一种用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于ABCB1基因分型的ARMS?qPCR检测试剂盒，本发明还涉及一种基于本试剂盒的ABCB1基因分型ARMS?qPCR检测方法。其中，本试剂盒包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR上下游引物和TaqMan探针；所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为1X；dNTP为0.1～1.5mM；MgCl2为0.5～5mM；Tag酶为0.05～0.1U/μl；PCR下游引物为0.1～1μM；TaqMan探针为0.1～1μM；参照引物为0.5μM；ARMS引物为0.5μM；阳性对照样品为1～10ng/μl。本试剂盒能快速、灵敏、准确的检测ABCB1不同基因型，可以检测不同来源的基因组DNA，如血液、口腔黏膜细胞、头发等。
【专利说明】
-种用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检 测试剂盒，本发明还涉及一种ABCB1基因分型ARMS-qPCR检测方法。
【背景技术】
[0002] ABCB1基因位于人类基因组第7号染色体（7q21)，编码一个长1280个氨基酸的蛋 白。它具有12个跨膜的结构域，在其细胞内有ATP的结合位点。这个基因是一个转运蛋白， 可以运转一些药物到细胞内，起着非常重要的生理功能。ABCB1蛋白在血脑屏障中高表达， 将许多药物以及神经毒素排出以保护大脑。现有研究表明，ABCB1不同的基因型与抑郁症 的潜在发病紧密相关（Fuji et al. 2012)。
[0003] 抑郁症又称忧郁症，是以情绪低落为主要特征的一类心理疾病，其临床表现轻型 病人外表如常，内心有痛苦体验。稍重的人可表现为情绪低落、愁眉苦脸、唉声叹气、自卑 等，有些患者常常伴有神经官能症症状，如：注意力不集中、记忆力减退、反应迟缓和失眠多 梦等症状。重型抑郁症患者会出现悲观厌世、绝望、自责自罪、幻觉妄想、食欲不振、体重锐 减、功能减退、并伴有严重的自杀企图，甚至有自杀行为，因此对人类健康构成严重威胁。
[0004] 随着现代生活节奏的加快和压力的增大，越来越多的人罹患忧郁症，北京市15岁 以上的人群中，抑郁障碍的终生罹患率为6. 87 %，全国的罹患率在5-10 %之间，其中女性 的罹患率是男性的两倍。据世界卫生组织预计，到2020年，抑郁症将成为继冠心病后的第 二大疾病负担源。
[0005] 科学研究发现ABCB1基因的不同基因型与抑郁症的罹患风险密切相关，T3435纯 合基因型与C3435以及C/T3435杂合基因型的人罹患抑郁症的风险有显著地差异（Fuji et al. 2012)。因此，ABCB1基因3435位置的不同基因型是预测抑郁症潜在风险的极好生物标 志物，检测ABCB1基因3435位置的不同基因型对于提前预防抑郁症，节约医疗资源具有重 要的意义。
[0006] 可用于ABCB1基因分型的技术很多，包括如DNA直接测序法、杂交芯片法、焦磷酸 测序法以及变性高效液相色谱法等。其中，DNA测序法为基因分型的金标准，该方法存在如 下缺点：检测的灵敏度不高，只有大于15%的突变才能检测到；费时，操作复杂，对操作人 员要求高；非闭管操作，涉及PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想；通量太 小，一次最多只能做24个，很难大规模开展。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对技术现状提供一种灵敏度高、特异性强 的用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒。
[0008] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测 方法，该检测方法灵敏度高、特异性强，而且操作简单。
[0009] 本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种用于ABCB1基因分型 的ARMS-qPCR检测试剂盒，包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、 参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、 Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；
[0010] 所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为IX ;dNTP为0. 1~ 1.5禮；1%(：12为0.5~51111汀&8酶为0.05~0.11]/^1屮0?下游引物为0.1~14]\1汀39]\&111 探针为0. 1~1 μ Μ ;参照引物为0. 5 μ M ;ARMS引物为0. 5 μ Μ ;阳性对照样品为1~10ng/ μ 1〇
[0011] 其中，所述PCR下游引物的序列如ABCB1-R所示；
[0012] 所述TaqMan探针的序列如ABCBl-TaqMan所示；
[0013] 所述参照引物的序列如ABCB1-C所示，能够扩增所有不同ABCB1基因型；
[0014] 所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应ABCB1 CC3435、TT3435型 基因型，这两种上游引物的序列如ABCB1-F1、ABCB1-F2所示；这两种ARMS引物分别在3 '末 端与不同的基因型碱基匹配，同时在其3'末端倒数第2、3位增加一个或者两个碱基错配， 以增加其特异性；用于特异性扩增的ABCB1 3435位基因型为TT/CC/TC ;
[0015] 所述阳极对照样品分别为ABCB1不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。
[0016] 各引物序列列举如下：
[0017] ABCB1-R :5, -AAACAGGAAGTGTGGCCAGA-3'
[0018] ABCBl-TaqMan :5, -FAM-CTCTCTTCAAATAAACAGCC-3'
[0019] ABCB1-C :5, -CCTATGGAGACAACAGCCGG-3'
[0020] ABCB1-F1 :5, -GTGGTGTCACAGGAAGAGGCT-3'
[0021] ABCB1-F2 :5, -GTGGTGTCACAGGAAGAGGCC-3'
[0022] 其中，所述 Tag 酶为 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。
[0023] 本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：基于上述试剂盒的ABCB1 基因分型ARMS-qPCR检测方法，该方法先是针对ABCB1基因设计一对参照引物、TaqMan探 针，针对3435位点的不同基因型设计ARMS引物，反应体系中加入qPCR混合反应液，参照引 物或者ARMS引物、TaqMan引物和待测模板DNA进行荧光定量PCR的检测，具体包括如下步 骤：
[0024] (1)设计并筛选含有ABCB1基因3435位不同基因型通用的参照引物、TaqMan探针 及两种ARMS引物；
[0025] (2)从细胞体系或血液中提取到基因组DNA作为模板DNA ;
[0026] (3)进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本的检测分3管进行，每个管加入相同的 qPCR混合反应液，TaqMan探针和模板DNA，每管分别加入参照引物和两种ARMS引物中的一 种，进行ABCB1基因3435位基因分型的qPCR检测；
[0027] (4)结果判读：
[0028] 参照引物管扩增曲线阳性，ABCB1-F1管扩增曲线阳性，ABCB1-F2管扩增曲线阴性 或者其与参照引物管的扩增曲线ACT > 10,该样本结果判定为3435TT基因型；
[0029] 参照引物管扩增曲线阳性，ABCB1-F1管扩增曲线阳性，ABCB1-F2管扩增曲线阳 性，该样本结果判定为3435C/T基因型；
[0030] 参照引物管扩增曲线阳性，ABCB1-F1管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增 曲线ACT > 10, ABCB1-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为3435CC基因型；
[0031] 参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新进行提取。
[0032] 所述步骤（2)中，模板DNA选自人体血液基因组DNA或者口腔黏膜脱落细胞或头 发。
[0033] 所述步骤（3)中，进行PCR扩增反应的条件为，95°C预变性2min，95°C变性15s， 60°C延伸lmin，46个循环。
[0034] 上述技术方案中所提及的qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测 系统，简称qPCR。
[0035] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0036] 本发明提供了一种ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，以解决现有基因分 型检测技术中费时、程序繁琐以及易污染等问题。本试剂盒可以快速、准确、便宜、高通量给 ABCB1基因进行分型，其灵敏度高、特异性强，适用于常见样本比如血液、口腔黏膜以及头发 等。
[0037] 本试剂盒能快速、灵敏、准确的检测ABCB1不同基因型，可以检测不同来源的基因 组DNA，如血液、口腔黏膜细胞、头发等。与直接测序等基因分型的技术相比，本发明用于 ABCB1基因分型有特异性强、灵敏度高，操作简单快速、高通量、判读结果可靠，简便等优势。
[0038] 本发明的试剂盒能够快速、低廉、准确，高通量地检测人体血液或者其他组织细胞 中ABCB1基因不同的类型，对于分型技术而言，是目前性价比最好的方法，便于临床或者健 康检测大规模的推行。
[0039] 本发明所用的 ARMS (amplification refractory mutation system)即扩增阻碍突 变系统，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5'端引物，一个与正常DNA互 补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3'端引物进行两个平行 PCR，只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的 3'端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。
[0040] ARMS检测的灵敏度依赖于ARMS引物的特异性以及反应条件如反应液中MgC12的 浓度，加不加 DMS0等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶向DNA有错配时的错 配延伸，可通过在引物3'端的第2、3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板 之间形成多重错配以阻值错误延伸。
[0041] 本发明所用的探针为5'端FAM标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告 基团（R)和荧光淬灭基团（Q)。在探针完整时，即在随机状态和无 PCR产物杂交状态时，报 告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，检测不到荧光的存在。在ARMS-qPCR扩增过程中，当特 异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时，Goldstar Best Tag酶的5'端外切酶活性 也把TaqMan探针的碱基逐个剪切，报告基团所释放出的荧光就可以被内置到PCR仪中的荧 光计检测到。PCR经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数扩增的过程， 荧光信号的强弱就代表模板DNA拷贝数的多少。因此本发明是个很好的基因分型的工具。
[0042] 综合了 ARMS引物以及实时荧光定量PCR的优点，与直接测序等基因分型的技术相 比较，本发明用于ABCB1基因分型基因检测具有如下优势：
[0043] 1、特异性强：设计的ARMS引物分别针对ABCB1 TT 3435，CC3435的特异变异序列， 能特异地扩增相应的基因型DNA ;在ARMS引物3'端的倒数第2、3个碱基引入另外一个或 者两个错配碱基，增加 ARMS引物的特异性。
[0044] 2、本发明技术的灵敏度可达1%，远高于DNA直接测序15%的灵敏度；
[0045] 3、检测过程为闭管反应，大大降低了污染及结果偏差的可能性；
[0046] 4、操作快速简单，从样本送检到得到结果可在3个小时内完成。而直接测序法检 测步骤繁琐：送检标本一提取DNA - PCR扩增一验证PCR产物（电泳）一纯化PCR产物一 直接测序一结果分析，其经过两个PCR产物的电泳过程，污染几率很大，不适合在医院大规 模开展；
[0047] 5、判读结果明确客观，若需要时可对结果进行定量分析；
[0048] 6、高通量，一次可以检测96个样本；
[0049] 7、安全，整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作人员和 环境都无害。
[0050] 总之，与直接测序等基因分型的技术相比，本发明用于ABCB1基因分型有特异性 强、灵敏度高，操作简单快速、高通量、判读结果可靠，简便等优势。
【附图说明】
[0051] 图1为用ABCB1 ARMS-qPCR基因分型试剂盒检测一抑郁症患者ABCB1 3435位置 基因型的扩增曲线，经检测，此样本在3435位置的基因型为ABCB1 TT3435 ;
[0052] 图2为用ABCB1 ARMS-qPCR基因分型试剂盒检测正常人ABCB1 3435位置基因型 的扩增曲线，经检测，此样本在3435位置的基因型为ABCB1 CC3435 ;
[0053] 图3为用ABCB1 ARMS-qPCR基因分型试剂盒检测正常人ABCB1 3435位置基因型 的扩增曲线，经检测，此样本在3435位置的基因型为ABCB1 C/T3435。
【具体实施方式】
[0054] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0055] 收集100例抑郁症患者和50例正常人的血样，用ARMS-qPCR的方法对其ABCB1基 因3435位置进行分型。
[0056] 设计并筛选能特异检测上述3种基因型的ARMS引物各一条及参照引物一条，设计 通用下游引物一条，设计并筛选TaqMan通用探针一条，各引物、探针的序列如下：
[0057] ABCB1-R :5, -AAACAGGAAGTGTGGCCAGA-3'
[0058] ABCB1-TaqMan :5, -FAM-CTCTCTTCAAATAAACAGCC-3'
[0059] ABCB1-C :5' -CCTATGGAGACAACAGCCGG-3'
[0060] ABCB1-F1 :5, -GTGGTGTCACAGGAAGAGGCT-3'
[0061] ABCB 1-F2 :5，-GTGGTGTCACAGGAAGAGGCC-3 '
[0062] 反应体系的优化：
[0063] (1)引物浓度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，将引物浓度从 0. 1 μ M/L~1. 5 μ M/L作倍比连续稀释，通过实验结果的分析确定最佳浓度为0. 5 μ M/L。
[0064] (2)探针浓度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，将引物浓度从 0. 05 μ M/L~0. 5 μ M/L作倍比连续稀释，通过实验结果的分析确定最佳浓度为0. 1 μ M/L。
[0065] (3)退火温度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，进行梯度 PCR(55°C~65°C )，通过实验结果的分析确定最佳温度为60°C。
[0066] (4)扩增反应Tag酶的优化，通过比较市场上的各种PCR扩增Tag酶，选取 Goldstar Best Tag 酶。
[0067] (5)优化后最终的反应体系为25 μ 1，包括qPCR混合反应液23 μ 1，参照引物和 ARMS 引物各 0· 5 μ 1 (终浓度 0· 5 μ M/L)，模板 DNA 1 μ 1 (终浓度 l-10ng/ μ 1)，qPCR mix 组 分及其终浓度为：
[0068]
[0069] ARMS-qPCR在ABI 7900检测仪上检测每个样本进行3管反应，每管反应加入相同 的qPCR mix (即qPCR混合反应液），通用下游引物，TaqMan探针，各管所不同的是参照引物 或者ARMS引物。qPCR反应条件为：95°C预变性10min，95°C 15s，60°C lmin，扩增反应为46 个循环。
[0070] 结果为：100例抑郁症患者中有79人为ABCB1基因 TT3435基因型，11人为T/ C3435,10人为CC3435基因型；50人正常人中有37人为CC3435型，9人为T/C3435基因型， 4人为TT3435基因型，经DNA直接测序验证，完全与ARMS-qPCR结果一致。
[0071] 上述结果表明，本发明的ABCB1基因 ARMS-qPCR分型方法方法可靠，灵敏度高，操 作简单，判读结果客观，利于大规模临床开展。
[0072] 以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的 思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明 的限制。
【主权项】
1. 一种用于ABCBl基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，其特征在于：包括qPCR反应体 系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述 qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针； 所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为IX ; dNTP为0. 1~ 1.5禮；1%(：12为0.5~51111汀&8酶为0.05~0.11]/^1屮0?下游引物为0.1~14]\1汀39]\&111 探针为0. 1~1 μ M ;参照引物为0. 5 μ M ;ARMS引物为0. 5 μ M ;阳性对照样品为1~IOng/ μ 1 ; 所述PCR下游引物的序列如ABCBl-R所示； 所述TaqMan探针的序列如ABCBl-TaqMan所示； 所述参照引物的序列如ABCBl-C所示，能够扩增所有不同ABCBl基因型； 所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应ABCB1CC3435、ΤΤ3435型基因 型，这两种上游引物的序列如ABCB1-FUABCB1-F2所示；这两种ARMS引物分别在3'末端与 不同的基因型碱基匹配，同时在其3'末端倒数第2、3位增加一个或者两个碱基错配，用于 特异性扩增的ABCB13435位基因型为TT/CC/TC ; 所述阳极对照样品分别为ABCBl不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。2. 根据权利要求1所述的用于ABCBl基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，其特征在于： 所述 Tag 酶为 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。3. 基于权利要求1或2所述试剂盒的ABCBl基因分型ARMS-qPCR检测方法，其特征在 于，包括如下步骤： (1) 设计并筛选含有ABCBl基因3435位不同基因型通用的参照引物、TaqMan探针及两 种ARMS引物； (2) 从细胞体系或血液中提取到基因组DNA作为模板DNA ; (3) 进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本的检测分3管进行，每个管加入相同的qPCR 混合反应液，TaqMan探针和模板DNA，每管分别加入参照引物和两种ARMS引物中的一种，进 行ABCBl基因3435位基因分型的qPCR检测； (4) 结果判读： 参照引物管扩增曲线阳性，ABCBl-Fl管扩增曲线阳性，ABCB1-F2管扩增曲线阴性或者 其与参照引物管的扩增曲线ACT > 10,该样本结果判定为3435TT基因型； 参照引物管扩增曲线阳性，ABCBl-Fl管扩增曲线阳性，ABCB1-F2管扩增曲线阳性，该 样本结果判定为3435C/T基因型； 参照引物管扩增曲线阳性，ABCBl-Fl管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增曲线 ACT > 10, ABCB1-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为3435CC基因型； 参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新进行提取。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（2)中，模板DNA选自人体 血液基因组DNA或者口腔黏膜脱落细胞或头发。5. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（3)中，进行PCR扩增反应 的条件为，95°C预变性2min，95°C变性15s，60°C延伸lmin，46个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK105886599SQ201410587532
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月20日
【发明人】张道允, 巩子英, 张恒, 罗坚诚, 贾宁
【申请人】江苏所罗门兄弟医学科技有限公司