胎盘全细胞冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法

专利名称：胎盘全细胞冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及对胎盘全细胞进行处理的方法，具体涉及对胎盘全细胞冻存、复苏处理，以及由复苏后的胎盘全细胞分离和扩增干细胞的方法，特别涉及对胎盘全细胞进行冻存、复苏，然后再从中分离和扩增间充质干细胞的方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。 MSC在骨髓中蕴含丰富，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。近期的研究显示，胎盘组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令胎盘间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。但是，胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，而且每一份胎盘组织的处理和分离后的细胞培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将胎盘组织冻存并且在有需要的时候复苏进行干细胞分离的做法相对更符合成本效益。因此，本领域需要一个简单和高效的胎盘组织冻存、复苏和间充质干细胞的分离和扩增的方法，以满足医药、科研、临床等领域的需求。

发明内容
本发明的目的是解决现有技术冻存、复苏胎盘全细胞方法的缺陷，提供一种简单有效的胎盘全细胞冻存的方法，以及相配套使用的冻存胎盘全细胞复苏的方法，以及复苏后间充质干细胞扩增的方法。本发明发现对胎盘全细胞使用特定操作步骤的冻存、复苏以及分离和扩增，可简单、有效地从胎盘组织例如胎盘全细胞分离原代间充质干细胞，并且可以对原代间充质干细胞在冻存过程中有效地进行保护。本发明基于此发现而得以完成。因此，本发明第一方面提供了处理胎盘全细胞的方法，该方法包括以下对胎盘离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤
(I)胎盘组织清洗通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；(2)胎盘组织消化处理从步骤(I)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，加入缓冲液(例如PBS缓冲液)并将小叶剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化处理5-40分钟(例如10-30分钟，例如约20分钟)；(3)胎盘组织过滤处理加入FBS溶液(Gibco)终止消化，将消化处理后的胎盘组织碎片转移至过滤装置，对胎盘组织碎片进行研磨，同时收集滤液，对滤液进行细胞清洗；(4)配制胎盘全细胞冻存液所述胎盘全细胞冻存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亚砜)和DMEM-F12，配好的冻存液放在1°C至7 V (例如约4°C )的温度条件下低温冷藏；(5)胎盘全细胞冻存将步骤⑶得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在0-15°C (例如1°C至TC，例如约4°C )的低温环境下，加入步骤⑷得到的全细胞冻存液，·然后转移至冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1°C至TC (例如4°C)的温度条件下低温冷藏O. 2-2小时(例如约O. 5小时)，再在-10°C至_150°C (例如约_80°C )的温度条件下冷冻O. 25-3天(例如约I天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用。根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对冻存的胎盘离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤(6)冻存胎盘全细胞复苏将步骤(5)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，离心处理清洗DMS0，去除上清液，进行红细胞裂解步骤，离心处理后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后进行细胞清洗步骤，去除上清液。根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对复苏的胎盘全细胞进行间充质干细胞分离和扩增的步骤(7)细胞培养向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，接种至培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第4-7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第8-10天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第二次半换液，继续培养，在第11-13天(例如第12天)时将培养容器从培养箱中取出，加入5-20ml (例如10-18ml，例如15ml)间充质干细胞培养基，往后每1-4天(例如2-3天)进行一次全换液；(8)细胞传代当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%_90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部,离心,抽走上清液,加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%(例如80%)后，即得胎盘间充质干细胞，必要时进行传代；以及任选的下列一个或多个步骤(9)对针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(10)将步骤⑶所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。根据本发明第一方面的方法，该方法包括
(A)以下对胎盘离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤(I)胎盘组织清洗通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；(2)胎盘组织消化处理从步骤⑴得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，加入缓冲液(例如PBS缓冲液)并将小叶剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化处理5-40分钟(例如10-30分钟，例如20分钟)；(3)胎盘组织过滤处理加入FBS溶液终止消化，将消化处理后的胎盘组织碎片转移至过滤装置，对胎盘组织碎片进行研磨，同时收集滤液，对滤液进行细胞清洗；(4)配制胎盘全细胞冻存液所述胎盘全细胞冻存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亚砜)和DMEM-F12，配好的冻存液放在1°C至7°C (例如4°C )的温度条件下低温冷藏；
(5)胎盘全细胞冻存将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在
0-15°C (例如1°C至TC，例如4°C )的低温环境下，加入步骤(4)得到的全细胞冻存液，然后转移至冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1°C至TC (例如4°C)的温度条件下低温冷藏O. 2-2小时(例如O. 5小时)，再在-10°C至_150°C (例如_80°C )的温度条件下冷冻O. 25-3天(例如I天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用；(B)以下对冻存的胎盘离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤(6)冻存胎盘全细胞复苏将步骤(5)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，离心处理清洗DMS0，去除上清液，进行红细胞裂解步骤，离心处理后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后进行细胞清洗步骤，去除上清液；(C)以下对复苏的胎盘全细胞进行间充质干细胞分离和扩增的步骤(7)细胞培养向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，接种至培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第4-7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第8-10天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第二次半换液，继续培养，在第11-13天(例如第12天)时将培养容器从培养箱中取出，加入5-20ml (例如10-18ml，例如15ml)间充质干细胞培养基，往后每1-4天(例如2-3天)进行一次全换液；(8)细胞传代当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%_90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部,离心,抽走上清液,加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%(例如80%)后，即得胎盘间充质干细胞，必要时进行传代；以及任选的(D)下列一个或多个步骤(9)对针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(10)将步骤⑶所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。根据本发明第一方面的方法，其中所述胎盘是胎盘的新鲜离体组织。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑴所述胎盘组织是在生物安全柜内进行处理。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)所述缓冲液的使用量是根据胎盘大小调整。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)所述缓冲液冲洗胎盘组织的冲洗次数为1-5次，优选2-3次。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)所述剪下胎盘小叶的工具为手术剪，根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)所述胎盘小叶剪下后被转移至培养平皿，所述培养平皿直径为5-20cm的培养平皿，优选培养皿直径为IOcm的培养平皿。 根据本发明第一方面的方法，其中所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其PH为5. 0-8. O，优选pH为5. 5-76，优选pH为6. 0-7. O。在一个实施方案中，所述PBS缓冲液中磷酸根的浓度为O. 01-0. 5M，优选O. 02-0. 1M。在本发明下文试验中，所用PBS缓冲液是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为O. 025M，pH为6. 5。需要说明的是，本发明人发现，在上述范围内的PBS缓冲液浓度和pH值对于本发明方法的效果影响不大。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)所述PBS缓冲液的加入量为10_40ml，优选25ml。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)所述消化酶溶液的加入量为10_40ml，优选25ml。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)所述PBS缓冲液的加入量与消化酶溶液的加入量比例为3:1-1:3，优选为1:1。根据本发明第一方面的方法，其中所述消化酶溶液是胰酶溶液，优选O. 1-0. 5%的胰酶溶液，优选O. 25%的胰酶溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为5-40分钟，优选10-30分钟，优选20分钟。本发明人发现在10-30分钟的消化处理时间内，对组织块的消化处理效果是最佳的，既可保证组织块得到充分的消化处理，也能避免细胞被破坏，然而在消化处理时间低于IOmin例如为5min时,或者消化处理时间超过35min例如为40min时,如实施例2所述经3代传代后，细胞纯度低于75%。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，消化处理是在人体体温附近的温度范围内进行的，优选34-40 V，优选36-38 V，优选37 °C。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，消化处理是在恒温摇床里进行的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，FBS溶液加入量为3-10ml，优选4_8ml,优选 5ml。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，FBS溶液优选为FBS(Gibco)溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，过滤装置为金属过滤器，优选为100目-500目的金属过滤器，优选为200目金属过滤器。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，收集过滤完的液体是利用另一个
培养皿。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，对胎盘组织碎片进行研磨之后，力口入缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗组织并继续研磨，缓冲液分开2-3次加入，优选分开2次加入，缓冲液加入量为5-16ml,优选加入量为10ml。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，细胞清洗的具体步骤是用离心容器(50ml离心管)收集滤液，离心处理，去除上清液，加入缓冲液(例如PBS缓冲液)重悬细胞，再次离心处理，去除上清液，加入缓冲液(例如PBS缓冲液)重悬细胞，抽取小量样本进行细胞计数，最后再离心处理并去除上清液，待后续步骤冻存处理。所述离心转速为800-2000rpm,优选1400rpm,离心时间为优选10分钟。根据本发明第一方面的方法，其中所述胎盘组织冻存液中包含人血白蛋白、DMSO和DMEM-F12。在一个实施方案中，所述胎盘组织冻存液中含有5-30重量份的人血白蛋白。在一个实施方案中，所述胎盘组织冻存液中含有10-20重量份的人血白蛋白。在一个实施方案中，所述胎盘组织冻存液中含有15重量份的人血白蛋白。在一个实施方案中，所述胎盘组织冻存液中含有5-20重量份的DMSO。在一个实施方案中，所述胎盘组织冻存液中含有7-15重量份的DMS0。在一个实施方案中，所述胎盘组织冻存液中含有10重量份的DMS0。在一个实施方案中，所述胎盘组织冻存液中含有40-80重量份的DMEM-F12。在一个实施方 案中，所述胎盘组织冻存液中含有50-70重量份的DMEM-Fl2。在一个实施方案中，所述胎盘组织冻存液中含有65重量份的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述胎盘组织冻存液中含有约15重量份的人血白蛋白、约10重量份的DMSOJS 65重量份的DMEM-F12。上述实施方案中，胎盘组织冻存液中各组分含量的总和为100%。本发明人发现，含有约15重量份的人血白蛋白、约10重量份的DMSOJS 65重量份的DMEM-F12的胎盘组织冻存液(即其中人血白蛋白、DMS0、DMEM-F12的重量比是15:10:65)是特别优选的，比之于使该胎盘组织冻存液的任一成分含量变化10%以上的配方在保护胎盘组织不受冷冻过程破坏等效果方面具有显著优势，例如采用上述特别优选的15:10:65的比率，在下文实施例2中，经3代传代后，细胞纯度大于90% ;但当使用该胎盘组织冻存液的任一成分含量变化10%以上的配方时，在下文实施例2中，经3代传代后，细胞纯度低于80%。在本发明中，由于冻存液中还可能含有本领域技术人员通用的其它配液溶剂或溶质，因此上述以“重量份”表示的人血白蛋白和DMSO的量是一种相对量，其可以是毫克、克、千克等。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述低温环境为0-15°C，优选1°C至7°C，优选4°C。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)所述冻存容器为冻存管。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)所述每一冻存容器(冻存管)中加入的重悬细胞冻存液的体积为O. 5-3ml，优选1ml。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述的细胞在冻存容器中的密度以确保任一细胞均有足够的DMSO提供保护为上限，所述密度是指单位空间内的细胞个体数，优选I X 107-4X IO8每毫升，优选4 X IO7-I X IO8每毫升。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)所述的程序降温装置是程序降温盒。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)所述的低温冷藏和低温冷冻是将程序降温装置(例如程序降温盒)放入冰箱实现的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)所述的样本冷藏流程为在1°C至7V的温度条件下低温冷藏O. 2-2小时。在一个实施方案中，所述低温冷藏是在21至61的温度条件下。在一个实施方案中，所述低温冷藏是在3°C至5°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述低温冷藏是在4°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述低温冷藏时间为O. 3-1. 5小时。在一个实施方案中,所述低温冷藏时间为O. 4-1小时。在一个实施方案中，所述低温冷藏时间为O. 5小时。本发明人发现，在4°C的温度条件下低温冷藏O. 5小时是特别优选的，能够确保DMSO和胎盘全细胞充分融合。上述其他冷藏温度条件和冷藏时间也能使DMSO和胎盘全细胞融合，其融合效果可以满足本发明的基本需求，但4°C的温度条件下低温冷藏O. 5小时的融合效果最充分，具有明显优势。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)所述的样本冷冻流程为在-10°C至-150°C的温度条件下冷冻O. 25-3天。在一个实施方案中，所述冷冻是在_30°C至_120°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述冷冻是在_50°C至_100°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述冷冻是在_80°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述冷冻时间为O. 4-2天。在一个实施方案中，所述冷冻时间为O. 8-1. 5天。在一个实施方案中，所述冷冻时间为I天。本发明人发现，在_80°C的温度条件下冷冻I天是特别优选的，比之于使该冷冻流程的任一温度、时间变化10%以上的冷冻流程在保护胎盘组织不受冷冻过程破坏等效果方面具有显著优势。 根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)所述解冻是在恒温水浴中进行。根据本发明第一方面的方法，其中所述间充质干细胞培养基中包含FBS、L-Glutamine>Gentamicin和DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有10-20%的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约15%的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有O. 5-2%的L-Glutamine。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约1%的L-Glutamine (L-谷氨酰胺)。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有O. 02-0. 1%的Gentamicin (庆大霉素)。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约O. 05%的Gentamicin。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有80-90%的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约84%的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约15重量份的FBSJ^] I重量份的L-Glutamine、约O. 05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12。本发明人发现，含有约15重量份的FBSj^ I重量份的L-Glutamine、约O. 05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12的间充质干细胞培养基是特别优选的，比之于使该培养基的任一成分含量变化10%以上的配方在增加胎盘组织贴壁、减短贴壁细胞从组织爬出的时间等效果方面具有显著优势。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)所述间充质干细胞培养基是通过点滴法清洗细胞。点滴法可有效地将组织内的DMSO清洗出来，从而避免在复苏过程中细胞存活率的流失。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)所述解冻获得的细胞悬液与间充质干细胞培养基的体积比为1:2-1:5，优选体积比为1:3。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)所述离心处理是在离心容器(离心管)中进行。在一个实施方案中，离心转速为800-2000rpm，优选1400rpm。在一个实施方案中，尚心时间为5-20分钟，优选10分钟。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)所述红细胞裂解步骤是加入PBS重悬细胞，向细胞悬液中再加入红细胞裂解液，常温条件下培养。在一个实施方案中，红细胞裂解液为Roche红细胞裂解液。在一个实施方案中，细胞悬液与裂解液的比例为1:1至1:5，优选比例为1:2至1:3。在一个实施方案中，常温条件为在0-30°C，优选15-25°C。在一个实施方案中，培养时间为5-20分钟，优选10-15分钟。本发明人发现，利用Roche红细胞裂解液对样本里面的红细胞进行裂解，细胞悬液与裂解液的比例为1:2到1:3，在15-25°〇培养10-15分钟具有最佳的裂解效果，实验结果证明其有效的清除大部分的红细胞，避免了在细胞培养时出现红细胞污染。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)所述如有需要重复红细胞裂解步骤的判断标准是，红细胞是否大部分被清楚，即如果红细胞大部分未被清除，重复红细胞裂解的步骤，如果红细胞已经被大部分清除，则不再重复红细胞裂解步骤，直接进入之后的步骤。红细胞大部分被清除是指红细胞被清除50%以上，优选红细胞被清除70%以上，优选红细胞被清除90%以上。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)所述细胞清洗的步骤是加入PBS重悬细胞并抽取小量样本进行细胞计数，放进离心机进行离心以清洗细胞。在一个实施方案中，离心转速为800-2000rpm，优选1400rpm。在一个实施方案中，离心时间为5_20分钟，优选10分钟。·根据本发明第一方面的方法，其中步骤(7)所述接种至培养容器的步骤是以
1-10X IoVcm2的密度将细胞悬液接种到培养容器，优选密度为2-5X104/cm2。在一个实施方案中，细胞悬液接种量为5-20ml，优选15ml。在一个实施方案中，其中步骤(7)所述接种至培养容器的步骤是以2-5X IOVcm2的密度将15ml的细胞悬液接种到培养容器中。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(7)所述培养容器为T25细胞培养瓶。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(7)所述培养箱中CO2浓度为3-7%，优选浓度为5%，培养箱温度控制在人体体温附近范围内，优选34-40°C，优选36-38°C，优选37°C。根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB 病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-l/2Ab、CMV-IgM和 EBV-IgA、TRUST。根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR 表型。根据本发明第一方面的方法，在步骤(10)中，所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。根据本发明第一方面的方法，在步骤(10)中，所述胎盘间充质干细胞存在于细胞冻存液中。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含DMEM-F12、二甲基亚砜和人血白蛋白。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含50%低糖DMEM培养液、40%FBS、10% 二甲基亚讽。根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤(I)胎盘组织清洗胎盘组织是在生物安全柜内进行处理，根据胎盘大小使用适量PBS缓冲液对胎盘组织进行冲洗2-3遍，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；(2)胎盘组织消化处理使用手术剪从步骤(I)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，把小叶转移到培养皿上，加入25ml PBS缓冲液并把胎盘小叶尽量剪碎，加入25ml O. 25%胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS缓冲液体积比例为1:1)并混匀组织，把培养皿放进37°C的恒温摇床里消化20分钟；(3)胎盘组织过滤处理往培养皿里加入5ml FBS (Gibco)并混匀以达到终止消化的目的，把消化过后的胎盘组织碎片转移到200目金属过滤器上，对胎盘组织碎片进行研磨并利用另一培养皿收集过滤完的液体，分开两次往金属过滤器加入IOml的PBS缓冲液清 洗组织并继续研磨，将收集的滤液转移至50ml离心管，以速度1400rpm离心10分钟，去除上清液并加入PBS缓冲液重悬细胞，以速度1400rpm离心10分钟，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，抽取小量样本进行细胞计数，以速度1400rpm离心10分钟以达到清洗细胞的效果；(4)配制胎盘全细胞冻存液所述胎盘全细胞冻存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO ( 二甲基亚砜)和65重量份的DMEM-F12，配好的冻存液放在4°C冰箱保存直至使用；(5)胎盘全细胞冻存将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在4°C的低温环境下，加入步骤(4)得到的全细胞冻存液，然后以每一管每毫升4X107到IX IO8的细胞密度加入冻存管里，此过程需在4°C的低温条件下进行，将冻存管放入程序降温盒里，先在4°C的温度条件下低温冷藏O. 5小时，再-80°C的温度条件下冷冻I天，然后将冻存管于液氮中冷冻，备用。进一步地，可以包括与冻存方法配套使用的复苏方法(6)冻存胎盘全细胞复苏将步骤(4)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，放在恒温水浴里解冻至一半冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基(其例如包含15% FBS+1%L-Glutamine+0. 05% Gentamicin+84%DMEM-F12)进行点滴法清洗胎盘全细胞，解冻获得的细胞悬液与间充质干细胞培养基的体积比为l:3(lml:3ml)，将混合有间充质干细胞培养基的细胞悬液转移到离心管，以速度1400rpm离心10分钟清洗DMS0，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，并以I份细胞悬液比2-3份红细胞裂解液的比例加入红细胞裂解液(Roche),在15-25°C的环境下培养10-15分钟，放进离心机以速度1400rpm离心10分钟进行离心，离心后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后加入PBS缓冲液重悬细胞并抽取小量样本进行细胞计数，放进离心机以速度1400rpm离心10分钟进行离心以清洗细胞，去除上清液。进一步地，可以包括复苏后间充质干细胞分离和扩增的方法(7)细胞培养向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，转移到T25培养瓶，再将T25培养瓶放进CO2浓度为5%的37°C培养箱中进行培养，培养至第6天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第9天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第二次半换液，在第12天把平皿里面的培养基抽走，加入15ml间充质干细胞培养基继续培养，往后每2天进行一次全换液；(8)细胞传代当T25培养瓶里面的贴壁细胞融合率达到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)将贴壁细胞脱离T25培养瓶底部，离心后移除上清液，并加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，接种于T25细胞培养瓶进行传代，并进行扩增培养；此后每两天换液一次直至融合率达到80%后，即得，必要时再进行传代。进一步地，可以针对以上步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。进一步地，可以将以上步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存，备用。进一步地，可以将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相 关数据，建立胎盘干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。因此本发明在一个方面中，提供了建立胎盘干细胞数据库的方法，其包括本发明第一方面分离和扩增胎盘间充质干细胞的步骤，以及如下步骤将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相关数据，建立胎盘干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。此外，在本发明的第一方面，提供了对胎盘全细胞冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法。因此本发明第二方面提供了一种胎盘间充质干细胞。根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其是根据本发明第一方面任一实施方案所述方法获得的。根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其细胞纯度大于90%，例如大于95%。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于90%，例如大于 95%。下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过弓I用并入本文。 在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。在本发明中，术语“胎盘间充质干细胞”是指来源于胎盘的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“胎盘间充质干细胞”可以与“胎盘干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围。在本发明中，术语“胎盘”是指新生儿胎盘，特别是指产后4小时之内的胎盘。间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan Al. Mesenchymal stem cells. JOrthop Res. 1991, 9:641-650. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC,et al. Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每IO5 IO6个单个核细胞中大约只有I个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由
最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。现有的分离干细胞从而建立干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN 101270349A(中国专利申请号200810061267. 6，
公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN 101693884A (中国专利申请号200910117522. 9，
公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、胎盘或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN 102146359A(中国专利申请号201110005964. 1，
公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们建立脐血库将脐血造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样胎盘间充质干细胞作为一种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立胎盘干细胞库，为日后的干细胞治疗保存种子。根据本发明的方法，胎盘组织冻存液的配方和样本冷冻的流程能成功并有效的对胎盘全细胞在冷冻的过程中进行保护。根据本发明的方法，利用点滴法将培养基加入复苏的冻存胎盘全细胞，不但可以将全细胞中的DMSO清洗出来，还可以避免使用离心的步骤，从而避免在离心过程中细胞的流失，进而达到有效提高复苏细胞的存活率的效果。根据本发明的方法，其中间充质干细胞培养基配方能成功并有效的对胎盘间充质干细胞进行体外扩增。根据本发明的方法，其中换液时间的设定缩短了贴壁细胞达到指定融合率的时间。本发明操作简单，方便实用，能有效保护冻存的胎盘全细胞，避免复苏过程中细胞存活率流失，能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。与现有方法的比较目前MSC主要采用手术法抽取供者骨髓或灌流法分离胎盘，贴壁培养获得。该法分得细胞数量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本发明成功自胎盘中分离获得大量纯度较高的间充质干细胞，并运用此法建立胎盘干细胞库来储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于胎盘与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。
具体实施例方式通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够 理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。实施例I、胎盘全细胞冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法胎盘组织冻存方法包括以下步骤(I)胎盘组织清洗胎盘组织是在生物安全柜内进行处理，根据胎盘大小使用适量PBS缓冲液对胎盘组织进行冲洗2-3遍，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；(2)胎盘组织消化处理使用手术剪从步骤(I)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，把小叶转移到培养皿上，加入25ml PBS缓冲液并把胎盘小叶尽量剪碎，加入25ml O. 25%胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS缓冲液体积比例为1:1)并混匀组织，把培养皿放进37°C的恒温摇床里消化20分钟；(3)胎盘组织过滤处理往培养皿里加入5ml FBS(Gibco)并混匀以达到终止消化的目的，把消化过后的胎盘组织碎片转移到200目金属过滤器上，对胎盘组织碎片进行研磨并利用另一培养皿收集过滤完的液体，分开两次往金属过滤器加入IOml的PBS缓冲液清洗组织并继续研磨，将收集的滤液转移至50ml离心管，以速度1400rpm离心10分钟，去除上清液并加入PBS缓冲液重悬细胞，以速度1400rpm离心10分钟，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，抽取小量样本进行细胞计数，以速度1400rpm离心10分钟以达到清洗细胞的效果；(4)配制胎盘全细胞冻存液所述胎盘全细胞冻存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO ( 二甲基亚砜)和65重量份的DMEM-F12，配好的冻存液放在4°C冰箱保存直至使用；(5)胎盘全细胞冻存将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在4°C的低温环境下，加入步骤(4)得到的全细胞冻存液，然后以每一管每毫升4X107到IX IO8的细胞密度加入冻存管里，此过程需在4°C的低温条件下进行，将冻存管放入程序降温盒里，先在4°C的温度条件下低温冷藏O. 5小时，再-80°C的温度条件下冷冻I天，然后将冻存管于液氮中冷冻，备用。与冻存方法配套使用的复苏方法包括以下步骤(6)冻存胎盘全细胞复苏将步骤(4)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，放在恒温水浴里解冻至一半冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基(其例如包含15% FBS+1%L-Glutamine+O. 05% Gentamicin+84%DMEM-F12)进行点滴法清洗胎盘全细胞，解冻获得的细胞悬液与间充质干细胞培养基的体积比为l:3(lml:3ml)，将混合有间充质干细胞培养基的细胞悬液转移到离心管，以速度1400rpm离心10分钟清洗DMSO，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，并以I份细胞悬液比2-3份红细胞裂解液的比例加入红细胞裂解液(Roche),在15-25°C的环境下培养10-15分钟，放进离心机以速度1400rpm离心10分钟进行离心，离心后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后加入PBS缓冲液重悬细胞并抽取小量样本进行细胞计数，放进离心机以速度1400rpm离心10分钟进行离心以清洗细胞，去除上清液。复苏后间充质干细胞分离和扩增的方法包括以下步骤(7)细胞培养向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，转移到T25培养瓶，再将T25培养瓶放进CO2浓度为5%的37°C培养箱中进行培养，培养至第6天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第9天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第二次半换液，在第12天把平皿里面的培养基抽走，加入 15ml间充质干细胞培养基继续培养，往后每2天进行一次全换液；(8)细胞传代当T25培养瓶里面的贴壁细胞融合率达到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)将贴壁细胞脱离T25培养瓶底部，离心后移除上清液，并加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，接种于T25细胞培养瓶进行传代，并进行扩增培养；此后每两天换液一次直至融合率达到80%后，即得，必要时再进行传代。在以上步骤的测试中，复苏后的胎盘全细胞在培养的第8天开始有贴壁细胞出现，培养至第20天细胞融合率达到80%，经3代传代后，细胞纯度大于80%。在以上步骤的测试中，胎盘组织冻存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO ( 二甲基亚砜)和65重量份的DMEM-F12，该冻存液的三种组分中，任意一种比率在偏离上述配比20%以上时，冻存液不能在冷冻的过程对胎盘组织有效保护，具体表现为冻存胎盘组织复苏后分离的间充质干细胞计数明显下降。在以上步骤的测试中，样本冷冻的流程为在4°C的温度条件下低温冷藏O. 5小时，再_80°C的温度条件下冷冻I天，该冷冻流程的任意温度在偏离上述温度60%以上时，以及时间在偏离80%以上时，冷冻过程中胎盘组织没有得到有效保护，具体表现为冻存胎盘组织复苏后分离的间充质干细胞计数明显下降。在以上步骤的测试中，间充质干细胞培养基中包含15重量份FBS、1重量份L-Glutamine,O. 05重量份Gentamicin和84重量份DMEM-F12。该培养基的四种组份中，其中的任意三种比例固定时，另一种的比率在偏离上述配比10%以上时，传代至T25培养瓶后，在第17天融合率均未达到75%。例如当使用的间充质干细胞培养基中包含I重量份L-Glutamine,O. 05 重量份 Gentamicin 和 84 重量份 DMEM-F12，以及 12 重量份 FBS、13. 5 重量份FBS、16. 5重量份FBS、或18重量份FBS时，四种情况下，传代至T25培养瓶后，在第17天融合率均在53-74%之间。在以上步骤的测试中，换液时间为细胞培养的第6天进行第一次半换液，第9天进行第二次半换液，在第12天把平皿里面的培养基抽走，加入15ml间充质干细胞培养基继续培养，往后每2天进行一次全换液，其中的任意换液时间在偏离上述时间10%以上时，贴壁细胞未在20天内达到融合率80%。例如换液时间为细胞培养的第10天第一次半换液，或往后为每4天一次全换液，两种情况下，贴壁细胞在第22-25天达到80%。在以上步骤的测试中，消化液为O. 25%的胰酶溶液，消化时间为20分钟。在培养液中胰酶含量偏离上述含量20%以上时，或在消化时间偏离上述时间20%以上时，组织里的全细胞不能高效分离，分离是否高效根据抽取小量样本的细胞计数判断。在以上步骤的测试中，细胞悬液与裂解液的比例为1:2到1:3，在15-25°C培养10-15分钟以达到最佳的裂解效果。实验结果证明以上的方法能有效的清除大部分的红细胞，避免在细胞培养时出现红细胞污染，其中细胞悬液与裂解液的比例在偏离上述比例50%以上时，或培养温度偏离上述温度20%以上时，或培养时间偏离上述时间20%以上时，红细胞裂解率不足50%。贴壁细胞未在20天内达到融合率80%。例如换液时间为细胞培养的第10天第一次半换液，或往后为每4天一次全换液，两种情况下，贴壁细胞在第22-25天达到80%。实施例2、胎盘全细胞冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法 参考实施例I的方法进行。复苏后的胎盘全细胞在培养的第7天开始有贴壁细胞出现，培养至第19天细胞融合率达到80%。经3代传代后，细胞纯度大于90%。实施例3、胎盘全细胞冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法参考实施例I的方法进行。复苏后的胎盘全细胞在培养的第8天开始有贴壁细胞出现，培养至第21天细胞融合率达到80%。经3代传代后，细胞纯度大于85%。实施例4、胎盘全细胞冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法参考实施例I的方法进行。复苏后的胎盘全细胞在培养的第8天开始有贴壁细胞出现，培养至第21天细胞融合率达到80%。实施例5、胎盘全细胞冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法参考实施例I的方法进行。复苏后的胎盘全细胞在培养的第7天开始有贴壁细胞出现，培养至第20天细胞融合率达到80%。实施例6、胎盘MSC的传代培养及其冻存将实施例1-5任一项获得的细胞进行消化，消化后取I X IO6细胞加入到Iml细胞冻存液(含65份DMEM-F12+10份二甲基亚砜+15份人血白蛋白)中，经过程序降温最后进入到液氮罐中冻存。实施例7、胎盘MSC的牛物学特件鉴定I、细胞牛长及其形杰学特点通过实施例I和实施例6的分离培养，胎盘单个核细胞培养72小时后在显微镜下可明显见到梭形贴壁细胞，10天左右会形成涡轮状细胞克隆，消化传代后会形成80%左右融合的贴壁层。培养过程中，发现这种细胞形态相对均一，增殖速度快，贴壁速度快，易被胰酶消化，传代至5-15代，其形态及生长特点亦无明显改变。2、流式细胞术鉴定MSC表面标志分别取第3、6、9、12、15代细胞，流式细胞术检测细胞表面标志，动态观察培养过程中细胞表面标志的变化。消化收集细胞，计数后取8X IO6个细胞，分装16管；PBS洗一次，1500rpm离心IOmin ;弃上清，残留100 200 μ 1，吹打混匀细胞；加入PE标记的⑶14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD54、CD73、CD80、CD86、CD166 抗体以及 FITC 标记的 CD45、CD105、HLA-ABC, HLA-DR、UEA-I抗体各10 μ 1，并设一管为空白对照；在4°C下，避光反应30 min ；PBS洗一次，1500rpm离心IOmin ;直接标记的细胞弃上清，加入200 μ I PBS吹打混匀细胞，200 μ I的1%多聚甲醛固定，置4°C待测，3天内上流式细胞仪检测。流式细胞仪检测细胞的表面标志，动态观察第3、6、9、12、15代的细胞，无明显改变。不表达造血细胞表面标志即⑶14、⑶31、⑶34 (HSPC及内皮细胞阳性)、⑶45 (白细胞阳性)、CD54 (ICAM-I)、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、HLA-DR(MHC-II 类分子)持续阴性，CD29 和⑶44 (纤维蛋白和透明脂酸盐的受体，基质细胞表达)、⑶73 (即SH-3、4)、⑶105 (即SH-2)、CD166 (间充质细胞表达)、HLA-ABC (MHC-I类分子)和UEA-I (内皮细胞的表面标志)持续为阳性。经3代以上传代后，细胞成分均一，纯度在95%以上。3、流式细胞术检测胎盘MSC的细胞周期细胞长至80%左右融合时，消化收集细胞约I X IO6个，PBS洗一次，加入70%的乙 醇固定，4°C待测。检测时，先离心去乙醇，再用PBS洗一次，加入RNase I 500u，37°C反应30min，PBS洗一次，加入碘化丙啶(PI，终浓度50 μ g/ml) 1ml，室温避光反应20min，上机检
测细胞DNA含量。经测定第3代和第6代细胞的DNA含量，细胞周期分析，G0ZG1期、S期和G2M期所占比例分别为96. 35%,96. 66%，I. 11%,O. 09%，和2. 54%,3. 25%。结果表明体外培养的细胞具有典型的干细胞增殖特点，即只有少数细胞处于活跃的增殖期(I. 11%、0. 09%)，大部分的细胞处于静息期(96. 35%、96. 66%)。4、胎盘MSC生长曲线的绘制及对数生长期倍增时间的测定取对数生长期细胞，消化计数，以10% FBS的LG-DMEM培养基制成细胞悬液(2X 104/ml)，24孔板中每孔接种O. 5ml, 37°C，5%C02,饱和湿度下培养。每天取3复孔，台盼蓝染色后计数活细胞数，计算平均值，连续观察7天。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。以Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间，即Td=Tlg2/Lg(Nt/No)，Td :倍增时间(h)，T :细胞由No增至Nt所用的时间(h)，N :细胞数。通过每天细胞计数的结果绘制细胞生长曲线，计算倍增时间。由细胞生长曲线可以看出，细胞在第2-4天处于指数生长期。根据公式计算出第5代细胞在指数生长期的倍增时间在18-30小时范围内。5、胎盘MSC多向分化潜能的鉴定(I)成骨诱导3代以上MSC，按I X IO5/孔接种六孔板，放于37°C、5%C02、饱和湿度下，MSC培养基中培养24h后，换用含10%经筛选FBS的DMEM-HG并加入地塞米松O. I μ Μ、抗坏血酸磷酸盐50μΜ、β-磷酸甘油10mM，放于37°C、5%C02、在饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2-4周。碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成，Von Kossa染色鉴定骨结节形成。在含10%经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松O. I μ Μ、抗坏血酸磷酸盐50 μ Μ、β -磷酸甘油IOmM培养I周，细胞形态发生明显的改变，由纺锤形的成纤维细胞样变为多角形，类似于神经元细胞样，细胞周边出现长丝状突出，并可向周围延伸。继续培养2周以上后，细胞基质中出现钙化斑，矿化物逐渐出现，并且开始形成多层小结结构，至培养4周后，可见明显钙化结节。2周时碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，达到95%以上，而未加以诱导的对照组则大部分为阴性，只有不到5%显示为弱阳性，表明细胞已向成骨细胞转化。vonKossa染色可将骨结节中沉积的钙染成黑色，诱导组可见大量的黑色骨结节，有明显的立体结构，而对照组在任何时间都没有阳性反应。(2)成脂肪诱导3代以上MSC，按I X IO5/孔接种于六孔板，放于37°C、5%C02、饱和湿度下，在MSC培养基中培养24h后，换用含10%经筛选FBS的高糖DMEM，并加入地塞米松I μ Μ、消炎痛60 μ M、IBMX O. 5mM、胰岛素5 μ g/ml，放于37°C，5%C02，饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2周，油红染色鉴定脂滴形成。在含10%经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松I μ Μ、消炎痛200 μ M、IBMX O. 5mM、胰岛素10 μ g/ml培养3天，细胞即发生形态改变，由纺锤形的成纤维细胞样逐渐收缩变短，90%以上细胞成为立方形或多角形；连续培养7天，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着培养时间的延长，脂滴逐渐增大并融合，至培养2周时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞。油红O染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色。 _2] (3)成软骨诱导3代以上细胞，按照每管2X IO5细胞分装到15ml聚丙烯离心管，低速离心使细胞在试管中形成微团，在含2. 5%FBS的DMEM-HG中加入胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠各6. 25 μ g/ml, BSA I. 25 μ g/ml,丙丽酸纳 ImM/L,抗坏血酸憐酸 37. 5 μ g/ml, TGF-β : 50ng/ml，放于37°C、5%C02、饱和湿度下培养，每3天半量换液，连续培养2周。诱导2周后将细胞微团打散涂片，阿辛蓝(Alcian blue)染色可见II型胶原形成细胞外基质呈蓝色，对照组无蓝染。通过以上一系列数据指标的检测，显示出应用本发明方法分离得到的MSC，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力，证实本发明方法获得的MSC具有干细胞特性。实施例8、胎盘干细胞库的津立I、细胞活件的检测利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。2、细胞污染的检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。利用病原学方法，检测细胞是否受到乙肝两对半、丙肝、艾滋、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg, HbsAb, HBcAb,HbeAg, HbeAb, HCVAb, HIV_l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST 感染。3、遗传病的检测利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。4、HLA-ABC/DR 配型检测细胞HLA-ABC/DR表型，并记录在案。5、细胞来源的调杳记录胎儿及其父母的详细资料，并记录在案。6、胎盘干细胞数据库的津立在保存正常的胎盘干细胞后，建立胎盘干细胞的数据库，其中包括前五项资料，并建立与冻存细胞的关联。
权利要求
1.处理胎盘全细胞的方法，该方法包括 (A)以下对胎盘离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤 (1)胎盘组织清洗通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块； (2)胎盘组织消化处理从步骤⑴得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，加入缓冲液(例如PBS缓冲液)并将小叶剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化处理5-40分钟(例如20分钟)； (3)胎盘组织过滤处理加入FBS(Gibco)溶液终止消化，将消化处理后的胎盘组织碎片转移至过滤装置，对胎盘组织碎片进行研磨，同时收集滤液，对滤液进行细胞清洗； (4)配制胎盘全细胞冻存液所述胎盘全细胞冻存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亚砜)和DMEM-F12，配好的冻存液放在1°C至7 V (例如4°C )的温度条件下低温冷藏； (5)胎盘全细胞冻存将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在0-15°C (例如1°C至TC，例如4°C )的低温环境下，加入步骤(4)得到的全细胞冻存液，然后转移至冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1°C至TC (例如4°C)的温度条件下低温冷藏0. 2-2小时(例如0. 5小时)，再在-10°C至_150°C (例如_80°C )的温度条件下冷冻0. 25-3天(例如I天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用； 任选地，进一步进行(B)以下对冻存的胎盘离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤 (6)冻存胎盘全细胞复苏将步骤(5)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，离心处理清洗DMS0，去除上清液，进行红细胞裂解步骤，离心处理后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后进行细胞清洗步骤，去除上清液； 任选地，进一步进行(C)以下对复苏的胎盘全细胞进行间充质干细胞分离和扩增的步骤 (7)细胞培养向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，接种至培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第4-7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第8-10天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第二次半换液，继续培养，在第11-13天(例如第12天)时将培养容器从培养箱中取出，加入5-20ml (例如10_18ml，例如15ml)间充质干细胞培养基，往后每1-4天(例如2-3天)进行一次全换液； (8)细胞传代当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%-90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部,离心,抽走上清液,加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%(例如80%)后，即得胎盘间充质干细胞，必要时进行传代； 以及任选的下列一个或多个步骤 (9)对针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型； (10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。
2.根据权利要求I的方法，其中所述胎盘组织冻存液中包含约15重量份的人血白蛋白、约10重量份的DMSOJS 65重量份的DMEM-F12。
3.根据权利要求I的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为10-30分钟。
4.根据权利要求I的方法，其中步骤(5)中，利用间充质干细胞培养基清洗胎盘全细胞米用的是点滴法。
5.根据权利要求I的方法，其中所述间充质干细胞培养基中包含FBS、L-Glutamine,Gentamicin 和 DMEM-F12。
6.根据权利要求I的方法，其中 所述间充质干细胞培养基中含有10-20%的FBS ； 所述间充质干细胞培养基中含有0. 5-2%的L-Glutamine ； 所述间充质干细胞培养基中含有0. 02-0. 1%的Gentamicin ;和/或 所述间充质干细胞培养基中含有80-90%的DMEM-F12。
7.根据权利要求I的方法，其中步骤(6)所述红细胞裂解步骤是加入PBS重悬细胞，向细胞悬液中再加入红细胞裂解液，细胞悬液与裂解液的比例为1:1至1:5，优选比例为1:2至1:3，常温条件为0-30°C，优选15-25°C，培养时间为5_20分钟，优选10-15分钟。
8.根据权利要求I的方法，该方法包括以下步骤 (1)胎盘组织清洗胎盘组织是在生物安全柜内进行处理，根据胎盘大小使用适量PBS缓冲液对胎盘组织进行冲洗2-3遍，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液减块； (2)胎盘组织消化处理使用手术剪从步骤(I)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，把小叶转移到培养皿上，加入25ml PBS缓冲液并把胎盘小叶尽量剪碎，加入25ml 0. 25%胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS缓冲液体积比例为1:1)并混匀组织，把培养皿放进37°C的恒温摇床里消化20分钟； (3)胎盘组织过滤处理往培养皿里加入5mlFBS(Gibco)并混匀以达到终止消化的目的，把消化过后的胎盘组织碎片转移到200目金属过滤器上，对胎盘组织碎片进行研磨并利用另一培养皿收集过滤完的液体，分开两次往金属过滤器加入IOml的PBS缓冲液清洗组织并继续研磨，将收集的滤液转移至50ml离心管，以速度1400rpm离心10分钟，去除上清液并加入PBS缓冲液重悬细胞，以速度1400rpm离心10分钟，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，抽取小量样本进行细胞计数，以速度1400rpm离心10分钟以达到清洗细胞的效果; (4)配制胎盘全细胞冻存液所述胎盘全细胞冻存液中包含15重量份的人血白蛋白、.10重量份的DMSO ( 二甲基亚砜)和65重量份的DMEM-F12，配好的冻存液放在4°C冰箱保存直至使用； (5)胎盘全细胞冻存将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在4°C的低温环境下，加入步骤(4)得到的全细胞冻存液，然后以每一管每毫升4X IO7到IXlO8的细胞密度加入冻存管里，此过程需在4°C的低温条件下进行，将冻存管放入程序降温盒里，先在4°C的温度条件下低温冷藏0. 5小时，再_80°C的温度条件下冷冻I天，然后将冻存管于液氮中冷冻，备用； 所述冻存方法中还可以选择与冷冻配套使用的复苏步骤 (6)冻存胎盘全细胞复苏将步骤(4)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，放在恒温水浴里解冻至一半冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基(其例如包含15% FBS+1%L-Glutamine+O. 05% Gentamicin+84%DMEM-F12)进行点滴法清洗胎盘全细胞，解冻获得的细胞悬液与间充质干细胞培养基的体积比为1:3 (1ml :3ml)，将混合有间充质干细胞培养基的细胞悬液转移到离心管，以速度1400rpm离心10分钟清洗DMSO，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，并以I份细胞悬液比2-3份红细胞裂解液的比例加入红细胞裂解液(Roche),在15-25°C的环境下培养10-15分钟，放进离心机以速度1400rpm离心10分钟进行离心，离心后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后加入PBS缓冲液重悬细胞并抽取小量样本进行细胞计数，放进离心机以速度1400rpm离心10分钟进行离心以清洗细胞，去除上清液； 所述冻存方法中还可以选择复苏后间充质干细胞分离和扩增的步骤 (7)细胞培养向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，转移到T25培养瓶，再将T25培养瓶放进CO2浓度为5%的37°C培养箱中进行培养，培养至第6天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第9天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第二次半换液，在第12天把平皿里面的培养基抽走，加入15ml间充质干细胞培养基继续培养，往后每2天进行一次全换液； (8)细胞传代当T25培养瓶里面的贴壁细胞融合率达到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)将贴壁细胞脱离T25培养瓶底部，离心后移除上清液，并加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，接种于T25细胞培养瓶进行传代，并进行扩增培养；此后每两天换液一次直至融合率达到80%后，即得，必要时再进行传代； 以及任选的下列一个或多个步骤 (9)针对以上步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
(10)将以上步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存，备用。
9.建立胎盘干细胞数据库的方法，其包括权利要求1-8任一项所述方法的步骤，以及如下步骤将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相关数据，建立胎盘干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。
10.一种胎盘间充质干细胞，其是根据权利要求1-8任一项所述方法获得的。
全文摘要
本发明涉及胎盘全细胞分离、冻存和复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，其包括如下步骤对胎盘组织进行消毒和清洗；从组织剪下胎盘小叶，消化处理20分钟；配制胎盘组织冻存液备用；将消化处理得到的全细胞和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后液氮中冷冻备用；需要时将胎盘全细胞从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用间充质干细胞培养基进行点滴法清洗，利用红细胞裂解液清除红细胞，复苏的胎盘全细胞可通过细胞培养和细胞传代扩增间充质干细胞。本发明方法可有效保护冻存胎盘组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。
文档编号C12N5/0735GK102807966SQ201210292509
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者林卓衡, 朱业峰, 陈俊峯, 周丹 申请人:博雅干细胞科技有限公司