重组人成纤维细胞生长因子-17的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及重组人成纤维细胞生长因子-17的生产方 法。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞生长因子（FibroblastGrowthFactor,FGF)是一类广泛存在于多种 组织中的多肽细胞生长因子，目前已发现23个成员，分子量为16kD~34kD，其中心区域含 有高度同源性（30%~70% )的大约120个氨基酸序列，对来源于中胚层和神经外胚层的 多种类型细胞具有广泛的生物学活性。FGFs在体内含量甚微但分布广泛，各个因子调控着 一系列的发育过程，包括脑的发育、肢体的分化和躯干的形成。大多数FGFs成员与胚胎发 育、组织损伤修复、肿瘤的发生、发展和转移等等有密切关系，具有可观的应用价值。
[0003]FGF-17属FGF8亚家族（FGF8、FGF17、FGF18)，与其他FGF成员一样，均属于旁分 泌因子，而在前列腺癌和肝癌中，FGF17还以自分泌方式参与其中。在胚胎发育过程中的组 织和器官形成中起重要作用。1998年，日本科学家MasamitsuHoshikawa等人从大鼠胚胎 中分离得到一种能够编码含有216个氨基酸的FGF17的cDNA，利用转染了含cDNA的杆状 病毒的HighFive昆虫细胞有效得到了大鼠FGF17蛋白。科学家发现FGF17mRAN在大鼠胚 胎脑组织峡部及隔膜的神经上皮优先表达。说明FGF17对于胚胎脑组织发育至关重要。人 FGF17有两种亚型，FGF17a和b，b为主要形式，本实验中要表达的人FGF17也就是FGF17b。 人FGF17基因定位于染色体8p21. 3,共有3个外显子，6个突变位点，由216个氨基酸组成， 与其他已发现的家族成员之间具有30%~70%的同源性，人FGF-17与老鼠的氨基酸序列 具有93%的高度同源性。人FGF17分子量约为25kD，而本次实验设计中切除了信号肽，只 获取成熟蛋白部分序列，最终蛋白分子量为22. 6kD，等电点10. 43,为碱性蛋白。结构上， FGF17与FGF8、FGF18相似，属同一家族成员，其同源性分别为60%和50%，均具有信号肽 序列，采用大肠杆菌表达时需将其切除。
[0004]FGF17对脑组织神经系统正常发育意义重大。FGF17是脑组织结构正常发育的 关键因子，其表达和同家族的FGF8出现部分重叠，两者在MHB区域（mid-hindbrain，中后 脑）和皮质层扮演重要角色。Cholfin等研究发现FGF17是小鼠额叶皮层分区的重要参 与部分，敲除FGF17会导致背侧额叶皮层缩小以及额叶皮层投射到皮层下靶部位程度的 减少JingsongXu等以FGF17敲除小鼠为模型发现无论是出生后两天的幼鼠还是成年小 鼠，在解剖学上无异常且呈现健康状态，而经过组织学检测却发现其中脑尾端、下丘脑和 小脑蝴部出现显著的组织缺失现象，即发育异常。（Hoshikawaetal.BiochemBiophys ResCommun. 1998, 244:187 - 191；Maruokaetal.MechDev,1998,74 (1-2):175 - 177 ； Reifersetal.MechDev, 2000, 99(1-2) :39 - 49；Cholfinetal.ProcNatlAcadSciU SA, 2007, 104(18):7652 - 7657；XuJetal.Development, 2000, 127(9):1833-1843 ；)
[0005]FGF17在研究神经精神性疾病方面具有潜在价值。针对这点，要涉及FGF17于染 色体上的位置。2009年的一篇报道综述了染色体8p为神经精神病学易感位点，与神经 精神性紊乱（精神分裂症、自闭症）、神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森）、卡尔曼 综合征等密切联系；8p21-23是脑胼胝体发育不全的关键位点，后者和认知缺陷、抽搐、自 闭症以及精神分裂症密切相关。FGF17基因位于染色体8p21. 3,从而对于研究上述病症 意义重大。Zanni等人经过研究案例来探讨FGF17与小脑发育和疾病的关系，该案例中， 患者伴有严重的生长发育迟缓、癫痫以及DWM(Dandy-Walkermalformation，第四脑室 孔闭塞综合征，也称非交通性脑积水）症状，检测发现患者体内染色体8p21. 2-p21. 3距 始端2. 3Mb处有缺失现象，也即FGF17基因有所缺损，而分析患者的血液淋巴细胞和皮肤 成纤维细胞发现FGF17表达水平明显降低，这是关于人类小脑畸形与FGF17基因转录下 调的首次报道；Scearce-Levie等研究发现FGF17 /小鼠社会行为出现异常，表现为幼鼠 发声减少，成年鼠社会互动缺陷，并发现在人体中，FGF17信号通路的干扰可能会导致一 系列神经精神类疾病，比如精神分裂症和自闭症，而这些异常行为可能由于FGF17缺失的 额叶皮层结构中Fos基因的激活减少所致，然而相关的神经循环和信号通路机制依然所 知甚少，需待进一步探究。目前对于神经精神方面的疾病治疗仍有不足和很大的空间，从 而对于涉及在内的FGF17基因的研究具有很大的前景。（Tabar6s_Seisdedosetal.Mol Psychiatry. 2009, 14(6):563-589；Pauletal.NatRevNeurosci, 2007, 8(4):287-299 ； Zannietal.Neurogenetics, 2011, 12(3):241-245 ；Scearce-Levieetal.GenesBrain Behav, 2008, 7(3):344-354)
[0006]FGF17在骨骼方面的研究具有重要价值。可能与FGF17作用于受体FGFR3有 关。FGFR3在骨骼发育中起重要作用，是软骨细胞中主要表达的受体，其激活突变会导致 一系列骨骼发育缺陷性疾病，如软骨发育不全（ACH)、季肋发育不全（HCH)和致死性骨发 育不全（TD)，持续性活化骨细胞中FGFR3会导致侏儒症。KrejciP等人利用免疫组化方 法检测到在正常人类生长板软骨中有FGF17蛋白的表达，且水平和FGF19 -致，随后在细 胞增殖实验中发现FGF17与FGF1同等水平抑制RCS(大鼠软骨瘤软骨细胞）的软骨细胞 增殖，随着FGF17浓度加大，抑制作用愈明显。低浓度时，FGF17通过与肝素联用显著抑制 RCS增殖，而单独的FGF17抑制效果不明显，检测发现FGF17能够诱使ERK信号通路磷酸 化。从而可知FGF17参与激活软骨细胞中FGFR3信号通路，诱使ERK磷酸化，抑制软骨瘤细 胞的生长，而要想达到显著抑制作用需要有肝素的配合使用。（Passos-Buenoetal.Hum Mutat, 1999, 14(2) :115-125；Naskietal.Front.Biosci, 1998, 3:d781-794；Naskiet al.NatGenet, 1996, 13(2) :233-237；Shiangetal.Cell, 1994, 78 (2) : 335-342；Krejci etal.PediatrRes, 2007, 61 (3) : 267-272.)
[0007]FGF17对于肿瘤发生、发展和转移的影响。和其他成纤维细胞生长因子一样，FGF17 也是一种潜在的致癌因子。FGF17主要通过与细胞表面的酪氨酸激酶受体FGFR3c、FGFR4、 FGFR2c和FGFRlc发生特异性结合（FGFR3c>FGFR4>FGFR2c>FGFRlc)，通过MAPK途径引发 DNA合成以及促进细胞增殖，且在促进DNA合成时，FGF17诱导有丝分裂的活性是FGF8的两 倍JingsongXu等人将携带有FGF17a和FGF17b(人FGF17的主要表达形式）基因的载体 转入NIH3T3细胞中，一个星期之后，含有FGF17b的细胞40%出现肿瘤化，两个星期之后， 所有细胞全部形成肿瘤，而含有FGF17a的细胞依然成正常状态；Polnaszek和Heer等人均 检测FGF17在前列腺癌细胞中出现过表达，尤其DU145细胞系中FGF17表达水平较高，Heer 等还发现在高度分化的前列腺癌细胞中FGF17mRNA以4倍于BPH(良性前列腺增生）的水 平上调。Polnaszek等从根治性前列腺切除手术标本的癌细胞中检测到癌细胞和正常上皮 细胞中均有类似水平的FGF17的表达（由于癌细胞密度大，所以总体而言，FGF17在肿瘤 组织浓度偏高），表达量相对于FGF7偏低（FGF7为28ng/g，FGF17为0. 4~0. 5ng/g);关 于乳腺癌，目前依然没有足够的证据证明FGF17在乳腺癌细胞中有表达，不过Meijer等人 在三苯氧胺治疗乳腺癌中发现组织中的受体FGFR4与其配体FGF17的信号传导造成了三苯 氧胺抵抗，这一通路的发现对于内分泌治疗乳腺癌无效的患者进行靶向治疗提供了指导价 值。Gauglhofer等人研究人肝癌细胞（HCC，!fepG2andΗ印3B)发现包括FGF17在内的FGF8 家族的表达出现上调，而此现象可能与wnt通路下调有关。当饥饿或添加模拟低氧药物甲 磺酸去铁胺进行肝癌细胞培养时，发现FGF8家族的表达显著增加，饥饿培养的肝癌细胞， 在添加了FGF8亚家族因子后，细胞凋亡减少，而这个与ERK1/2和核糖体蛋白S6的磷酸化 有关，研究发现无血清时，pERK和pS6下调，pGSK3β上调，细胞存活减弱，当添加FGF17后， pERK上调，肝癌细胞增多。目前已知FGF17与肿瘤密切相关，因此将其作为肿瘤诊断和治 疗的靶分子具有广阔的前景。（ZhangXeta.JBiolChem, 2006, 281 (23) : 15694 - 15700 ; Murrayetal.CurrCancerDrugTargets, 2009, 9(5):639 - 651；Reifersetal.Mech Dev,2000,99(1 - 2):39 - 49；XuJetal.MechDev,1999, 83(1-2):165-78；Polnaszek etal.Prostate, 2004, 60(1) :18-24；Heeretal.JPathol,2004, 204(5):578-586 ； Meijeretal.MolCancerRes, 2006, 4(6):379-86；Gauglhoferetal.Hepatolo gy, 2011, 53(3) :854-864.)
[0008] 由于FGF-17对于脑组织、神经系统、骨骼及肿瘤等方面有着重要意义，其研究和 临床应用前景广阔，