一种用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于FTO基因分型的ARMS?qPCR检测试剂盒，本发明还涉及一种基于本试剂盒的FTO基因分型ARMS?qPCR检测方法。本试剂盒包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为1X；dNTP为0.1～1.5mM；MgCl2为0.5～5mM；Tag酶为0.05～0.1U/μl；PCR下游引物为0.1～1μM；TaqMan探针为0.1～1μM；参照引物为0.5μM；ARMS引物为0.5μM；阳性对照样品为1～10ng/μl。与直接测序等基因分型的技术相比，本发明用于FTO基因分型有特异性强、灵敏度高，操作简单快速、高通量、判读结果可靠，简便等优势。
【专利说明】
-种用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方 法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于FT0基因分型的ARMS-qPCR检测 试剂盒，本发明还涉及一种FT0基因分型ARMS-qPCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 肥胖症是一种慢性病，据世界卫生组织估计，是人类目前面临最容易被忽视，但发 病率却在急剧上升的一种疾病。肥胖症能导致多种生理和心理疾病，比如糖尿病、癌症、心 血管疾病以及社交障碍等。造成肥胖症的原因很多，比如过量的能量摄入和静止型的生活 方式等。越来越多的研究表明，遗传因素在肥胖症发病过程中扮演着重要的角色（Frayling et al. 2007, Gerken et al. 2007, Dina et al. 2007, Chu et al. 2008)〇
[0003] FTO基因位于人第16号染色体，编码3' mT的去甲基化酶（Jia et al. 2011)。有 研究表明，FT0的不同基因型与肥胖症的发病率紧密相关（Frayling et al.2007，）。FT0 rs9939609AT和AA基因型的人比rs9939609TT基因型的人具有显著地肥胖症发病风险 (Speakman et al.2008)。更有趣的是，FT0基因不同基因型与肥胖症之间显著地相关性具 有性别差异，男性rs9939609 AT和AA基因型肥胖症发病风险显著地高于rs9939609 TT基 因型的人，而在女性中却没有差异。因此rs9939609不同的基因型是一个极好的男性肥胖 症风险预测指标，对于肥胖症的预防以及其后的治疗具有重要的指导意义。
[0004] 可用于FTO rs9939609分型的技术很多，包括如DNA直接测序法、杂交芯片法、焦 磷酸测序法以及变性高效液相色谱法等。其中，DNA测序法为基因分型的金标准，该方法 存在如下缺点：检测的灵敏度不高，只有大于15%的突变才能检测到；费时，操作复杂，对 操作人员要求高；非闭管操作，涉及PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想； 通量太小，一次最多只能做24个，很难大规模开展。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对技术现状提供一种灵敏度高、特异性强的用于 FT0基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒。
[0006] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种FT0基因分型的ARMS-qPCR检测方 法，该检测方法灵敏度高、特异性强，而且操作简单。
[0007] 本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种用于FT0基因分型的 ARMS-qPCR检测试剂盒，包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参 照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl 2、 Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；
[0008] 所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为IX ;dNTP为0. 1~ 1.5禮；1%(：12为0.5~51111汀&8酶为0.05~0.11]/^1屮0?下游引物为0.1~14]\1汀39]\&111 探针为0. 1~1 μ Μ ;参照引物为0. 5 μ M ;ARMS引物为0. 5 μ Μ ;阳性对照样品为1~10ng/ μ 1〇
[0009] 其中，所述PCR下游引物的序列如FT0-R所示；
[0010] 所述TaqMan探针的序列如FT〇-TaqMan所示；
[0011] 所述参照引物的序列如FT0-C所示，能够扩增所有不同FT0基因型；
[0012] 所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应FTO AArS9939609、 TTrs9939609型基因型，这两种上游引物的序列如FT0-F1、FT0-F2所示；这两种ARMS引物 分别在3'末端与不同的基因型碱基匹配，同时在其3'末端倒数第2、3位增加一个或者两 个碱基错配，以增加其特异性；用于特异性扩增的FTO rs9939609位基因型为AA/TT/AT ;
[0013] 所述阳极对照样品分别为FT0不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。
[0014] 各引物序列列举如下：
[0015] FT0-R : 5 ' -ATCTTATGTCCAAACAGTAG-3 '
[0016] FTO-TaqMan :5, -FAM-TAGGTAACAGTCAGAAATGG-3，
[0017] FT0-C : 5 ' -AGTTATGCATTTAGAATGTC-3 '
[0018] FT0-F1 :5, -TTGCGACTGCTGTGAATGCT-3'
[0019] FT0-F2 :5' -TTGCGACTGCTGTGAATGCA-3'
[0020] 其中，所述 Tag 酶为 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。
[0021] 本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：基于上述试剂盒的FTO基 因分型ARMS-qPCR检测方法，该方法先是针对FT0基因设计一对参照引物、TaqMan探针，针 对rs9939609位点的不同基因型设计ARMS引物，反应体系中加入qPCR混合反应液，参照引 物或者ARMS引物、TaqMan引物和待测模板DNA进行荧光定量PCR的检测，具体包括如下步 骤：
[0022] (1)设计并筛选含有FT0基因 rs9939609位不同基因型通用的参照引物、TaqMan 探针及两种ARMS引物；
[0023] (2)从细胞体系或血液中提取到基因组DNA作为模板DNA ;
[0024] (3)进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本的检测分3管进行，每个管加入相同的 qPCR混合反应液，TaqMan探针和模板DNA，每管分别加入参照引物和两种ARMS引物中的一 种，进行FT0基因 rs9939609位基因分型的qPCR检测；
[0025] (4)结果判读：
[0026] 参照引物管扩增曲线阳性，FT0-F1管扩增曲线阳性，FT0-F2管扩增曲线阴性或者 其与参照引物管的扩增曲线Δ CT > 10,该样本结果判定为rs9939609AA基因型；
[0027] 参照引物管扩增曲线阳性，FT0-F1管扩增曲线阳性，FT0-F2管扩增曲线阳性，该 样本结果判定为rs9939609A/T基因型；
[0028] 参照引物管扩增曲线阳性，FT0-F1管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增曲 线Λ CT > 10, FT0-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为rs9939609TT基因型；
[0029] 参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新进行提取。
[0030] 所述步骤（2)中，模板DNA选自人体血液基因组DNA或者口腔黏膜脱落细胞或头 发。
[0031] 所述步骤（3)中，进行PCR扩增反应的条件为，95°C预变性2min，95°C变性15s， 60°C延伸lmin，46个循环。
[0032] 上述技术方案中所提及的qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测 系统，简称qPCR。
[0033] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0034] 本发明提供了一种FTO rs9939609基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，以解决现 有基因分型检测技术中费时、程序繁琐以及易污染等问题。本试剂盒可以快速、准确、便宜、 高通量给FTO rs9939609基因进行分型，其灵敏度高，特异性强，适用于常见样本比如血液、 口腔黏膜以及头发等。
[0035] 本发明能够快速、低廉、准确，高通量地检测人体血液或者其他组织细胞中FT0基 因不同的类型，对于分型技术而言，是目前性价比最好的方法。便于临床或者健康检测大 规模的推行。
[0036] 本发明所用的 ARMS (amplification refractory mutation system)即扩增阻碍突 变系统，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5'端引物，一个与正常DNA互 补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3'端引物进行两个平行 PCR，只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的 3'端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。
[0037] ARMS检测的灵敏度依赖于ARMS引物的特异性以及反应条件如反应液中MgC12的 浓度，加不加 DMS0等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶向DNA有错配时的错 配延伸，可通过在引物3'端的第2、3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板 之间形成多重错配以阻止错误延伸。
[0038] 本发明所用的探针为5'端FAM标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告 基团（R)和荧光淬灭基团（Q)。在探针完整时，即在随机状态和无 PCR产物杂交状态时，报 告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，检测不到荧光的存在。在ARMS-qPCR扩增过程中，当特 异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时，Goldstar Best Tag酶的5'端外切酶活性 也把TaqMan探针的碱基逐个剪切，报告基团所释放出的荧光就可以被内置到PCR仪中的荧 光计检测到。PCR经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数扩增的过程， 荧光信号的强弱就代表模板DNA拷贝数的多少。因此本发明是个很好的基因分型的工具。
[0039] 综合了 ARMS引物以及实时荧光定量PCR的优点，与直接测序等基因分型的技术相 比较，本发明用于FT0基因分型基因检测具有如下优势：
[0040] 1、特异性强：设计的ARMS引物分别针对FTO AA rs9939609, TT rs9939609的特 异变异序列，能特异地扩增相应的基因型DNA ;在ARMS引物3 '端的倒数第2、3个碱基引入 另外一个或者两个错配碱基，增加 ARMS引物的特异性；
[0041] 2、本发明技术的灵敏度可达1%，远高于DNA直接测序15%的灵敏度；
[0042] 3、检测过程为闭管反应，大大降低了污染及结果偏差的可能性；
[0043] 4、操作快速简单，从样本送检到得到结果可在3个小时内完成。而直接测序法检 测步骤繁琐：送检标本一提取DNA - PCR扩增一验证PCR产物（电泳）一纯化PCR产物一 直接测序一结果分析，其经过两个PCR产物的电泳过程，污染几率很大，不适合在医院大规 模开展；
[0044] 5、判读结果明确客观，若需要时可对结果进行定量分析；
[0045] 6、高通量，一次可以检测96个样本；
[0046] 7、安全，整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作人员和 环境都无害。
[0047] 总之，与直接测序等基因分型的技术相比，本发明用于FT0基因分型有特异性强、 灵敏度高，操作简单快速、高通量、判读结果可靠，简便等优势。
【附图说明】
[0048] 图1为用FTO ARMS-qPCR基因分型试剂盒检测一抑郁症患者FTO rs9939609位置 基因型的扩增曲线，经检测，此样品在rs9939609位置的基因型为FTO AA rs9939609 ;
[0049] 图2为用FTO ARMS-qPCR基因分型试剂盒检测正常人FTO rs9939609位置基因型 的扩增曲线，经检测，此样品在rs9939609位置的基因型为FTO TT rs9939609;
[0050] 图3为用FTO ARMS-qPCR基因分型试剂盒检测正常人FTO rs9939609位置基因型 的扩增曲线，经检测，此样品在rs9939609位置的基因型为FTO A/Trs9939609。
【具体实施方式】
[0051] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0052] 收集100例抑郁症患者和50例正常人的血样，用ARMS-qPCR的方法对其FT0基因 rs9939609位置进行分型。
[0053] 设计并筛选能特异检测上述3种基因型的ARMS引物各一条及参照引物一条，设计 通用下游引物一条，设计并筛选TaqMan通用探针一条，各引物、探针的序列如下：
[0054] FT0-R :5' -ATCTTATGTCCAAACAGTAG-3'
[0055] FTO-TaqMan :5, -FAM-TAGGTAACAGTCAGAAATGG-3，
[0056] FT0-C :5' -AGTTATGCATTTAGAATGTC-3'
[0057] FT0-F1 :5' -TTGCGACTGCTGTGAATGCT-3'
[0058] FT0-F2 :5, -TTGCGACTGCTGTGAATGCA-3'
[0059] 反应体系的优化：
[0060] (1)引物浓度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，将引物浓度从 0. 1 μ M/L~1. 5 μ M/L作倍比连续稀释，通过实验结果的分析确定最佳浓度为0. 5 μ M/L。
[0061] (2)探针浓度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，将引物浓度从 0. 05 μ M/L~0. 5 μ M/L作倍比连续稀释，通过实验结果的分析确定最佳浓度为0. 1 μ M/L。
[0062] (3)退火温度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，进行梯度 PCR(55°C~65°C )，通过实验结果的分析确定最佳温度为60°C。
[0063] (4)扩增反应Tag酶的优化，通过比较市场上的各种PCR扩增Tag酶，选取 Goldstar Best Tag 酶。
[0064] (5)优化后最终的反应体系为25ul，包括qPCR混合反应液23 μ 1，参照引物和 ARMS 引物各 0· 5 μ 1 (终浓度 0· 5 μ M/L)，模板 DNA 1 μ 1 (终浓度 l-10ng/ μ 1)，qPCR mix (即 qPCR混合反应液）组分及其终浓度为：
[0065]
[0066] ARMS-qPCR在ABI 7900检测仪上检测每个样本进行3管反应，每管加入相同的 qPCR mix，通用下游引物，TaqMan探针，各管所不同的是参照引物或者ARMS引物。PCR反应 条件为：95°C预变性10min，95°C 15s，60°C lmin，扩增反应为46循环。
[0067] 结果为：100例男性肥胖症患者中有69人为FT0基因 AA rs9939609基因型，21人 为AT rs9939609，10人为TT rs9939609基因型；50人正常人中有38人为TT rs9939609 型，9人为A/Trs9939609基因型，3人为AA rs9939609基因型，经DNA直接测序验证，完全 与ARMS-qPCR结果一致。
[0068] 上述结果表明，本发明的FT0基因 ARMS-qPCR分型方法方法可靠，灵敏度高，操作 简单，判读结果客观，利于大规模临床开展。
[0069] 以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的 思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明 的限制。
【主权项】
1. 一种用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，其特征在于：包括qPCR反应体系， 所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR 混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针； 所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为IX ; dNTP为0. 1~ 1.5禮；1%(：12为0.5~51111汀&8酶为0.05~0.11]/^1屮0?下游引物为0.1~14]\1汀39]\&111 探针为0. 1~1 μ M ;参照引物为0. 5 μ M ;ARMS引物为0. 5 μ M ;阳性对照样品为1~IOng/ μ 1〇 所述PCR下游引物的序列如FTO-R所示； 所述TaqMan探针的序列如FTO-TaqMan所示； 所述参照引物的序列如FTO-C所示，能够扩增所有不同FTO基因型； 所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应FTOAArS9939609、 TTrs9939609型基因型，这两种上游引物的序列如FT0-F1、FT0-F2所示；这两种ARMS引物 分别在3'末端与不同的基因型碱基匹配，同时在其3'末端倒数第2、3位增加一个或者两 个碱基错配，用于特异性扩增的FTO rs9939609位基因型为AA/TT/AT ; 所述阳极对照样品分别为FTO不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。2. 根据权利要求1所述的用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，其特征在于： 所述 Tag 酶为 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。3. 基于权利要求1或2所述试剂盒的FTO基因分型ARMS-qPCR检测方法，其特征在于， 包括如下步骤： (1) 设计并筛选含有FTO基因 rs9939609位不同基因型通用的参照引物、TaqMan探针 及两种ARMS引物； (2) 从细胞体系或血液中提取到基因组DNA作为模板DNA ; (3) 进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本的检测分3管进行，每个管加入相同的qPCR 混合反应液，TaqMan探针和模板DNA，每管分别加入参照引物和两种ARMS引物中的一种，进 行FTO基因 rs9939609位基因分型的qPCR检测； (4) 结果判读： 参照引物管扩增曲线阳性，FTO-Fl管扩增曲线阳性，FT0-F2管扩增曲线阴性或者其与 参照引物管的扩增曲线ACT > 10,该样本结果判定为rs9939609AA基因型； 参照引物管扩增曲线阳性，FTO-Fl管扩增曲线阳性，FT0-F2管扩增曲线阳性，该样本 结果判定为rs9939609A/T基因型； 参照引物管扩增曲线阳性，FTO-Fl管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增曲线 Λ CT > 10, FT0-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为rs9939609TT基因型； 参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新进行提取。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（2)中，模板DNA选自人体 血液基因组DNA或者口腔黏膜脱落细胞或头发。5. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（3)中，进行PCR扩增反应 的条件为，95°C预变性2min，95°C变性15s，60°C延伸lmin，46个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK105886600SQ201410587533
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月20日
【发明人】张道允, 张恒, 巩子英, 罗坚诚, 贾宁
【申请人】江苏所罗门兄弟医学科技有限公司