子为家蚕微孢子虫孢子；
[0011]所述的微孢子虫为家蚕微孢子虫。
[0012]步骤(I)中:
[0013]所述的培养基为Grace细胞培养液；
[0014]所述的Grace细胞培养液为含10% FBS的Grace完全培养液，其青霉素和链霉素的浓度均为200 μ g/mL ；
[0015]所述的离心管优选为1.5mL离心管。
[0016]步骤(3)中:
[0017]所述的培养基为Grace细胞培养液；
[0018]所述的Grace细胞培养液为含10% FBS的Grace完全培养液，其青霉素和链霉素的浓度均为200 μ g/mL ；
[0019]所述的培养液为混有感染细胞和孢子的Grace细胞培养液；
[0020]所述的解冻后加入采用如下方法进行:将感染细胞和孢子解冻后直接加入培养瓶中或者将感染细胞和孢子解冻并进行差速离心后将感染细胞和孢子加入培养瓶中；
[0021]所述的差速离心优选采用如下步骤进行:1000r/min离心3min收集感染细胞，然后于4000r/min离心5min收集孢子。
[0022]所述的培养瓶为装有正常细胞和培养基的培养瓶。
[0023]步骤(3)中“培养液”与“培养基”有所不同。所述的培养液为混有感染细胞和孢子的Grace细胞培养液(含10% FBS的Grace完全培养液、未贴壁的感染细胞和游离的孢子，其青霉素、链霉素的浓度均为200 μ g/mL);所述的培养基为新鲜的Grace细胞培养液(含10% FBS的Grace完全培养液，其青霉素、链霉素的浓度均为200 μ g/mL)。
[0024]所述的感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法可应用于家蚕胚胎细胞冻存复苏。
[0025]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明通过将家蚕感染细胞和孢子密封后于4°C放置lh，然后转至-20°C放置3h，并转至-80°C放置过夜后保存于液氮中；最后将感染细胞和孢子解冻后直接加入培养瓶中或者将感染细胞和孢子解冻并进行差速离心后将感染细胞和孢子加入培养瓶中进行复苏培养，得到复苏的微孢子虫和感染微孢子虫的细胞，建立稳定的家蚕微孢子虫体外增殖培养体系，改变现在技术中通过反复建立增殖培养体系和持续传代培养保存感染细胞系的弊端，获得大量且稳定的感染细胞，同时减轻科研人员工作量，减少科研经费的浪费。
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0027]实施例1
[0028]一种感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法，包括如下步骤:
[0029](I)将感染且分裂正常的细胞收集于1.5mL离心管中进行差速离心，于1000r/min离心3min收集感染细胞，然后于4000r/min离心5min收集孢子，除去离心管内残余的培养基后，加入ImL冻存液重悬感染细胞和孢子；
[0030](2)将步骤(I)中吹散的感染细胞和孢子同时转移至冻存管中，密封并标识后于4°C放置Ih，然后转至-20°C放置3h，最后转至_80°C放置过夜后保存于液氮中；
[0031](3)将步骤⑵中冻存的感染细胞和孢子解冻后直接加入装有正常细胞和培养基的培养瓶中，贴壁培养0.75-lh后，收集培养液，更换新鲜培养基，将收集的培养液进行差速离心，1000r/min离心5min收集上清液，将收集的上清液经4000r/min离心5min，取沉淀，加入100 μ L培养基重悬后添加回培养瓶中，培养48h后再次更换培养基，培养48h，得到复苏的微孢子虫及感染微孢子虫的细胞，其孢子复苏存活率为80 %，感染微孢子虫的细胞复苏存活率为10?20%。
[0032]所述的细胞为家蚕胚胎细胞；
[0033]所述的孢子为家蚕微孢子虫孢子；
[0034]所述的微孢子虫为家蚕微孢子虫。
[0035]步骤(I)中:所述的培养基为Grace细胞培养液(含10% FBS的Grace完全培养液，其青霉素、链霉素的浓度均为200 μ g/mL)；
[0036]步骤(3)中:所述的培养基为Grace细胞培养液(含10% FBS的Grace完全培养液，其青霉素、链霉素的浓度均为200 μ g/mL);所述的培养液为混有感染细胞和孢子的Gra