普通烟草类异黄酮还原酶基因及其应用的制作方法

专利名称：普通烟草类异黄酮还原酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种烟草基因，还涉及该基因的应用。
背景技术：
烟草是双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物。烟草属(Nicotiana)有60多个种，2个栽培种中普通烟草(又称红花烟草，Nicotiana tabacum)占据主要面积，黄花烟草(Nicotiana rustica)的面积很小。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是栽培最广的普通烟草。我国烤烟种植面积和总产量均居世界第一位。作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。为使在未来的国内外市场竞争中立于不败之地，满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须提高烟叶品质和安全性。烟碱(又称尼古丁，nicotine)是影响烟叶品质和安全性的最主要因素之一。适量的烟碱将给吸食者以适当的生理强度和好的香气与吃味，导致中枢神经适度的兴奋和松弛，使人精神振奋、心情舒畅、情绪稳定；过量的烟碱则刺激性过强，有害身体健康。此外,烟碱含量还要与烟草中其它化学成分含量保持比例协调，才能产生好的综合质量，例如水溶性糖与烟碱的比例常用来评价烟草的劲头和舒适程度。因此，适宜的烟碱含量是优质低害烟叶生产所追求的目标，也是摆在烟草科技工作者面前的一项紧迫任务。目前公认的优质低害烤烟烟叶化学成分为总糖18% -22%，还原糖16% -18%,还原糖/总糖比彡O. 9，总氮1.5% -3.5%，蛋白质7% -9%，烟碱1.5% -3. 5%，还原糖/烟碱比8-12，氮碱比为I或略小于1，钾彡2%，氯彡1%，钾/氯比>4。我国烤烟烟叶的外观质量目前己经基本达到或接近国际优质烟叶标准，但烟叶化学成分的协调性不够，尤其是中上部烟叶，突出表现为烟碱含量偏高，衡量烟叶化学成分协调性的主要指标(还原糖/烟碱比、氮碱比)不符合优质烟叶的标准。因此，降低中上部烟叶的烟碱含量，改善烟叶化学成分的协调性，以增加烟叶的工业可用性，提高烟叶的安全性，是烟草品质改良的重点。在常规技术措施降碱作用有限的条件下，用基因工程的手段将编码烟碱合成的限速酶或具有调解功能的酶的基因导入烟草中，培育低烟碱优质烟草品种，是一条很有前景的新途径。目前知道腐胺-N-甲基转移酶(PMT)和喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPT)是烟碱2个中间体生物合成中的最大限速酶，其他底物或酶在某些情况下具有调节作用，但对其调控机制缺乏深入了解。烟碱的合成是由烟酸与吡咯环结合而完成的，这个过程由烟碱合成酶所催化，目前尚未能对此酶进行分离和定性，因此关于烟碱最终合成的机理以及调节机制尚不清楚。此外，烟草目前多作为模式作物而不是目的植物用于基因工程研究，虽然抗性植物基因工程的研究成果可以直接应用于烟草的抗性育种，但品质改良基因工程的研究成果大多对烟草品质育种意义不大，这是因为，一方面对烟草自身生理代谢的分子机制缺乏深入的研究，另一方面烟草不同于常规农作物，其品质优劣主要取决于烟草内烟碱、糖、酸、醇、脂、色素、无机物等物质的综合作用。因此，有必要进行烟草烟碱生物合成相关基因的克隆并转化烟草进行功能验证，对烟草烟碱生物合成的分子机制进行深入的研究，为烟草品质的基因工程改良提供新的策略，推进低烟碱优质烟草的分子育种。另外，经全国烟草侵染性病害调查，烟草真菌性病害在中国已发现28种，约占全球已知烟草侵染性病害的47.5%，所造成的经济损失占烟草侵染性病害所致总损失的37. 8%，居各类病害之首。而且近年来烟草真菌性病害有加重趋势，严重影响烟草产质量和种烟收益。在当前烤烟生产上，病虫害的防治仍在很大程度上依赖于化学药剂，农药施用量过大、施用次数偏多，且多以高毒农药为主(特别是杀虫剂)，滥用农药现象严重，这给烤烟生产带来了不小的副作用，主要表现在以下几个方面增加生产成本；使病原菌发生生理小种变化或害虫产生抗药性，造成病害的大发生；破坏生态平衡，杀死天敌，降低天敌的自然控制作用；增加农药残留，降低烟叶安全性。因此，挖掘与烟草抗真菌病害有关的功能防卫基因，通过遗传工程修饰进行烟草抗病性改良，增强烟草对真菌性病害的防卫能力，以降低农药施用量，提高烟叶的安全性，对于烟草行业的可持续健康发展具有重要的理论和现实意义。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于对普通烟草类异黄酮还原酶(NtIRL)基因家族进行克隆并转化烟草进行功能分析，为优质烟草的基因工程育种提供新的策略和工具。为达到上述目的，本发明采用RACE技术，以普通烟草高烟碱品种龙里红花烟的根总RNA为材料，克隆了 NtIRL基因家族的全长cDNA和基因组序列，对其进行了系统的生物信息学分析，揭示了普通烟草中NtIRL基因家族的成员数，阐明了这些成员在普通烟草各个组织器官中的表达特征，构建了正义和反义植物表达载体，并通过遗传转化完成了功能分析。研究结果显示，普通烟草类NtIRL基因家族有NtIRLl和NtIRL2共2个成员，NtIRLl和NtIRL2的基因组序列分别为1946bp和2089bp，全长cDNA序列分别为1257bp和1261bp，在cDNA的79-101 Ibp处均有一个933bp的开放阅读框(ORF)，均编码由310个氨基酸组成的蛋白质。NtIRLl和NtIRL2的基因组序列、mRNA序列、编码区序列的一致性分别为84. 9%,95.1 %、96. 9%，编码区一致性远远高于非编码区，证明了编码区的保守性；编码蛋白序列的一致性和相似性分别为95. 5%和97. 4%，说明在氨基酸水平上也存在高度保守性。NCBI Blastn同源分析表明，NtIRLl的mRNA对应于已报道的NtA622mRNA (Genbank登录号D28505)，基因组序列对应于已报道的NsA622基因(Genbank登录号AB071165)，NtIRL2则为本发明新克隆。它们与来自大豆等植物的异黄酮还原酶(IFR)基因具有显著的同源性，与其它植物的苯基香豆满苄基醚还原酶(PCBER)基因有着一定的的同源性，与其它类型的还原酶也存在核心区段的同源性。尽管NtIRLl和NtIRL2的同源性很高，但二者在表达的时空特性上发生了明显的分化。NtIRLl在根中表达量最高，茎中有适当表达，蕾中有弱表达，在叶、花、蒴果和开花后20天的种子等器官中完全不表达；NtIRL2具有更强的组织特异性，在根中表达最强，在茎中有极弱的表达，在蕾、叶、花、蒴果和开花后20天的种子等器官中均不表达；NtIRL2在根中的转录水平明显高于NtIRLl。本发明采用SacI/BamHI双酶切定向克隆方式，分别将NtIRLl和NtIRL2基因组序列正向插入到植物表达载体pCambia2301G中，由CaMV35S启动子驱动，构建了 2个正义植物表达载体pNtIRLl和pNtIRL2 ;将NtIRLl和NtIRL2全长cDNA中的共保守片段NtIRLA反向插入到植物表达载体pCambia2301G中，由CaMV35S启动子驱动，构建了 I个NtIRL基因家族成员共抑制的反义植物表达载体pNtlRLA。将上述正义和反义植物表达载体分别转化农杆菌，获得了携带相应植物表达载体的农杆菌工程菌株，进一步利用农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草。结果显示，超量表达和抑制表达NtIRL基因的转基因烟草均未出现明显的外型变化，具有正常的植株形态和生长特征，烟叶颜色与未转基因烟株相比也无明显差别，但是，超量表达NtIRLl或NtIRL2的转基因株系的烟叶烟碱含量绝大多数较未转基因烟株有不同程度的提高，抑制表达NtIRL基因的转基因株系的烟叶烟碱含量均较未转基因烟株有不同程度的下降，而且转基因烟草叶片烟碱含量变化情况与NtIRL基因在根系中的表达丰度成正相关，说明NtIRLl和NtIRL2基因都能够编码有活性的烟碱合成相关酶，在烟草烟碱的生物合成代谢途径中有着重要作用。此外，转NtIRL基因植株通过烟碱积累的改变还影响了其抗病表现，超量表达NtIRLl或NtIRL2基因，烟碱含量增高，烟株抗黑胫病能力增强；抑制NtIRL基因的表达，烟碱含量降低，烟株抗立枯病能力减弱；说明烟草次生代谢物中的烟碱也是具有防御功能的植保素类物质，可以增强烟株抵抗真菌病害的能力。根据上述研究结果，本发明提出如下技术方案1.普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRL2的开放阅读框序列，如SEQ ID No. 10中第79-1011位核苷酸所示。2.普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRL2的全长cDNA序列，如SEQ ID No. 10所
/Jn ο3.普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRL2的基因组序列，如SEQ ID No. 12所示。4.含有NtIRL2基因开放阅读框序列或基因组序列的正义植物表达载体。进一步，所述正义植物表达载体是将SEQ ID No. 12所示的NtIRL2基因组序列正向插入载体pCambia2301G的BamHI和SacI多克隆位点之间，替换其中的gus基因而得；所述载体pCambia2301G是用HindIII和EcoRI双酶切从pBI 121质粒上切下gus基因表达盒，再将其连接到经同样双酶切的pCambia2301载体上而得。5.含有NtIRL基因家族成员共保守片段的反义植物表达载体，所述NtIRL基因家族成员为NtIRLl和NtIRL2 ;所述NtIRLl基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 9所示；所述NtIRL2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 10所示。进一步，所述反义植物表达载体是将NtIRL基因家族成员共保守片段NtIRLA反向插入载体pCambia2301G的BamHI和SacI多克隆位点之间，替换其中的gus基因而得；所述NtIRL基因家族成员共保守片段NtIRLA的核苷酸序列如SEQ ID No. 9中第1-1179位核苷酸所示；所述载体pCambia2301G是用HindIII和EcoRI双酶切从pBI121质粒上切下gus基因表达盒，再将其连接到经同样双酶切的pCambia2301载体上而得。6.含有上述正义植物表达载体的微生物转化体。7.含有上述反义植物表达载体的微生物转化体。8.普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRL2在普通烟草烟碱含量和抗真菌病害方面的分子育种中的应用。进一步，所述真菌病害为黑胫病和立枯病。
9.普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRLl在普通烟草烟碱含量和抗真菌病害方面的分子育种中的应用，所述NtIRLl基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 9所示，基因组序列如 SEQ ID No. 11 所示。进一步，所述真菌病害为黑胫病和立枯病。本发明的有益效果在于本发明对NtIRL基因家族进行了克隆，明确了 NtIRL基因家族的成员，发现了新基因Nt IRL2，对Nt IRL基因家族成员Nt IRLI和Nt IRL2进行了系统的生物信息学分析，阐明了这些成员在普通烟草各个组织器官中的表达特征，并构建正义和反义植物表达载体，通过遗传转化烟草证实了 NtIRL基因家族成员NtIRLl和NtIRL2都编码有活性的烟碱合成相关酶，在烟草烟碱的生物合成代谢途径中有着重要作用，并参与植株的抗真菌病害防御，从而为普通烟草烟碱含量和抗真菌病害方面的遗传工程修饰和分子育种提供了重要的靶基因，通过转基因手段进行NtIRL基因的分子调控有助于烟草烟碱修 饰和抗病性改良。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1为龙里红花烟的基因组DNA，其中I泳道为DNAMarker，2、3泳道为基因组DNA。图2为龙里红花烟的各器官总RNA，其中I泳道为DNA Marker, 2-8泳道依次为根、茎、叶、花、蕾、蒴果和开花后20天种子的总RNA。图3为龙里红花烟的总cDNA，其中I泳道为DNAMarker，2泳道为获得的总cDNA。图4为NtIRL基因家族的3丨cDNA末端扩增，其中I泳道为DNA Marker, 2、3泳道分别为3' cDNA末端的巢扩产物。图5为NtIRL基因家族3' cDNA末端单克隆的PCR检测，其中M泳道为DNAMarker，1-23泳道分别为3' cDNA末端单克隆。图6为NtIRL基因家族的5丨cDNA末端扩增，其中I泳道为DNA Marker, 2、3泳道分别为5' cDNA末端的一扩产物。图7为NtIRL基因家族V cDNA末端单克隆的PCR检测，其中I泳道为DNAMarker, 2-7泳道分别为5 ^ cDNA末端单克隆。图8为NtIRL基因家族的全长cDNA扩增，其中I泳道为DNAMarker，2、3泳道分别为PCR扩增产物。图9为NtIRL基因家族的全长基因组序列扩增，其中I泳道为DNA Marker, 2、3泳道分别为基因组序列PCR扩增产物。图10为NtIRLl基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列，其中起始密码子ATG和终止密码子TAG用粗体加下划线标记，内含子用灰色背景标记，可变转录起始位点和可变加尾位点用斜粗体加下划线标记，推测的加尾信号用波浪线标记，NADPH结合保守域GGTGYIG用边框标记，底物结合通用保守氨基酸残基K135用边框加灰色背景标记，预测的NmrA保守域19 T239用下划线标记。图11为NtIRL2基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列，其中起始密码子ATG和终止密码子TAG用粗体加下划线标记，内含子用灰色背景标记，可变转录起始位点和可变加尾位点用斜粗体加下划线标记，推测的加尾信号用波浪线标记，NADPH结合保守域GGTGYIG用边框标记，底物结合通用保守氨基酸残基K135用边框加灰色背景标记，预测的NmrA保守域19 T239用下划线标记。图12为NtIRL家族蛋白与其它植物PIP蛋白的序列多重比对，其中与NADPH结合的“GxxGxxG”保守结合域用方框标记，部分植物IFR蛋白和PLR蛋白的特异插入位点用下波浪线标记，一致性序列中推断与辅因子结合的氨基酸残基用阴影加方框标记，推断与底物结合的氨基酸残基用粗体加下划线标记。图13为NtIRL家族蛋白与其它植物PIP蛋白的系统发育树。图14为NtIRLl和NtIRL2蛋白的二级结构，其中长、中长、短和最短竖线分别代表α螺旋、延伸链、β转角和随机卷曲。图15为NtIRLl和NtIRL2蛋白的三级结构。图16为NtIRL基因家族成员数的鉴定，其中图A为探针标记结果，图B为酶切结果，图C为Southern blot杂交结果。图17为NtIRLl和NtIRL2基因在普通烟草各器官中表达的RT-PCR检测，其中Ro为根，St为莖，Le为叶，Fl为花，Bu为蕾，Ca为蒴果,20D为开花后20天的种子。图18为NtIRLl基因家族成员正义植物表达载体pNtIRLl和pNtIRL2的T-DNA元件图。图19为NtIRLl基因家族成员正义植物表达载体pNtIRLl和pNtIRL2的BamHI/SacI双酶切鉴定。图20为NtIRLl基因家族成员反义植物表达载体pNtlRLA的T-DNA元件图。图21为NtIRLl基因家族成员反义植物表达载体pNtlRLA的PCR鉴定。图22为NtIRLl基因家族成员反义植物表达载体pNtlRLA的SacI/BamHI双酶切鉴定。图23为NtIRLl基因家族成员正义和反义植物表达载体转化农杆菌后的菌液PCR检测。图24为采用农杆菌介导的叶盘法将NtIRL基因家族成员转化普通烟草，其中A为抗性芽的生长，B为抗性芽生根培养，C为水培炼苗，D为移栽转基因苗。 图25为转基因烟草植株的⑶S活性组织化学染色检测，其中A为红花大金元超量表达NtIRLl基因抗Kan单株根系⑶S染色，CK为未转化的烟草，其余为红花大金元转基因植株；B为红花大金元超量表达NtIRL2基因抗Kan单株根系⑶S染色，CK为未转化的烟草，其余为红花大金元转基因植株；C为大伏烟反义抑制抗Kan单株根系GUS染色，CK为未转化的烟草，其余为大伏烟转基因植株；D为龙里红花烟反义抑制抗Kan单株根系GUS染色，CK为未转化的烟草，其余为龙里红花烟转基因植株。图26为红花大金元超量表达NtIRLl基因抗Kan苗的PCR检测，其中M为DNA标准分子量DL2000，CK+为阳性对照(农杆菌工程菌株LBA4404-pNtIRLl菌液)，CK—为阴性对照烟株，I 15为随机挑选的红花大金元转基因植株。图27为红花大金元超量表达NtIRL2基因抗Kan苗的PCR检测，其中M为DNA标准分子量DL2000，CK+为阳性对照(农杆菌工程菌株LBA4404-pNtIRL2菌液)，CK—为阴性对照烟株，I 18为随机挑选的红花大金元转基因植株。
图28为大伏烟反义抑制抗Kan苗的PCR检测，其中M为DNA标准分子量DL2000，CK+为阳性对照(农杆菌工程菌株LBA4404-pNtIRLA菌液)，CK_为阴性对照烟株，I 22为随机挑选的大伏烟转基因植株。图29为龙里红花烟反义抑制抗Kan苗的PCR检测，其中M为DNA标准分子量DL2000, CK+为阳性对照(农杆菌工程菌株LBA4404-pNtIRLA菌液)，CK_为阴性对照烟株，I 22为随机挑选的龙里红花烟转基因植株。图30为红花大金元转NtIRLl基因植株中NtIRLl表达 的RT-PCR分析，其中M为DNA标准分子量DL2000，CK为阴性对照烟株，8和22为⑶S染色和PCR检测双阴性的转基因烟株，29为⑶S染色阴性但PCR检测阳性的转基因烟株，2、3、7、11、18、50、51、59、61和62为GUS染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。图31为红花大金元转NtIRL2基因植株中NtIRL2表达的RT-PCR分析，其中M为DNA标准分子量DL2000，CK为阴性对照烟株，40和76为⑶S染色和PCR检测双阴性的转基因烟株，75为⑶S染色阴性但PCR检测阳性的转基因烟株，28、34、42、44、49、51、60、62、70和79为GUS染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。图32为大伏烟反义抑制转基因植株中NtIRLl基因表达的RT-PCR分析，其中M为DNA标准分子量DL2000，CK为阴性对照烟株，20和37为⑶S染色和PCR检测双阴性的转基因烟株，86和93为⑶S染色阴性但PCR检测阳性的转基因烟株，1、8、13、40、70、74、78和80为GUS染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。图33为大伏烟反义抑制转基因植株中NtIRL2基因表达的RT-PCR分析，其中M为DNA标准分子量DL2000，CK为阴性对照烟株，20和37为⑶S染色和PCR检测双阴性的转基因烟株，86和93为⑶S染色阴性但PCR检测阳性的转基因烟株，1、8、13、40、70、74、78和80为GUS染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。图34为红花大金元转NtIRLl基因植株的Southern blot检测，其中CK为阴性对照烟株，8为GUS染色和PCR检测双阴性的转基因烟株，2、3、11、12、18、24、47、56和62为GUS染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。图35为大伏烟反义抑制转基因植株的Southern Blot检测，其中CK为阴性对照烟株，37为⑶S染色和PCR检测双阴性的转基因烟株，1、6、7、8、13、19、21、30和40为⑶S染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。图36为红花大金元转NtIRLl基因植株烟叶烟碱含量变化分析，其中CK为阴性对照，8为⑶S染色和PCR检测双阴性的转基因烟株；2 62 (除8)为⑶S染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。图37为红花大金元转NtIRL2基因植株烟叶烟碱含量变化分析，其中CK为阴性对照，40为⑶S染色和PCR检测双阴性的转基因烟株；I 82 (除40)为⑶S染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。图38为大伏烟反义抑制转基因植株烟叶烟碱含量变化分析，其中CK为阴性对照，37为⑶S染色和PCR检测双阴性的转基因烟株；1 95 (除37)为⑶S染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。图39为龙里红花烟反义抑制转基因植株烟叶烟碱含量变化分析，其中CK为阴性对照，I 30为⑶S染色和PCR检测双阳性的转基因烟株。
图40为红花大金元超量表达NtIRLl基因植株(左)与未转基因植株(右)的表型比较。图41为红花大金元超量表达NtIRL2基因植株(左)与未转基因植株(右)的表型比较。图42为大伏烟反义抑制转基因植株(左)与未转基因植株(右)的表型比较。图43为龙里红花烟反义抑制转基因植株(右)与未转基因植株(左)的表型比较。图44为红花大金元超量表达NtIRLl转基因植株的抗病性变化，其中I 6为红花大金元超量表达NtIRLl基因植株，7 11为阴性对照植株。图45为红花大金元超量表达NtIRL2转基因植株的抗病性变化，其中I 4为红 花大金元超量表达NtIRL2基因植株，5 7为阴性对照植株。图46为大伏烟反义抑制NtIRL基因家族成员转基因植株的抗病性变化，其中CKl、CK2和CK3为阴性对照植株，I 5为大伏烟反义抑制转基因植株。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的具体实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中使用的普通烟草中烟碱品种红花大金元，普通烟草高烟碱品种大伏烟和龙里红花烟由贵州省烟草科学研究院提供，田间常规种植。小量植物组织RNA抽提试剂盒、小量胶回收试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品。GeneRacer Kit为Invitrogen公司产品。LA Taq DNA聚合酶、pMD18_T载体为宝生物工程(大连)有限公司产品。PCRDIG Probe Synthesis Kit 为 Roche 公司产品。RNA PCR Kit Ver. 3. O 为 TaKaRa 公司产品。测序工作委托上海英竣生物工程技术服务有限公司完成。载体pCambia2301G由柴友荣构建(植物抗大丽轮枝菌受体类蛋白基因及甘露糖结合型凝集素基因的克隆与表达.西南农业大学，2003)，是用HindIII和EcoRI双酶切从pBI121质粒上切下其gus基因表达盒(3032bp)，回收后连接到经同样双酶切的pCambia2301载体上即得，其含有一个NPTII基因表达框和两个CaMV35S启动的植物表达框，一个表达⑶S基因，可实现Kan和⑶S活性的双标记筛选，另一个表达框中的gus基因可用来替换成目的基因，实现外源基因的表达。一、NtIRL基因家族克隆及分子特征1、基因组总DNA和总RNA的提取取龙里红花烟植株嫩叶，用CTAB法提取基因组总DNA。所得DNA进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，并稀释200倍后采用分光光度法测量0D26(1、0D28(1、0D23(i等值。结果显示，所得基因组总DNA完整性好，RNA消化较完全，纯度较高，可用于PCR扩增及Southern杂父。分别取龙里红花烟植株的根、茎、叶、蕾、花、蒴果和开花后20天的种子，用小量植物组织RNA抽提试剂盒提取各器官总RNA，并用DNase I去除其中含有的DNA。所得各器官总RNA经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测(图2)，质量好，特征条带清晰，无明显RNA降解，无DNA污染；经分光光度法检测，纯度较好，能够满足RACE操作及半定量RT-PCR检测的要求。
2、总cDNA的获得取龙里红花烟的根总RNA，用GeneRacer Kit去磷酸化和去mRNA帽子结构后，与寡核苷酸RNA Oligo连接，用GeneRacer Oligo dT引物进行反转录，获得第一链cDNA ;然后，以所得第一链cDNA为模板，用GeneRacer5’引物和GeneRacer3’引物，以LA Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，获得总cDNA。PCR程序为94°C预变性4min ;然后94°C变性lmin，68°C退火并延伸6min,共28个循环；最后72°C延伸lOmin。所得总cDNA经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，呈现出大小在200bp IOkb之间的拖带，重心区域在500bp 4kb之间，核心区域在1. 5kb左右，说明反转录完全，得到了高质量的总cDNA。3、NtIRL基因家族3' cDNA末端的克隆以龙里红花烟总cDNA为模板，用基因特异性引物NtIRL_31(SEQ ID No.1)和GeneRacer3’引物(SEQ ID No. 2)进行NtIRL基因家族:V RACE末端的一扩反应，PCR程序为94°C预变性4min ;然后94°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，共28个循环；最 后72°C延伸lOmin。然后，以一扩产物为模板，用基因特异性引物NtIRL_32 (SEQ ID No. 3)和GeneRacer3’巢式引物(SEQID No. 4)进行NtIRL基因家族3' RACE末端的巢式反应，PCR程序与一扩反应相同。巢扩产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测(图4)，扩出了一条大小约500bp的条带，与目的片段的预期长度相符。用小量胶回收试剂盒切胶回收目的片段，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，进行氨苄青霉素抗性和蓝白斑筛选。取多个白斑单克隆，进行插入片段的PCR检测(图5)，结果显示这些单克隆的插入片段存在一定的长度多态性。从PCR阳性单克隆中挑选一批具有长度多态性的代表性单克隆进行测序，对测得序列进行Blast分析，结果显示，这些插入片段与林烟草NsA622基因(GenBank登录号AB071165)的同源性最高，代表了 NtIRL基因家族的2条不同3' cDNA末端，长度分别为480bp和484bp (不计poly dA)，且每个基因都存在两种以上的可变性加尾位点。4、NtIRL基因家族5' cDNA末端的克隆以龙里红花烟总cDNA为模板，用GeneRacer5’弓丨物(SEQ ID No. 5)和基因特异性引物NtIRL-51 (SEQ ID No. 6)进行NtIRL基因家族5' RACE末端的一扩反应，PCR程序与3' RACE末端的一扩反应相同。一扩产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测(图6)，扩出了一条大小约500bp的条带，与目的片段的预期长度相符，因此无需进行巢扩反应。用小量胶回收试剂盒切胶回收目的片段，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，进行氨苄青霉素抗性和蓝白斑筛选。取多个白斑单克隆，进行插入片段的PCR检测(图7)，结果显示这些单克隆的插入片段长度一致，不存在多态性。选取PCR阳性单克隆进行测序，将测得序列去除5'末端人工接头序列后进行Blast分析，结果显示，这些插入片段与林烟草NsA622基因的同源性最高，代表了 NtIRL基因家族的2条不同5' cDNA末端，长度均为417bp (不计5'末端人工接头序列)。5、NtIRL基因家族全长cDNA的克隆根据上述NtIRL基因家族5' cDNA末端和3' cDNA末端的序列信息，设计正向引 FNtIRL (SEQ ID No. 7)和反向引物RNtIRL (SEQ ID No. 8)。以龙里红花烟第一链cDNA为
模板，用FNtIRL引物和RNtIRL引物，PCR扩增NtIRL基因家族全长cDNA。PCR程序为94°C预变性4min ;然后94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。所得PCR产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测(图8)，扩出了与预期大小相符的约1. 2kb的条带。用小量胶回收试剂盒切胶回收目的片段，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，进行氨苄青霉素抗性和蓝白斑筛选。取多个白斑单克隆进行测序，将测得序列与5' cDNA末端序列和3' cDNA末端序列进行多重比对，结果发现2条不同的全长cDNA序列，长度分别为1257bp和1261bp (不计poly dA)，分别命名为NtIRLl (SEQ IDNo.9)和 NtIRL2(SEQ ID No. 10)。6、NtIRL基因家族全长基因组序列的克隆以龙里红花烟的基因组总DNA为模板，用FNtIRL引物(SEQ ID No. 7)和RNtIRL引物(SEQ IDNo. 8) PCR扩增NtIRL基因家族全长基因组序列，PCR程序与全长cDNA扩增相同。所得PCR产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测(图9)，扩出了与预期大小相符的约1. 9kb的条带。用小量胶回收试剂盒切胶回收目的片段，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，进行氨苄青霉素抗性和蓝白斑筛选。取多个白斑单克隆进行测序，分析测得序列，结果发现2条不同的全长基因组序列，长度分别为1946bp和2089bp (不计poly dA)，分 别命名为 NtIRLl gene (SEQ IDNo. 11)和 NtIRL2 gene (SEQ ID No. 12) 序列比对表明，它们在外显子区与全长cDNA序列不一致。7、NtIRL基因家族及其推导的蛋白分子特征分析ORF的查找与翻译、分子量计算等在Vector NTI Advance 9. O上进行。GenbankBLAST和蛋白序列的Q)D搜索在NCBI (www. ncb1. nlm. nih. gov)上进行，推导的NtIRL蛋白的结构预测在冊w. expasy. org、www. softberry. com等网络提供的软件平台上进行。(I)NtIRLI和NtIRL2基因的核苷酸序列分析NtIRLl基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列如图10所示。NtIRLl基因组全长为1946bp，由4个内含子和5个外显子组成，除第2个内含子的剪切方式为GC/AG外，其它内含子均遵循标准的AG/GT…AG/AT剪切方式。NtIRLlcDNA全长为1257bp，在79-1011bp处有一个933bp的0RF，5'非编码区(5' UTR)为78bp，3'非编码区(3' UTR)为246bp。基因组序列的 dA、dG、dT、dC 含量分别为 32. 53%U6. 96%,32. 43%,18. 09% ；cDNA 序列的 dA、dG、dT、dC 含量分别为 30. 87%、19. 97%,29. 44%、19. 73%，符合低 dG+dC 含量的典型特征。ORF的dG+dC含量为41. 37%，5' UTR和:V UTR的dG+dC含量分别为39. 74%和33. 33%，内含子 1、2、3、4 的 dG+dC含量分别为 25. 11%,24. 55%,33. 01%,27. 41%，非编码区特别是3' UTR和4个内含子的dG+dC含量明显低于编码区。该基因在3’UTR中没有典型的poly㈧加尾信号AATAAA JSA177ciATAAT1775和A192tlATGAA1925可能是非典型的加尾信号。NtIRL2基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列如图11所示。NtIRL2基因组全长为2089bp，由4个内含子和5个外显子组成，除第2个内含子的剪切方式为GC/AG外，其它内含子均遵循标准的AG/GT…AG/AT剪切方式。NtIRL2cDNA全长为1261bp，在79-1011bp处有一个 933bp 的 0RF，5' UTR 为 78bp，3' UTR 为 250bp。基因组序列的 dA、dG、dT、dC含量分别为 32. 93%U6. 61%,33. 08%U7. 38%, cDNA 序列的 dA、dG、dT、dC 含量分别为32. 08%,19. 53%,29. 25 %、19. 14%，符合低 dG+dC 含量的典型特征。ORF 的 dG+dC 含量% 41. 16%,UTR 和 3' UTR 的 dG+dC 含量分别为 38. 46%和 31. 60%，内含子 1、2、3、4的dG+dC含量分别为22. 46%,26. 54%,30. 15%,27. 35%，非编码区特别是3，UTR和4个内含子的dG+dC含量明显低于编码区。该基因在3’UTR中没有典型的poly(A)加尾信号AATAAA，但A1910ATAAT1915和A2063ATGA A2068可能是非典型的加尾信号。
将NtIRL基因家族2个成员进行同源性比对，结果显示，NtIRLl和NtIRL2的基因组序列一致性为84. 9%，mRNA序列一致性为95. 1%，编码区一致性为96. 9%，编码区一致性远远高于非编码区，证明了编码区的保守性。对NtIRLl和NtIRL2的基因组序列和全长cDNA序列进行Blastn同源分析。结果见表1，它们与烟草属A622基因具有最高的同源性，NtIRLl的mRNA对应于已报道的NtA622mRNA，其基因组序列对应于已报道的NsA622基因，NtIRL2则为本发明新克隆；它们与来自大豆、欧洲白桦、西洋梨、苜蓿、鹰嘴豆、拟南芥、大麦、莲花、马铃薯、豌豆的IFR基因具有显著的同源性，与来自黑杨、铁杉、火炬松、连翘、北美白松的PCBER基因也具有较高的同源性，属于SDR基因家族PIP亚家族成员，很可能对烟草的次生代谢有重要影响，并参与植物的防御反应。表INtIRL基因与其它植物PIP家族成员的核苷酸序列同源分析
JmMfJlΖΓΓ7MllRUNifRa
GcnBank iJ__cDNA — 0RF cDNA"" ORF
MA622(D28505) _ ΜΨ.mlmvmii(X)% ~ I(X)fIf 96fc
NsA622(ABmilb5)__烟 ψ. Nivmiana sxtresuis__1(X)% 100% W:k 979
GmfFR(AFH)Iim__kGlycine max__ft 1.1% (、7.(y% 61.2Ψν 68.0%
%//^(AFi35I27) —丨函丨,.伽"卿冶" —鉍 j哫 59:2% --^:朽 Pr/F/ (AF071477) 一 ι^' ^ Pyrmammumis57.5% ~ 64.8% ' 58.8% 65.9%
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FiPCBEmAF24249i)__KlM Fvnyiltia iitH-1mniia 55.6% ~ 65.4 55.8% ~65.7%
PsPCREmDQ49\515)Pimis sirajyus46.73 63·' 47.2% 64.4%(2) NtIRLl和NtIRL2基因推导的蛋白氨基酸序列分析NtIRLl和NtIRL2基因都编码由310个氨基酸组成的蛋白质，理论分子量(Mw)分别为34. 652kDa和34. 650kDa，等电点(pi)分别为5. 58和5. 78。NtIRLl蛋白的氨基酸组成中，异亮氨酸的含量最高(9. 03%)，其次是亮氨酸(8. 71%)，含量最低的是半胱氨酸和色氨酸(均为O. 65%)。NtIRL2蛋白的氨基酸组成中，也是异亮氨酸的含量最高(9.03%)，其次是亮氨酸和赖氨酸(均为8. 39% )，含量最低的是半胱氨酸和色氨酸(均为O. 65% )。两个NtIRL蛋白中酸性氨基酸的数目(分别占氨基酸总数的12. 90%和12. 58% )均略多于碱性氨基酸(分别占氨基酸总数的11. 29%和10. 97% )，都为弱酸性蛋白。通过序列比对发现，NtIRLl和NtIRL2蛋白在氨基酸水平上有着很高的同源性，一致性和相似性分别高达95. 5%和97. 4%，说明蛋白水平存在高度保守性。NCBI BLASTp分析(表2)表明，NtIRLl和NtIRL2蛋白的氨基酸序列与烟草属A622蛋白的同源性最高，一致性均在95%以上；与来自西洋梨、大豆、欧洲白桦、拟南芥、马铃薯、大麦、莲花、苜蓿、鹰嘴豆、豌豆的IFR蛋白有着广泛的同源性，一致性分别为50% 66%和50% 67%，相似性分别为68% 80%和69% 81% ;与来自连翘、黑杨、铁杉、北美白松、大麻、火炬松的PCBER蛋白有着一定的同源性，一致性分别为58 % 63 %和59 % 64 %，相似性分别为75 % 79 %和77 % 79 %;与来自北美香柏的PLR蛋白有较低的同源性，一致性分别为47%和50%，相似性分别为66%和67% ;说明在进化系统中NtIRL与IFR的关系比PCBER和PLR更近。表2NtIRL蛋白与其它植物PIP蛋白的氨基酸序列同源分析
权利要求
1.普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRL2的开放阅读框序列，如SEQID No. 10中第79-1011位核苷酸所示。
2.普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRL2的全长cDNA序列，如SEQID No. 10所示。
3.普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRL2的基因组序列，如SEQID No. 12所示。
4.含有权利要求1或3所述序列的正义植物表达载体。
5.根据权利要求4所述的正义植物表达载体,其特征在于所述正义植物表达载体是将普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRL2的基因组序列正向插入载体pCambia2301G的BamHI和SacI多克隆位点之间，替换其中的gus基因而得；所述载体pCambia2301G是用HindIII和EcoRI双酶切从pBI121质粒上切下gus基因表达盒，再将其连接到经同样双酶切的pCambia2301载体上而得。
6.含有普通烟草类异黄酮还原酶基因家族成员共保守片段的反义植物表达载体，所述普通烟草类异黄酮还原酶基因家族成员为NtIRLl和NtIRL2 ;所述NtIRLl基因的全长cDNA序列如SEQ IDNo. 9所示；所述NtIRL2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 10所示。
7.根据权利要求6所述的反义植物表达载体，其特征在于所述反义植物表达载体是将普通烟草类异黄酮还原酶基因家族成员共保守片段NtIRLA反向插入载体pCambia2301G的BamHI和SacI多克隆位点之间，替换其中的gus基因而得；所述普通烟草类异黄酮还原酶基因家族成员共保守片段NtIRLA的核苷酸序列如SEQ ID No. 9中第1-1179位核苷酸所示；所述载体pCambia2301G是用HindIII和EcoRI双酶切从pBI121质粒上切下gus基因表达盒，再将其连接到经同样双酶切的pCambia2301载体上而得。
8.含有权利要求4或5所述正义植物表达载体或权利要求6所述反义植物表达载体的微生物转化体。
9.权利要求1至3任一项所述序列在普通烟草烟碱含量和抗真菌病害方面的分子育种中的应用。
10.普通烟草类异黄酮还原酶基因NtIRLl在普通烟草烟碱含量和抗真菌病害方面的分子育种中的应用，所述NtIRLl基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 9所示，基因组序列如SEQ ID No. 11 所示。
全文摘要
本发明公开了普通烟草类异黄酮还原酶(NtIRL)基因家族新成员NtIRL2，其开放阅读框序列如SEQ ID No.10中第79-1011位核苷酸所示，对NtIRL基因家族成员NtIRL1和NtIRL2进行了系统的生物信息学分析，阐明了NtIRL1和NtIRL2基因在普通烟草各个组织器官中的表达特征，构建了正义和反义植物表达载体，通过遗传转化证实NtIRL1和NtIRL2基因都编码有活性的烟碱合成相关酶，在烟草烟碱的生物合成代谢途径中有着重要作用，并参与烟株的抗真菌病害防御，可用于调节普通烟草的烟碱含量和抗病性改良，有助于低烟碱、高抗真菌病害优质烟草的基因工程育种。
文档编号C12N1/21GK103014029SQ201210584279
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者陈伟, 柴友荣, 李智勇, 潘文杰, 雷波, 王三根 申请人:贵州省烟草科学研究院