一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法及其专用载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的 方法及其专用载体。
【背景技术】
[0002] 自1983年世界上首例转基因烟草（Nicotianatabacum)在美国成功种植以来 (Zambryskitetal.，1983)，转基因作物种植面积持续增加。截止2014年，全球28个国家 转基因作物的种植面积为1. 815亿公顷，比2013年的1. 752亿公顷增加了 630万公顷，年增 长率为3%~4%。转基因作物的抗除草剂性状自1996年商业化种植以来对全球粮食、饲 料和纤维生产做出了巨大的贡献，2014年抗除草剂性状被单独或复合应用于玉米、水稻、棉 花、油菜、苜蓿、茄子、甜菜和白杨等主要粮食作物和经济作物（James，2015)。通过转基因技 术使农作物获得对除草剂的耐性，不仅克服了除草剂的选择性问题，使多灭生性广谱除草 剂得到广泛应用，而且更重要的是提高了除草剂效果，降低了除草成本。当前，中国的水稻、 玉米、大豆、小麦和油菜等作物杂草危害相当严重，而传统的选择性除草剂在使用过程中需 要增加施用量，且残留期长、容易影响后续作物的正常生长。因此，在中国开展抗除草剂转 基因育种具有巨大的市场需求。
[0003] 所有除草剂都是通过干扰与抑制植物生长发育过程中的代谢作用而造成杂草的 死亡，其中包括光合作用、细胞分裂、氨基酸、蛋白质及脂肪酸合成、激素合成、叶绿素及色 素合成等。除草剂草甘膦（glyphosate)特异性地抑制植物和细菌中芳香族氨基酸合成关 键酶的活性，即抑制植物和细菌中5-稀醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolypyruvylshiki mate-3-phosphatesynthase，EPSPS)的活性。当施用草甘膦时，进入植物体内的草甘膦分 子与磷酸烯醇丙酮酸竞争性地结合EPSPS的活性位点，终止了芳香族氨基酸的合成途径， 造成苯丙氨酸、络氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最终导致植物死亡。
[0004] 随着植物转基因技术的发展，研究人员可以利用多种转化方法将抗草甘膦基因转 化到植物体内，但通常只有部分细胞可以成为稳定的转化细胞。因此，一般在转化过程中使 用抗生素抗性基因等作为选择标记基因筛选转化细胞。在选择压力下，不含选择标记及其 产物的非转化细胞将死亡；转化细胞和组织则整合有选择标记基因而存在抗性，从而能够 继续成活并分化成植株。但是，选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品， 尽管目前的研究表明多数选择标记基因及其产物并未带来安全性隐患，但有些人仍会担心 这些基因存在于转基因植物中会带来影响环境和人类健康安全性的问题。如果培育出不含 选择标记基因的转基因植物，这个问题即会迎刃而解。总而言之，建立无选择标记植物抗草 甘膦的转基因水稻的培育方法具有重要的意义，不仅为培育抗逆、高产、优质的新品种提供 重要的材料基础，同时随着抗除草剂作物种植面积的扩大和市场效益的提高，必将进一步 推动新型除草剂的开发和利用。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是培育无选择标记抗除草剂转基因植物。
[0006] 为解决上述问题，本发明首先提供了 一种植物表达载体。
[0007] 本发明所提供的植物表达载体，包含区段甲和区段乙；
[0008] 所述区段甲依次可包括如下元件：T-DNA右边界、选择标记基因表达盒、T-DNA左 边界；
[0009] 所述区段乙依次可包括如下元件：T-DNA右边界、抗除草剂基因表达盒、T-DNA左 边界。
[0010] 所述区段甲中的T-DNA右边界和所述区段乙中的T-DNA右边界的核苷酸序列均可 如序列表中序列1自5'末端起第491至516位所示。
[0011] 所述区段甲中的T-DNA左边界和所述区段乙中的T-DNA左边界的核苷酸序列均可 如序列表中序列1自5'末端起第7182至7207位所示。
[0012] 所述区段乙依次可包括如下元件：所述T-DNA右边界、MAR序列甲、所述抗除草剂 基因表达盒、MAR序列乙和所述T-DNA左边界。
[0013] 所述MAR序列甲和所述MAR序列乙均可为核基质结合序列，置于外源表达结构的 两侧可提高外源基因表达的水平，或明显减少了外源基因在转基因植株间的表达差异。利 用MARs来稳定、提高外源基因的表达是克服外源基因失活的一种有效方法。
[0014] 所述植物表达载体中，所述选择标记基因表达盒和所述抗除草剂基因表达盒的方 向相反。
[0015] 所述选择标记基因表达盒的核苷酸序列的反向互补序列可如序列表中序列1自 5'末端起第13533至15604位所示。
[0016] 所述抗除草剂基因表达盒的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第1797 至5620位所示。
[0017] 所述除草剂可为草甘膦。
[0018] 所述抗除草剂基因具体可为EPSPS基因；
[0019] 所述EPSPS基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第3708至5351 位所示。
[0020] 所述区段甲的核苷酸序列的反向互补序列可如序列表中序列1自5'末端起第 13458至276位所示（序列表中序列1为环形质粒的序列，因此所述区段甲自上游至下游依 次由序列表中序列1自5'末端起第13458至15859位核苷酸和序列表中序列1自5'末端 起第1至276位所示核苷酸组成）。
[0021] 所述区段乙的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第491至7207位所示。
[0022] 所述植物表达载体具体可为环状质粒。
[0023] 所述植物表达载体的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。
[0024] 上述任一所述植物表达载体在培育无选择标记抗除草剂转基因植物中的应用也 属于本发明的保护范围。
[0025] 本发明还提供了一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法。
[0026] 本发明所提供的培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法，可包括bl)或b2):
[0027] bl)将上述任一所述植物表达载体转化受体植物，借助所述选择标记基因或其对 应的表型进行筛选，得到T。代植株；将所述T。代植株进行自交，得到含有所述抗除草剂基因 且不含有所述选择标记基因的?\代植株，即无选择标记抗除草剂转基因植株；
[0028] b2)将上述任一所述植物表达载体转化受体植物，借助条件甲和条件乙进行筛选， 得到T。代植株；将所述T。代植株进行自交，得到含有所述抗除草剂基因且不含有所述选择 标记基因的?\代植株，即无选择标记抗除草剂转基因植株；所述条件甲为所述选择标记基 因或其对应的表型；所述条件乙为所述抗除草剂基因或其对应的表型。
[0029] 上述方法中，用所述植物表达载体转化受体植物时，所述抗除草剂基因和所述选 择标记基因通常非连锁整合到受体植物的基因组中，所述具有选择标记基因表型的植株在 很大概率上也具有所述抗除草剂基因。同时具有抗除草剂基因和所述选择标记基因的植株 进行自交后，获得的后代中抗除草剂基因和选择标记基因发生分离，因此可以获得无选择 标记抗除草剂转基因植株。
[0030] 所述受体植物可为如下al)至a6)中的任一种：
[0031] al)双子叶植物；
[0032] a2)单子叶植物；
[0033] a3)水稻；
[0034] a4)籼稻；
[0035] a5)水稻品种明恢86 ;
[0036] a6)粳稻。
[0037] 所述除草剂可为草甘膦。
[0038] 所述抗除草剂基因具体可为EPSPS基因；
[0039] 所述EPSPS基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第3708至5351 位所示。
[0040] 所述选择标记基因可为潮霉素磷酸转移酶编码基因。
[0041] 所述潮霉素磷酸转移酶编码基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起 第13777至14799位所示。
[0042] 实验证明，利用本发明提供的方法，可筛选出无选择标记的转基因后代，获得无选 择标记的转基因水稻的比率为42. 39% ;与野生型水稻幼苗相比，利用本发明提供的方法培 育的无选择标记的转基因水稻对草甘膦有明显的抗性。可见，随着抗除草剂作物种植面积 的扩大和市场效益的提高，本发明提供的方法将进一步推动新型除草剂的开发和利用。
【附图说明】
[0043] 图1为植物表达载体pDTepsps-hyg的结构示意图。
[0044] 图2为水稻的遗传转化。
[0045] 图3为T。代转基因水稻植株的PCR分析电泳图。
[0046] 图4为T。代转基因水稻植株的hpt基因和印sps基因连锁情况的电泳图。
[0047] 图5为?\代转基因水稻植株的PCR分析电泳图。
[0048] 图6为Τ2代转基因水稻植株的草甘膦抗性分析。
【具体实施方式】
[0049] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0050] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0051] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052] 籼稻品种明恢86记载于如下文献中：苏军等.农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定 转化体系的建立。福建农业学报，2003，18 (4)，209-213.公众可从中国科学院遗传与发育生 物学研究所获得。籼稻品种明恢86以下简称为明恢86或野生型水稻。
[0053] YEB液体培养基：将牛肉浸膏5g、酵母膏lg、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgS04*7H20 0.04g 溶于1L去离子水，用10M NaOH水溶液调节pH至7. 2,高温高压灭菌20min。
[0054] 诱导培养基：将50XN6大量母液20mL、100XB5微量母液10mL、200XMS铁盐母 液5mL、1000 XB5有机母液lmL、水解酪蛋