烟草ATP synthase内参基因的克隆方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及烟草基因表达过程中所需的一种内参 基因ATPsynthase。
【背景技术】
[0002] 烟草(NicotianatabacumL.)为前科烟草属，含有尼古丁(Nicotine)的叶用一年 生作物。人类使用烟草大约有1500年的历史，作为烟草工业的重要原料，将叶片采收后经过 调制、分级、加工处理，制成卷烟、雪茄烟、斗烟、嚼烟及鼻烟等，供人嗜用。烟草是经典的基 因工程研究模式作物之一，然而，在分析烟草基因表达过程中可供选择的内参基因并不多 见。目前，文献中报道较多的有GAPDH、EF-la，而在其他植物中广泛使用的内参基因，在烟草 中并未得到明确的克隆和验证。同时，由于内参基因的选择存在不通用性，即不同物种间的 内参基因存在差异性。这就要求在烟草中使用其他植物中的内参基因，要根据实验要求开 展必要的稳定性评价与鉴定。随着基因芯片技术越来越成熟，大量的基因芯片数据为新内 参基因的挖掘提供了良好的数据基础和平台，为内参基因的选择提供了更为广阔的空间。 与传统同源性比对方法所获的内参基因相比较，通过基因芯片表达技术筛选到的内参具有 高量表达和稳定表达的特性。
[0003] 实时焚光定量PCR(real-timequantitativereversetranscriptionPCR， qRT-PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总 量的方法。利用qRT-PCR分析基因表达水平是现在分子生物学中重要的研究手段，qRT-PCR 具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点。在qRT-PCR中，对目标基因相对表达量的分析是 通过内参基因的均一化来确定。因此，内参基因的选择是qRT-PCR的关键步骤。一个理想的 内参基因应该是在不同发育阶段和不同组织器官中稳定表达，且表达量不受其他外界因 素、实验处理条件的影响。迄今为止，尚未发现特别理想的内参基因。因此，研究者必须结合 各自的实验条件和样品类型来选择合适的内参基因。
[0004] ATPsynthase是植物细胞能量合成中关键的一个酶，在植物细胞生物学代谢过程 中扮演一个基本的重要角色，ATPsynthase基因在植物不同组织器官以及不同生长阶段的 高量、稳定表达对植物的生命活动有着重要的意义。ATPsynthase基因在动物中作为内参 基因的研究较多，而在植物中鲜有相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明提供烟草ATPsynthase基因序列，可作为烟草内参基因的应用。并同时提 供克隆烟草ATPsynthase基因的特异性引物，建立基于SYBRGreen荧光染料技术的qRT-PCR方法，从而作为烟草ATPsynthase的内参基因，为利用实时荧光定量PCR对烟草基因表 达分析的研究提供有用的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种烟草ATPsynthase基因序列的克隆方法，通过对烟草不同生长发育时期的99个不 同组织样本的芯片表达数据分析，筛选出在所有样品中稳定表达的变异系数(coefficient ofvariation，CV)较小的组成型ATPsynthase基因序列，以引物对ATPsynthase-F/ATP synthase-R进行PCR扩增、获得阳性克隆，后经质粒测序验证；其中引物序列如SEQID N0.1/SEQIDN0.2K*。
[0007] 所获得的目的片段如SEQIDNO.3,大小为681bp。
[0008] 所述PCR扩增的反应程序如下：94°C预变性4min，94°C变性30s，58°C退火30s， 72°C延伸2min，共25个循环，再72°C终延伸10min，4°C保存。
[0009] 本发明还提供一种qRT-PCR扩增ATPsynthase基因部分序列的方法，以ATP synthase的基因序列为基础，按照qRT-PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物。 以烟草不同生长发育时期、不同组织器官以及不同激素处理条件下的20个样本的cDNA为模 板，利用半定量PCR评估ATPsynthase基因表达水平的稳定性和可靠性之后，进一步进行实 时荧光定量PCR扩增，荧光染料为SYBRGreen，其中qRT-PCR的定量引物，其序列如SEQID N0.4/SEQIDN0.5K*。
[0010] 所述的qRT-PCR扩增反应程序如下：在95°C预变性10min，先运行40个循环再95°C 变性15s，60°C退火30s，然后为检测PCR扩增基因的特异性，在PCR反应之后运用溶解曲 线，扩增温度以〇.5°C的增幅从65°C缓慢递增到95°C，每个增幅的时间为5s。
[0011] 本发明的有益效果在于： 1. 本发明首次克隆到烟草ATPsynthase基因，其稳定性和特异性经由半定量PCR和实 时荧光定量PCR检测和验证； 2.ATPsynthase基因不仅在烟草不同组织器官、不同生长发育阶段的组织中稳定表 达，而且能够在各种激素处理条件下亦稳定表达。ATPsynthase基因稳定表达的特性，为 烟草不同发育阶段、不同组织器官、不同激素处理相关基因表达的定量研究提供了新的高 可信度的内参基因； 3. 经实验验证，本发明所设计的用于荧光定量PCR检测的引物亦可用于半定量PCR快速 检测，且扩增特异性和稳定性良好。
【附图说明】
[0012]图1:本发明中烟草ATPsynthase基因扩增的1%琼脂糖凝胶电泳图； 其中：]\C%BM2000Marker，l为烟草ATPsynthase基因； 图2:本发明的ATPsynthase基因在烟草不同生长发育阶段、不同组织器官中PCR扩增 的1%琼脂糖凝胶电泳图； 图3:本发明的ATPsynthase基因在烟草不同激素处理条件PCR扩增的1%琼脂糖凝胶电 泳图； 图4:本发明中ATPsynthase基因实时荧光定量PCR扩增曲线图； 图5:本发明中ATPsynthase基因实时荧光定量PCR扩增的溶解曲线图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
[0014]实施例1.烟草ATP synthase基因的克隆 1.1烟草总RNA提取： 取约100mg烟草新鲜组织，在液氮中迅速研磨成粉末，加入相应量BB6(每lmLBB6，加10μ L0-疏基乙醇，现用现配），祸旋剧烈振荡混勾；室温孵育3min后，12000g离心2-5min，小心 吸取离心管中的上清至RNase-free的离心管中；向上清中加入0.5倍体积无水乙醇，并祸旋 彻底混匀，分散沉淀，再将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，以12000g离心30s，弃掉流 出液后，加500ULCB6，室温12000g离心30s，弃掉流出液；向离心柱中央加入80yL的DNasel 工作液，室温放置15min，重复该步骤一次，以除去基因组DNA;加500灿WB6，12000g离心 30s，弃掉流出液;再12000g离心2min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟，彻底晾干 离心柱后，加50yLRNase-freeH2O在离心柱的中央，室温静置lmin，12000g离心2min，洗脱 RNA。将luL原始样品稀释10倍或100倍后，取5nL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整 性检测。并取lyLRNA用微量紫外分光光度计(NanoDrop2000)测定RNA样品的纯度和浓度值。 将合格样品置于_8〇°C保存待用。
[0015] 1.2PCR扩增引物序列 ATP synthase的上游引物如SEQ ID NO. 1所示；ATP synthase的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
[0016]根据基因芯片表达分析所得到的在不同生长发育时期组织样本中稳定表达、且变 异系数较小的ATPsynthase基因，用Primer5.0软件设计该扩增引物，最后由北京六合华 大基因科技股份有限公司合成。
[0017] 1.3 反转录(RT) 以烟草总RNA为模板，在25uL的反转录体系设置和反应过程中依次加入以下试剂:2.0ygRNA，1.5yL01igo(dT)Primer(20ymol/L)，再加RNase-freeH2O至 14yL;70°C温浴6min 后，迅速将离心管放入冰浴中，再依次加入5.0仙的M-MLV5XBuffer，1.0yL的M-MLV逆转 录酶，l.OyL的RNaseinhibitor和4.0yLdNTPMixture，混勾后，42°C温育75min，加水稀 释5倍后，-20°C保存。
[0018] 1.4聚合酶链式反应(PCR) 以步骤1.3得到的cDNA为模板，以步骤1.2中获得的序列为引物进行PCR扩增。PCR采用 以下25μ1反应体系：50ng