一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，属于生物检测技术领域。该方法完全采用免培养的分子微生物生态学的方法，不需要分离菌株，并可对在原位的状态下的人体肠道中蛋白质降解菌进行标定和追踪。本发明以肠道蛋白质降解菌为标靶，作为人体长期的健康干预的定向指标，为定义和诊断人类肠道微生物功能菌群的稳定性提供数据支持。同时，探测和标定肠道蛋白质降解菌，可发现人个体之间的生理性差异对宿主能量代谢响应的关系。本发明方法和以前的纯培养方法比较，特点是快速，成本较低，操作简便，操作人员不需要特殊的培训，对检测的地点无特殊的要求，实验结果准确，能迅速提供给诊断人员相关的数据。
【专利说明】
一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法。
【背景技术】
[0002]最新的研究表明，人类肠道中寄生着种类众多的大量细菌，肠道是人类的另一个“器官”，肠道中微生物的组成和代谢与人类健康，如肥胖和糖尿病(II型)密切相关。研究复杂的人类肠道微生物群落的组成与功能及它们如何影响宿主的能量代谢、宿主对微生物群落变化的响应机制是一个新兴前沿的研究领域。肠道菌群是人体的一个基本组成部分，对宿主的营养、健康和疾病存在多方面的影响。所有研究表明，肠道微生物的组成、丰度和功能，对宿主包括免疫系统的调控、营养供给及对抗病原菌的侵入具有重要的调节功能。例如人体的肠道菌群的组成和代谢能力，对于短链脂肪酸(SCFAs)对肠上皮细胞提供能量的提取量的营养价值有显著的影响。但是，这种互惠互利的微生物关系由于遗传或环境因素的干扰会导致稳态击穿和疾病。
[0003]作为独立的个体，基于饮食习惯、身体状况和基因等方面的原因，每个人的肠道微生物群落的组成各不相同。最近Nature上发表的一篇热门文章根据人体肠道微生物的群落结构将人群分为了三大类型，每一种类型各以一种占优势地位的肠道微生物类群(属水平)为特征:拟杆菌属(Ba c i e r ο i c/ e s)，普雷沃菌属(Pr和瘤胃球菌属
。这种像血型一样的简洁分类将在个体医疗和疾病诊断方面具有重大意义。虽然这种分型还有很多不确定性，但是越来越多的研究表明，肠道中微生物的组成和代谢与人类健康密切相关，人体肠道微生物通过影响它们寄主的信号通路可能引发癌症、代谢综合征、甲状腺病变等疾病，特别是对炎症、肥胖、糖尿病(II型)起了关键作用。肠道微生物群落降解食物中人体不能消化的有机物(蛋白质、淀粉和脂肪)，以给人体提供附加的能量，从而影响了人体的能量平衡。糖尿病患者和非糖尿病对照人群肠道微生物群落的组成和功能不同，可能是导致糖尿病的病因之一。
[0004]对于为了长期的健康干预而用这些多样的微生物作为标靶而言，定义和诊断人类肠道微生物功能菌群的稳定性是至关重要的。现有大部分用来分析在我们肠道微生物中的功能菌群都是采用基于纯培养的方法，这使得他们能够对这些细菌群落随着时间的推移而呈现的稳定性有所了解。例如Jeremiah J.Faith及其同事研发出了一种测序方法来准确追踪这些菌株。他们用这种被称作LEA-seq的方法对37人的粪便中的微生物群落进行了采样，他们发现那些吃特别饮食而减肥的人的微生物株发生了改变，表明肠道微生物群的改变可作为宿主健康及功能的标志物。然而，目前所有的研究手段和方法都是在纯培养的基础上分离菌株，再进一步对具有特殊功能的菌株采用分子微生物生态学的方法进行研究。
[0005]但是对在原位(insitu)状态下(不需要通过纯培养分离菌株)，肠道蛋白质降解菌群在肠道营养物转化过程中的作用及其机理却了解很少，特别是标定特殊的肠道蛋白质降解菌群的方法还未开发出来。肠道微生物群落的基本功能是参与人体的营养物转化，肠道中以短链脂肪酸产生为中心的碳水化合物代谢是肠道微生物生态系统能量代谢的主要途径，其中蛋白质的代谢在人体营养物转化和能量代谢过程中起着重要作用，肠道微生物中的蛋白质降解菌群是最重要功能菌群之一，这是因为蛋白质降解是蛋白质代谢过程中的限制步骤。最近的自然杂志上发表了耶鲁大学科学家的研究成果表明，一类研究中蛋白质(称为inflammasomes，负责开启免疫系统的炎症反应，并且起到肠道细菌的传感器和调控者的作用)导致的肠道微生物群落失调，可增加肠道疾病如结肠炎，而肠道环境的改变最终会导致肥胖和肝脏疾病。由于缺少系统的有关参与肠道蛋白质代谢的微生物菌群的原位信息，对肠道微生物在人体蛋白质代谢过程中的作用的了解主要通过纯培养研究，但是，人类肠道微生物群落中只有少数(〈20%)被纯培养，而且通过纯培养研究得到的微生物生理生化信息不一定能反映微生物在复杂的生态系统原位的作用和功能，所以人体肠道大部分功能菌群处于未知的状态。
[0006]采用免培养的分子微生物生态学方法和手段(BODIPYBSA染色)来标定和追踪原位状态下人体肠道蛋白质降解菌群，不仅对于定义和诊断人类肠道微生物功能菌群的稳定性具有重要的意义，而且为进一步了解肠道蛋白质降解菌群在人体营养物代谢中的利用及转化中的作用和功能，获取原位肠道蛋白质降解菌群的组成和结构的原位信息，了解蛋白质降解菌群与人体之间在肠道营养物的利用和转化中的生态学关系，为进一步探索肠道蛋白质降解菌群在人体代谢疾病发生中的作用机理奠定基础。
[0007]研究复杂生态系统中微生物菌群的功能一直是微生物生态学者面临的挑战，而其中的难点在于开发和使用能客观反应微生物菌群在生态系统中原位功能的分子微生物生态学方法(Head etal.，1998)。迄今为止我们还未见用原位分子微生物生态学方法研究人体肠道微生物群落(例如:蛋白质降解菌群在营养物的利用和转化中的作用的报道，本发明将提供代谢疾病(糖尿病患者)肠胃微生物群落中的蛋白质降解菌群的结构及其营养功能的原位信息。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，该方法完全采用免培养的分子微生物生态学的方法，不需要分离菌株，并可对在原位状态下的人体肠道中蛋白质降解菌进行标定和追踪。本发明以肠道蛋白质降解菌为标靶，可以作为人体长期的健康干预的定向指标，为定义和诊断人类肠道微生物功能菌群的稳定性提供数据支持。同时，探测和标定肠道蛋白质降解菌，可发现人个体之间的生理性差异对宿主能量代谢响应的关系。
[0009]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，包括如下步骤:
步骤(I)，在无菌条件下收集粪便中的总细菌:
(1.1)样品采集:用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便在无菌袋中后，立即保存于37°C的保温箱中，并于20分钟内送到实验室处理；
(I.2)稀释样品:取新鲜粪便，加入到pH 7.0-8.0为I X PBS缓冲液，混匀;所述的新鲜粪便与1\?83缓冲液的质量体积比胃/^=(0.95-1.05):3.5;
(1.3)匀浆过滤:将步骤(1.2)混匀的液体转入到B1-Rad匀浆袋中，然后置于B1-Rad匀浆器中匀浆，匀浆后，将匀浆袋中的液体通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，取滤液；
(1.4)滤液离心:将步骤(1.3)的滤液置于离心管中，离心，去除上清液；
(1.5)收集细菌细胞:将步骤(1.4)得到的去除上清液的物质重新悬浮于pH为7.0-8.0的I XPBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，然后储存于4°C下，待用;本步骤重悬所用的I XI3BS缓冲液是步骤(1.2)所用的I XPBS缓冲液体积的13-15%;步骤(2)，蛋白质降解细菌的标定和示踪:
(2.1)细胞悬浮液离心:取400yL-1000yL的步骤(1.5)制得的细胞悬浮液，离心，去除上清液；
(2.2)染色:向加入步骤(1.4)得到的去除上清液的物质中依次加入浓度为10-1OOmM、pH为7.8-8.0的I X Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液，得到混合液体，之后立即将混合液体转入到宽底血清瓶中，以保证混合液体与绿色荧光小牛血清白蛋白染液充分混合，随后向混合液体中加入叠氮化钠至最终浓度为3 mM，接着加入氟乙酸钠至最终浓度为2mM，再加入碘代乙酰胺钠至最终浓度为4mM，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；
其中，所述的I XTris-HCl缓冲液的体积与步骤(2.1)所取的细胞悬浮液体积相同；所用的BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液的体积是I XTris-HCl缓冲液体积的一半；
(2.3)培养:将步骤(2.2)得到的铝箔包严避光的血清瓶固定在旋转摇床上，于25-35°C下，摇动30-60分钟，速度保持在220-280 R.P.M；
(2.4)观察样品的预处理:于暗室中，吸取10-20yL步骤(2.3)培养得到的液体，均匀涂布于带有明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干10-20分钟；
(2.5)观察:将步骤(2.4)干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100X的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，显示绿色荧光的即为蛋白质降解细菌。
[0010]进一步，优选的是，所述的步骤(1.3)中匀浆，采用B1-Rad匀浆器，以5000-10000R.P.M匀浆8-15 min。
[ΟΟ?? ] 进一步，优选的是，所述的步骤(1.4)中所述的离心具体是4500g-5000g离心5-20
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[0012]进一步，优选的是，所述的步骤(2.1)中所述的离心具体是4000-5000g离心10-20分钟。
[0013]本发明方法的部分原理如下:
1.BODIPY BSA染色法原理:
Thermo Fisher Scientific公司的BODIPY FL BSA绿色焚光染液主要用于测量液体中丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶和巯基蛋白酶的活力，本专利申请的创新之处在于把它用于标记混合微生物样品，如人体粪便中的细胞壁质间具有丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶和巯基蛋白酶的单个蛋白质降解细菌。其原理为:带有荧光的有机大分子BODIPY (boron-dipyrromethene)与小牛血清白蛋白相结合，使BODIPY中的绿色焚光被包裹在结合物的内部，使其在荧光显微镜观察不到，而一旦它被细胞质壁间的丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶和巯基蛋白酶水解，就释放出带有荧光的短片段水解产物，这些水解产物沉积在有相关酶活力的细菌细胞壁周围，于是在荧光显微镜下可观察到被荧光标记的单个具有特定蛋白酶活性的细胞，即被荧光标记的细胞能分泌丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶和巯基蛋白酶，所以呈现荧光的细胞被称为蛋白质降解细菌。
[0014]排除染色过程中的假阳性:
为了区分具有水解酶活性与没有水解酶活性但能吸收水解产物的细胞(错误标记)，在培养中我们加入了各种电子传递链抑制剂以保证结果的可靠性，具体实验步骤和使用的化学药品请参阅在蛋白酶染色培养过程中。其原理是微生物菌群会水解或发酵加入的标记化学物(B0DIPY标记的小牛血清白蛋白)，因此能吸收带有标记的代谢产物的所有细胞也都会被标记，那么我们在荧光显微镜下看到的呈现荧光的细胞，可能是两类细菌:蛋白质降解细菌和吸收带有荧光标记的小牛血清白蛋白的水解产物的细菌，而加入电子传递链抑制剂的目的是为了抑制细菌吸收带有荧光标记的小牛血清白蛋白的水解产物，防止由于主动吸收带有荧光标记物的水解产物而导致的假阳性，保证了所观察到的带有荧光标记的细菌全部都是蛋白质降解细菌。
[0015]此外，为了得到最优化的培养时间，以保证最大限度的观察蛋白酶的活性和标定蛋白质降解细菌，
【申请人】用不同的样品(搜集10个普通人的粪便)，分别测试了不同的培养时间，从10分钟开始，以后每隔10分钟观察一次，直到2个小时。所观察到的细菌保持同样的现状，只是荧光强度有所区别。经过用软件Image J分析和对比图片，发现从培养30分钟所取的样品，能观察到最强的荧光信号。
[0016]本发明与现有技术相比，其有益效果为:
本发明申请开发了一种从复杂微生物生态系统混合微生物群落中示踪和标定蛋白质水解菌群的手段，由于以前研究人体肠道功能菌群的方法都是通过纯培养首先分离菌株，然后在此基础上，对每一株细菌进行生理，生化研究。这些研究耗时，成本较高，操作过程复杂，特别是操作人员需要接受特殊的培训，才能完成对细菌鉴定的任务。此发明申请手段和以前的纯培养方法比较，特点是较大地缩短了降低劳动强度(劳动强度降低了 50%)，成本较低(成本减少了60%)，操作过程简便，操作人员不需要特殊的培训，对检测的地点无特殊的要求，实验结果准确，能迅速提供给诊断人员相关的数据。
[0017]本发明申请提供的一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法可用于探索人类疾病产生的原理，为科学的认识人体代谢疾病提供科学的指导，特别是为提供新的治疗手段，提供科学依据。检测粪便中微生物功能菌群的组成将是人类疾病诊断和健康评估的重要内容之一。本发明申请描述了一种示踪人类粪便中蛋白质水解细菌的方法。
[0018]本发明申请开发了从复杂微生物生态系统混合微生物群落中示踪和标定蛋白质水解菌群的手段，此手段和以前的纯培养方法比较，特点是快速，成本较低，操作简便，操作人员不需要特殊的培训，对检测的地点无特殊的要求，实验结果准确，能迅速提供给诊断人员相关的数据。
【附图说明】
[0019]图1是本发明快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法的流程示意图；
图2是新鲜人体粪便微生物群落中绿色荧光小牛血清白蛋白染色阳性蛋白质降解微生物显微照片图；
图3是预处理后的人体粪便样品微生物群落中绿色荧光小牛血清白蛋白染色阳性蛋白质降解微生物显微照片图。
[0020]其中，图2和图3中箭头所指的细菌即为蛋白质水解细菌。
【具体实施方式】
[0021 ]下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0022]本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
[0023]本发明所采用的带有明胶涂层的载玻片为帆船牌，型号为CAT.N0.7101，购自济南万德广联医疗器械有限责任公司。
[0024]实施例1
一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，其流程如图1所示，包括如下步骤: 步骤(I)，在无菌条件下收集粪便中的总细菌:
(1.1)样品采集:用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便在无菌袋中后，立即保存于37°C的保温箱中，并于20分钟内送到实验室处理；
(1.2)稀释样品:取新鲜粪便1g，加入到pH7.0为I X PBS缓冲液，混匀;所述的新鲜粪便与I XPBS缓冲液的质量体积比W/V=0.95:3.5；
(1.3)匀浆过滤:将步骤(1.2)混匀的液体转入到B1-Rad匀浆袋中，然后置于B1-Rad匀浆器中以5000R.P.M匀浆8min，匀浆后，将匀浆袋中的液体通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，取滤液；
(1.4)滤液离心:将步骤(1.3)的滤液置于离心管中，4500g离心5min，去除上清液；
(1.5)收集细菌细胞:将步骤(1.4)得到的去除上清液的物质重新悬浮于pH为7.0的IXPBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，然后储存于4°C下，待用；本步骤重悬所用的I XPBS缓冲液是步骤(1.2)所用的I XPBS缓冲液体积的13%;
步骤(2)，蛋白质降解细菌的标定和示踪:
(2.1)细胞悬浮液离心:取400yL的步骤(1.5)制得的细胞悬浮液，4000离心10分钟，去除上清液；
(2.2)染色:向加入步骤(1.4)得到的去除上清液的物质中依次加入浓度为10mM、pH为7.8的I X Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液，得到混合液体，之后立即将混合液体转入到宽底血清瓶中，以保证混合液体与绿色荧光小牛血清白蛋白染液充分混合，随后向混合液体中加入叠氮化钠至最终浓度为3 mM，接着加入氟乙酸钠至最终浓度为2mM，再加入碘代乙酰胺钠至最终浓度为4mM，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；
其中，所述的I XTris-HCl缓冲液的体积与步骤(2.1)所取的细胞悬浮液体积相同；所用的BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液的体积是I XTris-HCl缓冲液体积的一半；
(2.3)培养:将步骤(2.2)得到的铝箔包严避光的血清瓶固定在旋转摇床上，于25°C下，摇动30分钟，速度保持在220R.P.M;
(2.4)观察样品的预处理:于暗室中，吸取1yL步骤(2.3)培养得到的液体，均匀涂布于带有明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干10分钟；
(2.5)观察:将步骤(2.4)干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100 X的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，显示绿色荧光的即为蛋白质降解细菌。
[0025]实施例2
一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，包括如下步骤:
步骤(I)，在无菌条件下收集粪便中的总细菌:
(1.1)样品采集:用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便在无菌袋中后，立即保存于37°C的保温箱中，并于20分钟内送到实验室处理；
(I.2)稀释样品:取新鲜粪便20 g，加入到pH 8.0为I X PBS缓冲液，混匀;所述的新鲜粪便与I XPBS缓冲液的质量体积比W/V=l.05:3.5；
(1.3)匀浆过滤:将步骤(1.2)混匀的液体转入到B1-Rad匀浆袋中，然后置于B1-Rad匀浆器中以10000R.P.M匀浆15 min，匀浆后，将匀浆袋中的液体通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，取滤液；
(1.4)滤液离心:将步骤(1.3)的滤液置于离心管中，5000g离心20min，去除上清液；
(1.5)收集细菌细胞:将步骤(1.4)得到的去除上清液的物质重新悬浮于pH为8.0的IXPBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，然后储存于4°C下，待用；本步骤重悬所用的I XPBS缓冲液是步骤(1.2)所用的I XPBS缓冲液体积的15%;
步骤(2)，蛋白质降解细菌的标定和示踪:
(2.1)细胞悬浮液离心:取100yL的步骤(1.5)制得的细胞悬浮液，5000g离心20分钟，去除上清液；
(2.2)染色:向加入步骤(1.4)得到的去除上清液的物质中依次加入浓度为100mM、pH为8.0的I X Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液，得到混合液体，之后立即将混合液体转入到宽底血清瓶中，以保证混合液体与绿色荧光小牛血清白蛋白染液充分混合，随后向混合液体中加入叠氮化钠至最终浓度为3 mM，接着加入氟乙酸钠至最终浓度为2mM，再加入碘代乙酰胺钠至最终浓度为4mM，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；
其中，所述的I XTris-HCl缓冲液的体积与步骤(2.1)所取的细胞悬浮液体积相同；所用的BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液的体积是I XTris-HCl缓冲液体积的一半；
(2.3)培养:将步骤(2.2)得到的铝箔包严避光的血清瓶固定在旋转摇床上，于35°C下，摇动60分钟，速度保持在280R.P.M;
(2.4)观察样品的预处理:于暗室中，吸取20yL步骤(2.3)培养得到的液体，均匀涂布于带有明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干20分钟；
(2.5)观察:将步骤(2.4)干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100X的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，显示绿色荧光的即为蛋白质降解细菌。
[0026]
实施例3
一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，包括如下步骤:
步骤(I)，在无菌条件下收集粪便中的总细菌:
(1.1)样品采集:用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便在无菌袋中后，立即保存于37°C的保温箱中，并于20分钟内送到实验室处理；
(1.2)稀释样品:取新鲜粪便15g，加入到pH7.5为I XPBS缓冲液，混匀;所述的新鲜粪便与I XPBS缓冲液的质量体积比W/V=l:3.5；
(1.3)匀浆过滤:将步骤(1.2)混匀的液体转入到B1-Rad匀浆袋中，然后置于B1-Rad匀浆器中以8000R.P.M匀浆1min，匀浆后，将匀浆袋中的液体通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，取滤液；
(1.4)滤液离心:将步骤(1.3)的滤液置于离心管中，4700g离心10min，去除上清液；
(1.5)收集细菌细胞:将步骤(1.4)得到的去除上清液的物质重新悬浮于pH为7.5的IXPBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，然后储存于4°C下，待用；本步骤重悬所用的I XPBS缓冲液是步骤(1.2)所用的I XPBS缓冲液体积的14%;
步骤(2)，蛋白质降解细菌的标定和示踪:
(2.1)细胞悬浮液离心:取700yL的步骤(1.5)制得的细胞悬浮液，4500g离心15分钟，去除上清液；
(2.2)染色:向加入步骤(1.4)得到的去除上清液的物质中依次加入浓度为50mM、pH为7.9的I X Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液，得到混合液体，之后立即将混合液体转入到宽底血清瓶中，以保证混合液体与绿色荧光小牛血清白蛋白染液充分混合，随后向混合液体中加入叠氮化钠至最终浓度为3 mM，接着加入氟乙酸钠至最终浓度为2mM，再加入碘代乙酰胺钠至最终浓度为4mM，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；
其中，所述的I XTris-HCl缓冲液的体积与步骤(2.1)所取的细胞悬浮液体积相同；所用的BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液的体积是I XTris-HCl缓冲液体积的一半；
(2.3)培养:将步骤(2.2)得到的铝箔包严避光的血清瓶固定在旋转摇床上，于30°C下，摇动45分钟，速度保持在260R.P.M;
(2.4)观察样品的预处理:于暗室中，吸取16yL步骤(2.3)培养得到的液体，均匀涂布于带有明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干14分钟；
(2.5)观察:将步骤(2.4)干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100X的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，显示绿色荧光的即为蛋白质降解细菌。
[0027]实施例4
本实施例中将采用新鲜人体粪便细胞样品标定肠道蛋白质降解菌。本发明方法流程图如图1所示。
[0028]—种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，包括如下步骤:
步骤(I)，在无菌条件下收集粪便中的总细菌:
(1.1)样品采集:用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便(或者根据诊断的具体要求和目的，采集特殊的病人新鲜粪便)装在无菌袋中，粪便在采样现场后，立即保存于37°C的保温瓶中(相似于人体的正常体温)，并于20分钟内送到实验室处理；
(1.2)稀释样品:用无菌的50ml烧杯称取10g新鲜粪便，加入35毫升I XPBS缓冲液(pH7.0)，混匀；
(1.3)洗脱细胞:将混匀的液体转入到B1-Rad匀浆袋中，在B1-Rad匀浆器高速档(5000 R.P.M)匀浆8分钟，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤； (1.4)收集滤液:将滤液收集在无菌的50ml离心管中，离心(5000g) 15分钟；
(1.5)收集沉淀物(细菌细胞):去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于5ml的I XPBS缓冲液(pH7.0)中，待用。在等待下一步的实验过程中，可将细胞悬浮液储存于4°C的冰箱中。
[0029]步骤(2)，蛋白质降解细菌的标定和示踪:
(2.1)取40(^1^细胞悬浮液(从上一步中获得)转入2mL eppendof离心管中，离心(4500g)10 分钟；
(2.2)去除上清液，加入40(^1^I 父1^8-!1(:1缓冲液(10111]\1，？!17.8)，再加入20(^1^BODIPY (boron-dipyrromethene)标记的绿色焚光小牛血清白蛋白BSA染液[购自ThermoFisher Scientif ic]，立即将混合液体转入到1ml的宽底血清瓶中，随后加入3种电子传递链抑制剂[最终浓度分别为叠氮化钠3mM，氟乙酸钠2mM，碘代乙酰胺钠4mM，按照总反应体积600yL计算]，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；
(2.3)将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动30分钟，速度保持在220r.P.m;
(2.4)将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取1yL均匀涂布于用明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干20分钟；
(2.5)将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100X的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，蛋白质降解细菌呈现绿色荧光(如图2中箭头所指示的细菌)。本方法可用于示踪人体粪便中细胞壁质间的具有蛋白酶活性的蛋白质水解细菌。
[0030]对比实验
同时，
【申请人】为了证明所观察到的是原位状态下蛋白酶的活性，而不是经过诱导产生的蛋白酶，做了预培养实验，具体如下:
预处理:用10人(搜集10个普通人的粪便)10g新鲜的人体粪便样品，分别加入35毫升IXI3BS缓冲液(pH 7.0)，混匀;加入没有标记的小牛血清白蛋白(BSA 5g)，在有氧条件下，置于旋转摇床上室温摇动，速度保持在220 r.p.m，进行诱导和加强蛋白酶活性的培养，当样品培养到I小时、4小时和12小时，分别取样并保存于4°C的冰箱中，得到3个预处理样品。
[0031]在无菌条件下收集粪便中的总细菌以及蛋白质降解细菌的标定和示踪:将3个预处理样品重复新鲜样品的收集总细胞的过程，染色的实验过程(即预处理后，采用与本发明实施例4完全相同的方法)。
[0032]经检测，观察到的蛋白质水解细菌的形状(如图3中箭头所指示的细菌)相同于未经过预处理的新鲜样品的蛋白质水解细菌(如图2中箭头所指示的细菌)，从而证明了用BODIPY FL BSA(小牛血清白蛋白)标定的蛋白质降解细菌表现出来的蛋白活性并不需要诱导，探测到的是在原位状态下的人体肠道蛋白质降解细菌本身携带的蛋白酶。
[0033]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤(I)，在无菌条件下收集粪便中的总细菌: (1.1)样品采集:用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便在无菌袋中后，立即保存于37°C的保温箱中，并于20分钟内送到实验室处理； (1.2)稀释样品:取新鲜粪便，加入到pH7.0-8.0为I XPBS缓冲液，混匀;所述的新鲜粪便与1\?83缓冲液的质量体积比胃/^=(0.95-1.05):3.5; (1.3)匀浆过滤:将步骤(1.2)混匀的液体转入到B1-Rad匀浆袋中，然后置于B1-Rad匀浆器中匀浆，匀浆后，将匀浆袋中的液体通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，取滤液； (1.4)滤液离心:将步骤(1.3)的滤液置于离心管中，离心，去除上清液； (I.5)收集细菌细胞:将步骤(1.4)得到的去除上清液的物质重新悬浮于pH为7.0-8.0的I XPBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，然后储存于4°C下，待用;本步骤重悬所用的I XI3BS缓冲液是步骤(1.2)所用的I XPBS缓冲液体积的13-15%; 步骤(2)，蛋白质降解细菌的标定和示踪: (2.1)细胞悬浮液离心:取400yL-1000yL的步骤(1.5)制得的细胞悬浮液，离心，去除上清液； (2.2)染色:向加入步骤(1.4)得到的去除上清液的物质中依次加入浓度为10-100mM、pH为7.8-8.0的I X Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液，得到混合液体，之后立即将混合液体转入到宽底血清瓶中，以保证混合液体与绿色荧光小牛血清白蛋白染液充分混合，随后向混合液体中加入叠氮化钠至最终浓度为3 mM，接着加入氟乙酸钠至最终浓度为2mM，再加入碘代乙酰胺钠至最终浓度为4mM，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光； 其中，所述的I XTris-HCl缓冲液的体积与步骤(2.1)所取的细胞悬浮液体积相同；所用的BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液的体积是I XTris-HCl缓冲液体积的一半； (2.3)培养:将步骤(2.2)得到的铝箔包严避光的血清瓶固定在旋转摇床上，于25-35°C下，摇动30-60分钟，速度保持在220-280 R.P.M； (2.4)观察样品的预处理:于暗室中，吸取10-20yL步骤(2.3)培养得到的液体，均匀涂布于带有明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干10-20分钟； (2.5)观察:将步骤(2.4)干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100X的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，显示绿色荧光的即为蛋白质降解细菌。2.根据权利要求1所述的快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，其特征在于，所述的步骤(1.3)中匀浆，采用B1-Rad匀浆器，以5000-10000 R.P.M匀浆8-15 min。3.根据权利要求1所述的快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，其特征在于，步骤(1.4)中所述的离心具体是4500g_5000g离心5-20 min。4.根据权利要求1所述的快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，其特征在于，步骤(2.1)中所述的离心具体是4000-5000g离心10-20分钟。
【文档编号】C12Q1/04GK105886595SQ201610278619
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】夏云, 孔云虹, 黄鹤平, 王定康, 董宝财
【申请人】夏云