专利名称：抗黑胫病烟草品种红花大金元的培育方法
技术领域：
本发明涉及植物育种和细胞工程领域，具体地涉及一种抗黑胫病烟草品种红花大金元的培育方法。
黑胫病(Phytophythora Parasitica Via Nicotina)是病原菌侵入烟草植株后，分泌毒素、酶等毒物，杀死寄主细胞，从死亡细胞中吸取营养使烟草致病的真菌性病害。烟草黑胫病是由烟草疫霉引起的，借土壤及流水传播的真菌病，是世界范围内对烟草生产威胁最严重的病害之一。“红花大金元”是烟草的主栽品种，但高感黑胫病，因此，需要培育既保持了“红花大金元，，优良品性又具有对黑胫病抗性的优良品系。现有技术中植物品种的培育方法常用的杂交法、系统选育法存在着以下缺点杂交法选择所需要的亲本进行有性杂交，周期长、选择性差，到目前为止，尚未用此法育出抗黑胫病的红花大金元品种。系统选育法在大田中选择抗黑胫病较强的单株，后代分离也十分严重，目前也未能用系统选育法选择出抗病新品种。由于目前尚未分离到有效抗真菌的基因，因此采用细胞工程方法筛选抗病突变体是切实可行的。
为了克服现有技术存在的上述缺点，本发明的目的在于提供一种抗黑胫病烟草品种红花大金元的培育方法，该方法培育时间短、效率高、分析结果灵敏度高。
为了实现本发明的目的，本发明提供了下述技术方案
抗黑胫病烟草品种红花大金元的培育方法，采用细胞突变法，将烟草品种红花大金元的体细胞和花药经γ-射线处理后，在含有黑胫病毒素的培养基上筛选抗病株系，通过黑胫病毒素的诱变筛选即分离黑胫病病原体、提取黑胫病毒素、体细胞抗性筛选、单倍体筛选得抗黑胫病株系，具体地，在感病的烟草茎杆内分离纯化黑胫病病原体，并建立黑胫病病原体繁殖条件，然后从直接感病的“红花大金元”植株分离到黑胫病病原菌菌种，进行培养和和纯化；体细胞抗性筛选是将分离到的黑胫病病原体接种于黄氏合成培养基中，28℃黑暗条件下培养2周，调节PH5.7-5.8，用0.45μ微机滤膜过滤，得粗毒素，用含粗毒素60％的MS＋6BAlmg/l培养基接种预培养1周的二倍体叶片外植体，2个月后得到抗性小芽，将抗性小芽转入MS培养基上，一个月后转至含黑胫病毒素滤液的培养基上，然后进行单倍体筛选途径，用含粗毒素80％的“烟草一号”培养基大量接种花药进行筛选，通过抗病筛选，得到了抗黑胫病株系；将上述抗病体细胞突变体株系进行病圃筛选，在M2代发生了分离现象，M3代得到稳定株系，进行病圃抗病筛选；单倍体突变体病圃抗病筛选采用含有黑胫病原菌的菌谷，施放在烟草基部，筛选抗病株系。
本发明采用细胞突变法，将烟草品种红花大金元的体细胞和花药经γ-射线处理后，在含有黑胫病毒素的培养基上筛选抗病株系。本法分两大部分建立黑胫病毒素的诱变筛选条件分离黑胫病病原体，在感病的烟草茎杆内分离纯化黑胫病病原体，并建立黑胫病病原体繁殖条件；提取黑胫病毒素从直接感病的“红花大金元”植株分离到黑胫病病原菌(ppn)菌种，进行了培养和纯化；体细胞抗性筛选将分离到的ppn接种于黄氏合成培养基中，28℃黑暗条件下培养2周，调节PH5.7-5.8，用0.45μ微机滤膜过滤，得粗毒素。用含粗毒素60％的MS(6BAlmg/l)培养基接种预培养1周的二倍体叶片外植体。2个月后得到抗性小芽，选择效率为0.5％，将抗性小芽转入MS培养基上，一个月后转至含毒滤液的培养基上，发现用前者选出的抗性小苗对后者同样具有抗性。单倍体筛选途径用含粗毒素80％的“烟草一号”培养基大量接种花药进行筛选，在培养基中发现具有毒素因子，经高压处理仍不变性或失活成分，初步认为是耐高温的非蛋白组份，通过抗病筛选，得到了抗黑胫病株系。
大田病圃筛体细胞突变体大田筛选，在M2代发生了分离现象，M3代得到稳定株系；单倍体突变体病圃抗病筛选用含有黑胫病原菌的菌谷，施放在烟草基部，筛选抗病株系。
本发明与现有技术相比的优异之处1、培育周期短本发明诱变方法培育抗病品种时间短，一般3-5年，而传统方法时间较长，一般需用年以上；2、效率高细胞诱变法采用花药培养，由于花药内花粉小孢子群体数量大，可占用较小的空间进行大量筛选，筛选出的突变体为单倍体，可通过染色体加倍迅速纯合，因定优良性状，可在短期内高效选择突变体。
3、单倍体的RAPD分析对选出的单倍体以感病亲本为对照进行RAPD分析，找到了抗性单基因(CYA-170-100和Sangon 03-350)，为抗黑胫病RAPD标记基因。
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1首先进行黑胫病原分离，将烟草品种红花大金元的体细胞和花药经γ-射线处理后，在含有黑胫病毒素的培养基上筛选抗病株系，对感病植株进行表面消毒，取茎杆内未被其它菌感染的组织，在无菌条件下培养，得到菌丝体，经纯化后大量培养；取红花大金元花药进行离体培养，培养条件25℃，光照2000LUX。配制含黑胫病素培养基，培养花药；对培育的突变体组培苗进行抗病筛选，在室温接种黑胫病原，选出抗性植株；对选出抗病突变体进行抗性分析(RAPD分析)，也称随机扩增DNA多态性分析，提取红花大金元亲本及抗病突变体DNA进行RAPD分析，找出差异条带，用近等基因与亲本回交F1代经自交形成F2代，应出现感病与抗病分离，取F2代感病与抗病株的DNA进行随机扩增，抗病株出现共分离，证明抗病性是遗传上的改变，即由基因控制的。烟草单倍体加倍本来是很容易的。但突变体的加倍却十分困难，本发明单倍体加倍采用0.1％秋水仙碱，用5％甘油配制，处理烟草项芽，还要不断喷水，保持一定湿度。
第二步进行突变体后代田间病圃筛选突变体后代抗病性出现奇特现象，即不按孟德尔遗传规律分离，每个株系中出现了抗病单株，又经系统选育，得到三个稳定抗病株系A1-5体细胞抗病突变体，DH5-1，DH5-2单倍体抗病突变体，其抗病指数接近抗病品种革新三号，抗性评价为R(抗)。
实施例2验证实施例1体细胞突变方法的可靠性(1)、对转座因子的转座活性进行分析，采用标记基因的表型检测。本发明用农杆菌双元载体PSLH721(ACGUS)转化烟草红花大金元，然后对转基因烟草的愈伤组织进行GUS酶活性的组织化学分析，通过GUS活性变化来分析转座活性。结果表明组织培养可以增强转座子的活性，间接证明转座子活化是体细胞无性系变异的原因之一。(2)本发明从云南烟草产地分离到黑胫病0号小种和1B生理小种，并将其强化。得到菌种毒素。(3)以50％以及80％的黑胫病毒素的选择压力，筛选出抗黑胫病毒素的烟草株系，用离体叶片方法和茎部接种法进一步鉴定其对黑胫病病原菌的抗性。(4)利用随机引物扩增多态DNA(RAPD)分析技术，对选择到的九个抗病株系和六个对照的DNA进行分析，在使用的70种随机引物中，共有57个引物产生可检测扩增产物，产生306条扩增带。其中，有多态性的条带为51条，突变体的平均RAPD条带变异为1.85％其中有两个RAPD条带(CYA—17—100和SANGON03—350)为突变体所独有，初步判断为抗黑胫病和RAPD单基因分子标记。(5)遗传稳定性和分离规律。
在实验室条件下筛选抗病突变体，有时还面临实验室条件下的抗病性与田间抗病性不对应性的问题，这可能由于病原菌对寄主植物的侵染还受气候条件的影响，而实验室条件与田间气候条件相比存在很大不同所致，本发明筛选到的抗性突变体，在实验室经离体叶片法和茎部接种法都证实了抗性存在。
本发明对获得抗病突变体后代的抗毒素能力进行了检测，发现后代抗性以7∶1∶4(抗性∶中间∶敏感)进行分离，不符合单基因的孟得尔遗传规律，推测抗毒素性状可能是多基因不完全显性控制，这说明了培育抗黑胫病烟草的复杂性，不同品种间的抗性可能不完全一致。(6)抗病株系田间筛选a、二倍体株系筛选第一代在网室内种植；实验材料都生长良好，很类似杂交一代种的杂种优势现象；第二代在试验地筛选，种植面积三亩，结果是发生极大的分离现象，只从数千株中选出A、B、C、D四个单株，这四个单株F3代进行种植，结果生长基本一致，这样初步得到来自体细胞的遗传表型稳定的四个株系A、B、C、D(F4)代。将这四个株系在抗黑胫病圃中进行抗性筛选。
b、单倍体株系的筛选种植对6个单倍体株系，H1、H2代遗传表型都无分离现象，证明得到遗传纯合二倍体。将稳定的H3代在病圃内进行抗病筛选，结果出现了分离现象。这种抗性分离现象主要表现是每个株系中都有抗性很强的单株和不抗病单株，这种分离现象与实验室的抗性分离规律7∶1∶4有些近似，通过三年病圃抗性筛选，从二倍体和单倍体后代中都选出了抗性较好的株系(见表1)表1本发明筛选出的单倍体抗病株系
权利要求
1.抗黑胫病烟草品种红花大金元的培育方法，采用细胞突变法，将烟草品种红花大金元的体细胞和花药经γ-射线处理后，在含有黑胫病毒素的培养基上筛选抗病株系，通过黑胫病毒素的诱变筛选即分离黑胫病病原体、提取黑胫病毒素、体细胞抗性筛选、单倍体筛选得抗黑胫病株系，其特征是在感病的烟草茎杆内分离纯化黑胫病病原体，并建立黑胫病病原体繁殖条件，然后从直接感病的“红花大金元”植株分离到黑胫病病原菌菌种，进行培养和纯化；体细胞抗性筛选是将分离到的黑胫病病原体接种于黄氏合成培养基中，28℃黑暗条件下培养2周，调节PH5.7-5.8，用0.45μ微机滤膜过滤，得粗毒素，用含粗毒素60％的MS＋6BAlmg/1培养基接种预培养1周的二倍体叶片外植体，2个月后得到抗性小芽，将抗性小芽转入MS培养基上，一个月后转至含黑胫病毒素滤液的培养基上，然后进行单倍体筛选途径，用含粗毒素80％的“烟草一号”培养基大量接种花药进行筛选，通过抗病筛选，得到了抗黑胫病株系；将上述抗病体细胞突变体株系进行病圃筛选，在M2代发生了分离现象，M3代得到稳定株系，进行病圃抗病筛选；单倍体突变体病圃抗病筛选采用含有黑胫病原菌的菌谷，施放在烟草基部，筛选抗病株系。
全文摘要
提供一种抗黑胫病烟草品种红花大金元的培育方法,采用细胞突变法,将烟草品种红花大金元的体细胞和花药经γ－射线处理后,在含有黑胫病毒素的培养基上筛选抗病株系,通过黑胫病毒素的诱变筛选即分离黑胫病病原体、提取黑胫病毒素、体细胞抗性筛选、单倍体筛选得抗黑胫病株系,该方法培育时间短、效率高、分析结果灵敏度高。
文档编号C12N7/00GK1331914SQ0110871
公开日2002年1月23日 申请日期2001年8月6日 优先权日2001年8月6日
发明者何静波, 朱至清, 喻长惠, 李银心, 张志宏, 王玉秀, 孔光辉, 段玉琪, 李天飞 申请人:中国科学院昆明植物研究所