一种烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法。针对烟草黑胫病为土传病害，模拟田间病原菌侵染途径及方式，提供了一种烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法。该方法是将烟草黑胫病菌扩繁后打取菌蝶接种到湿热灭菌处理的小麦粒上，摇匀后置于26℃培养至每个小麦粒上均匀长满菌丝，然后接种到鉴别寄主NC 1071、L8和Hick`s或小黄金1025的3?5叶期幼苗土壤中，每株幼苗接2粒，接种12d后，调查各鉴别寄主死亡数，3株鉴别寄主中2株以上死亡即为感病，反之抗病，根据抗感反应确定相应的生理小种。本发明可操作性好、准确性高、速度快、设备简单、占地面积小，可以短时间在温室内进行大批量烟草黑胫病菌的生理小种鉴定。
【专利说明】
一种烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及农业植物保护技术领域，具体涉及一种烟草黑胫病菌的生理小种鉴定 方法。
【背景技术】
[0002] 烟草黑胫病（Tob acco Blac k Shank)是由烟草黑腔病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起的一种世界性烟草毁灭性病害，在中国烟草主产区也严 重发生，流行年份一般发病率为40-50%，严重时达70 %，甚至成片死亡。实践证明只有采用 以抗病品种为核心的综合防治，才能有效地控制烟草黑胫病的为害。国内外报道，烟草黑胫 病菌存在着生理分化现象，这就给抗病育种和抗病品种的应用带来了难题。因此，生理小种 的鉴定是解决这些问题的关键，给烟草抗病育种和抗病品种的合理布局提供科学依据。
[0003] 目前，中国烟草黑胫病菌生理小种的鉴定主要是参考王智发等（1987)、李锡坤等 (2011)和苗圃（2013)采用的孢子悬浮液注射接种;还有王革等（1997)用菌丝块直接贴于茎 基部的表面，然后保湿培养，进行了致病力的研究;朱贤朝等（1984,1986,1987)比较了游动 孢子悬浮液灌根接种、茎创伤接种和游动孢子悬浮液注射接种3种不同的方法。但这些接种 方法除游动孢子灌根法外，都是人为造成伤口，发病程度要比田间实际侵染重得多，而游动 孢子灌根法准备游动孢子悬浮液操作繁琐，过程相对复杂。因此，本发明是模拟土传病害侵 染特点，将烟草黑茎病菌接种到土壤中，这种接种方法与自然条件下的侵染是一致的，操作 简单，也是一种较为理想的烟草黑胫病菌生理小种鉴定的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法。
[0005] 为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现。
[0006] (1)烟草黑胫病菌的培养:将烟草黑胫病菌菌丝块接种到V8汁琼脂培养基平板上， 置于26 °C培养箱中黑暗培养5d;
[0007] (2)无菌小麦粒的制备:将市售的小麦粒称取10g加上自来水浸泡12h后，滤掉自来 水，放入100mL三角瓶内，用锡纸封上三角瓶的口，湿热灭菌20min;
[0008] (3)带菌小麦粒的培养:将步骤（1)培养的烟草黑胫病菌平板用打孔器打成0.7cm 的菌蝶，将5个菌蝶在无菌条件下放入步骤(2)灭菌小麦粒三角瓶中，摇匀后置于26°C培养 箱中黑暗培养5d，每天晃动三角瓶1次，使每个小麦粒上均匀长满菌丝；
[0009] (4)鉴别寄主的种植：将鉴别寄主NC 1071(仅含Php基因）、L8(仅含Phi基因）和 Hicks或小黄金1025(感病品种)烟草种子均匀撒播在带有黑壤土的育苗盘表面，上覆0.2cm 的表土，适量浇水，放置于温室中20-30°C培养至3叶期，转移至5cm培养钵中，每株1钵，培养 7d后，准备接种；
[0010] (5)生理小种鉴定:将步骤(3)培养好的带菌的小麦粒用镊子放在步骤(4)各鉴别 寄主幼苗的培养钵中，离苗的根周围lcm处，深0.5cm处相对方向放2粒。
[0011] (6)结果调查与分析:根据步骤(5)接种12d后，调查各鉴别寄主死亡数，3株鉴别寄 主中死亡2株以上即为感病，相反为抗病。鉴别寄主NC 1071、L8和Hick's(或小黄金1025)均 表现感病为1号生理小种；鉴别寄主NC 1071和L8表现抗病，而Hick's(或小黄金1025)表现 感病为〇号生理小种;鉴别寄主NC 1071表现抗病，L8和Hick's(或小黄金1025)均表现感病 为3号生理小种。
[0012]本发明的显著优点：
[0013] 本发明提供一种烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法，针对烟草黑胫病为土传病 害，模拟田间病原菌侵染途径及方式，采用带菌小麦粒根部接种法，更接近田间生产实际， 鉴定结果更加准确可靠。本发明可操作性高、准确性好、速度快、设备简单、占地面积小。如 一种病圃中烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法(发明专利申请号:CN200910094995.1)也能 进行烟草黑胫病菌的生理小种的鉴定，但该方法是在病圃中栽培鉴别寄主，烤烟烟叶采收 后挖根调查，这种方法鉴定时间长、成本高、占地面积大，不适合大批量测定，同时也受田间 病原菌量的影响，稳定性差。因此，本发明的方法简便易行，可以短时间在温室内进行大批 量烟草黑胫病菌的生理小种鉴定。
【具体实施方式】
[0014] 以下结合实施例和试验数据，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细 的说明。
[0015] 实施例1、26个烟草黑胫病菌生理小种的鉴定
[0016] 实验方法如下：
[0017] (1)烟草黑腔病菌的分离
[0018] 在烟草黑胫病发病田采集病株，在实验室内通过组织分离法，剪取病健交界处小 块组织，经过70%酒精处理2s中，0.1 %的升汞处理3min，晾干后放在带有抗生素的V8汁琼 脂培养基上，无菌水换洗3次，干燥后放入带有青霉素 (50yg/mL)的V8汁琼脂培养基平板上， 26°C黑暗培养2-3d，待长出菌落，纯化备用，即得到烟草黑胫病菌，共获得烟草黑胫病菌26 株。
[0019] ⑵鉴别寄主的种植：
[0020] 将鉴别寄主NC 1071 (仅含Php基因）、L8(仅含Phi基因）和Hicks或小黄金1025(感 病品种）（鉴别寄主可由中国烟草总公司青州烟草研究所或通过相关参考文献研究者获得： 苗圃，王海涛，李淑君，康业斌.河南省烟草黑胫病菌生理小种鉴定.西北农业学报，2013，22 (10) :204-207 ;李梅云，李永平.病圃中烟草疫霉生理小种的鉴定.云南农业大学学报， 2013，28( 1): 21-26)烟草种子均匀撒播在带有黑壤土的育苗盘表面，上覆0.2cm的表土，适 量浇水，放置于温室中20-30°C培养至3叶期，转移至5cm培养钵中，每株1钵，培养7d后，准备 接种；
[0021] (3)接种体的准备
[0022]将市售的小麦粒称取10g加上自来水浸泡12h后，滤掉自来水，放入100mL三角瓶 内，用锡纸封上三角瓶的口，共制备26瓶，湿热灭菌20min。
[0023]将烟草黑胫病菌菌丝块接种到V8汁琼脂培养基平板上，置于26°C培养箱中黑暗培 养5d，用打孔器打成0.7cm的菌蝶，将5个菌蝶在无菌条件下放入灭菌小麦粒三角瓶中，每菌 株接1个三角瓶，摇匀后置于26 °C培养箱中黑暗培养5d，每天晃动三角瓶1次，使每个小麦粒 上均匀长满菌丝；
[0024] (4)接种:将培养好的带菌的小麦粒用镊子放在各鉴别寄主幼苗(3-5叶期）的培养 钵中，离苗的根周围lcm处，深0.5cm处放2粒。
[0025] (6)结果调查与分析:接种12d后，调查各鉴别寄主死亡数，3株鉴别寄主中死亡2株 及以上即为感病，相反为抗病。鉴别寄主NC 1071、L8和Hick's(或小黄金1025)均表现感病 为1号生理小种;鉴别寄主NC 1071和L8表现抗病，而Hick's(或小黄金1025)表现感病为0号 生理小种;鉴别寄主NC 1071表现抗病，L8和Hick's(或小黄金1025)均表现感病为3号生理 小种。结果见表1。
[0026]表1 26个烟草黑胫病菌生理小种的鉴定
[0029] 从表1中可以看出，该地区烟草黑茎病菌1号生理小种为20株，0号生理小种6株，说 明该地区1号生理小种为优势小种，未发现3号生理小种。
[0030]总之，本发明针对目前中国烟草黑胫病生理小种鉴定多采用的注射法与实际侵染 差别较大，接种量大，接种位置和深度不容易控制，导致发病程度也存在较大差异等问题， 以及田间病圃鉴定时间长、成本高、占用空间大等问题，发明了本方法。针对烟草黑胫病为 土传病害，模拟田间病原菌侵染途径及方式，采用带菌小麦粒根部接种法，更接近田间生产 实际，鉴定结果更加准确可靠。本发明可操作性好、准确性高、速度快、设备简单、占地面积 小，可以短时间在温室内进行大批量烟草黑胫病菌的生理小种鉴定，也可用于致病力测定 和抗性资源筛选等。
【主权项】
1. 一种烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法是将烟草黑胫病菌菌丝块接种到 V8汁琼脂培养基平板上，置于26 °C培养箱中黑暗培养5d。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法是将市售的小麦粒称取IOg加上 自来水浸泡12h后，滤掉自来水，放入IOOmL三角瓶内，用锡纸给三角瓶封口，湿热灭菌为 20min〇4. 根据权利要求2和3所述的方法，其特征在于:所述方法是将培养的烟草黑胫病菌平 板用打孔器打成0.7cm的菌蝶，将5个菌蝶在无菌条件下放入灭菌小麦粒三角瓶中，摇匀后 置于26°C培养箱中黑暗培养5d，每天晃动三角瓶1次，使每个小麦粒上均匀长满菌丝。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中将鉴别寄主NCl 071 (仅含Php基 因）、L8(仅含Phl基因）和Hick's或小黄金1025(感病品种)烟草种子均匀撒播在带有黑壤土 的育苗盘表面，上覆〇.2cm的表土，适量浇水，放置于温室中20-30°C培养至3叶期，转移至 5cm培养钵中，每株1钵，培养7d后，准备接种。6. 根据权利要求4和5所述的方法，其特征在于:所述方法将培养好带菌的小麦粒用镊 子放在长有各鉴别寄主幼苗(3-5叶期）的培养钵中，离苗的根周围Icm处，深0.5cm处相对方 向放2粒。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法接种12d后，调查各鉴别寄主死亡 数，3株鉴别寄主中2株以上死亡即为感病，相反为抗病，对照国际标准鉴别寄主抗感反应表 判定烟草黑茎病菌的生理小种。8. 根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：所述方法中的操作均需要无菌操 作，在无菌操作台内进行。9. 权利要求1-8任一所述方法在烟草黑胫病菌生理小种鉴定中应用。
【文档编号】C12R1/645GK105886594SQ201610264916
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】李永刚, 田丽娟, 张俊华
【申请人】东北农业大学