专利名称：基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种基于Taqman-ARMS技术检基因突变位分型的方法。
背景技术：
目前普遍应用的基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法，但是该方法存在以下缺点RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序为突变检测的金标准。该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精 确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。因此，急需开发一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的基因突变检测技术，满足基因突变分型的时效性要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，解决了现有技术中进行基因突变分型程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题。为实现上述发明目的，技术方案为
基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，包括以下步骤
(1)根据目的基因的突变位点设计ARMS引物，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3位核苷酸中的任一位错义突变；
(2)根据所述突变位点设计Taqman-MGB探针,所述Taqman-MGB探针特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针,所述探针的3’端结合有小沟结合分子；
(3)提取模版DNA，利用步骤(I)所得引物对和步骤(2)所得探针对模板DNA进行荧光定量PCR检测。优选的，将所述突变位点上游第I位核苷酸中的错义突变。优选的，所述步骤(I)中，所述突变位点为EGFR基因2573位错义突变，所述ARMS引物为SEQ ID No 3和SEQ ID No 5所示的核苷酸序列。优选的,所述步骤(2)中，所述Taqman-MGB探针为SEQ ID No :9所示的核苷酸序列。本发明目的之二在于提供上述检测方法使用的试剂盒，其使用方便，灵敏度高，技术方案为
所述试剂盒包括检测目的基因的突变位点的ARMS引物和Taqman-MGB探针，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3位核苷酸中的任一位错义突变；
所述Taqman-MGB探针为特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子。优选的，所述ARMS弓丨物为SEQ ID No 3和SEQ ID No 5所示的核苷酸序列。优选的，所述Taqman-MGB探针为SEQ ID No 9所示的核苷酸序列。优选的，所述试剂盒由PCR缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl2、
TaqDNA聚合酶和模板DNA组成，各组分反应时终浓度为
权利要求
1.基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)根据目的基因的突变位点设计ARMS引物，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3位核苷酸中的任一位错义突变； (2)根据所述突变位点设计Taqman-MGB探针,所述Taqman-MGB探针特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针,所述探针的3’端结合有小沟结合分子； (3)提取模版DNA，利用步骤(I)所得引物对和步骤(2)所得探针对模板DNA进行荧光定量PCR检测。
2.根据权利要求I所述基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，其特征在于将所述突变位点上游第I位核苷酸中的错义突变。
3.根据权利要求2所述基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，其特征在于所述步骤(I)中，所述突变位点为EGFR基因2573位错义突变，所述ARMS引物为SEQ ID No:3和SEQ ID No 5所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述Taqman-MGB探针为SEQ ID No 9所示的核苷酸序列。
5.权利要求1-4任一项所述方法使用的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括检测目的基因的突变位点的ARMS引物和Taqman-MGB探针，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3位核苷酸中的任一位错义突变； 所述Taqman-MGB探针为特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子。
6.根据权利权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述ARMS引物为SEQID No:3和SEQ ID No :5所示的核苷酸序列。
7.根据权利权利要求6所述的试剂盒,其特征在于所述Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 9所示。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由PCR缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA组成，各组分反应时终浓度为 PCR缓冲液终浓度0. 5 2. 5 X ; dNTPs0. I 0. 75mM ； 弓I物对上、下游引物终浓度分别为150 350nM ； 模板 DNA0. 01 10ng/ii L ; TaqDNA 聚合酶0. 01 I. OU/ ii L ; MgCl2终浓度为I. 5 3. 5mM ; Taqman-MGB探针终浓度为50 200nM。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述PCR缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA终浓度组成为 PCR缓冲液终浓度I X ； dNTPs0.25mM ； 引物对上、下游引物终浓度分别为250nM ； 模板 DNA0. 05 I. 5ng/ u L ； TaqDNA 聚合酶0. 01 I. OU/ ii L ;MgCl2终浓度为2. O 2. 5mM ;Taqman-MGB探针终浓度为50nM。·
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，公开了基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法；该方法结合了ARMS突变富集和Taqman-MGB特异性荧光检测两种技术，利用ARMS引物对突变靶序列进行特异性PCR扩增，Taqman-MGB探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-timePCR基础上鉴定特定突变，此种方法与直接测序、芯片检测等突变检测技术比较，本发明用于检测基因突变具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速、通量高等优势。
文档编号C12Q1/68GK102776291SQ201210291849
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者王弢, 秦勇 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司